Summary
Fluorescently लेबल भोजी मार्करों के समय चूक माइक्रोस्कोपी उच्च अस्थायी समाधान के साथ गतिशील भोजी प्रतिक्रिया की निगरानी की अनुमति देता है. 3 अलग अलग रंगों के संयोजन में विशिष्ट भोजी और organelle मार्कर का उपयोग करना, हम एक मजबूत स्थानिक और लौकिक संदर्भ में autophagosome गठन के लिए एक प्रोटीन के योगदान का पालन कर सकते हैं.
Abstract
भोजी विशेष रूप से पोषक तत्वों, एमिनो एसिड के अभाव की कमी से चालू होने वाले एक सेलुलर प्रतिक्रिया है. भोजी कोशिका द्रव्य, लंबे समय रहते प्रोटीन और भी प्रोटीन समुच्चय, दोषपूर्ण organelles है, और वायरस या बैक्टीरिया पृथक कि autophagosomes बुलाया डबल झिल्ली संरचनाओं के गठन, द्वारा परिभाषित किया गया है. Autophagosomes अंततः उत्पादन पोषक तत्वों कोशिका द्रव्य को वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है, उनकी सामग्री के थोक गिरावट के लिए अग्रणी लाइसोसोम के साथ फ्यूज. इसलिए, भोजी सेल homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है, और भोजी की अनियंत्रण रोग, सबसे विशेष रूप से neurodegeneration, उम्र बढ़ने और कैंसर को जन्म दे सकता है.
Autophagosome गठन कोशिकाओं कोर भोजी मशीनरी नामक प्रोटीन की एक विशिष्ट समूह, आवंटित की है, जिसके लिए एक बहुत विस्तृत प्रक्रिया है. कोर भोजी मशीनरी कार्यात्मक, विविध सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल अतिरिक्त प्रोटीन से पूरित membran में जैसे हैmitochondrial और लाइसोसोमल जीव विज्ञान में ई तस्करी,. Autophagosomes के गठन और गिरावट के लिए इन प्रोटीनों का समन्वय भोजी की अत्यधिक गतिशील और परिष्कृत प्रतिक्रिया का गठन किया. लाइव सेल इमेजिंग एक एक एकल autophagosome गठन घटना के स्तर पर प्रत्येक भोजी से संबंधित प्रोटीन की आणविक योगदान नीचे का पालन करने की अनुमति देता है और वास्तविक समय में है, इसलिए इस तकनीक का एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है.
यहाँ हम हमारे विश्लेषण के लिए एक स्थानिक और लौकिक संदर्भ स्थापित करने के लिए, स्थिरतापूर्वक GFP-DFCP1 व्यक्त एक सेल लाइन का उपयोग करें. Autophagosomes गठन के लिए अग्रणी अग्रदूत संरचनाओं हैं जो DFCP1 निशान omegasomes,. ब्याज (POI) के एक प्रोटीन एक लाल या सियान फ्लोरोसेंट टैग किसी के साथ चिह्नित किया जा सकता है. माइटोकांड्रिया और लाइसोसोम ईआर तरह अलग organelles,,, सभी autophagosome गठन के विभिन्न चरणों में शामिल किया जाता है, और एक विशेष नजर रखने डाई का उपयोग कर के रूप में चिह्नित किया जा सकता है. Autop के समय चूक माइक्रोस्कोपीइस प्रयोगात्मक सेट अप में hagy, सूचना चौथे आयाम, यानी समय के बारे में निकाला जा सकता है. इसलिए हम अंतरिक्ष और समय में भोजी को POI के योगदान का पालन कर सकते हैं.
Introduction
भोजी 1-3 autophagosome गठन के अंतिम परिणाम के लिए प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के समन्वय की आवश्यकता है जो एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है. माइक्रोस्कोपी शायद सबसे अधिक भोजी 4 के अध्ययन के लिए लागू किया जाता तकनीक है. सबसे भोजी प्रोटीन का स्थानीयकरण बड़े पैमाने पर दोनों अंतर्जात प्रोटीन इम्युनो धुंधला करके और fluorescently टैग एक्सोजेनस प्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा, निर्धारित कक्षों में अध्ययन किया गया है. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), अकेले और इम्युनो सोने की लेबलिंग, के साथ संयोजन में इन संरचनाओं 5,6 के ठीक विवरण का वर्णन किया गया है. समय - इन तकनीकों अंतरिक्ष के 3 आयामों में autophagosome गठन के बारे में हमारी समझ की स्थापना की है कि इस तथ्य के बावजूद, वे 4 वें आयाम के बारे में जानकारी के लिए पर्याप्त राशि उपलब्ध कराने में नाकाम रहे हैं. यह possi के रूप में बंद के रूप में एक autophagosome के गठन के बाद की अनुमति देता है के रूप में लाइव सेल इमेजिंग इस बाधा पर काबूवास्तविक समय 7 से ble. यह तकनीक पहले Yoshimori और उनके सहयोगियों ने 8 से भोजी अध्ययन करने के लिए नियुक्त किया गया था, और तेजी से आगे से इस्तेमाल किया गया है.
समय चूक माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं में POI का और समय की अवधि में स्थानीयकरण कब्जा. एक अच्छी तरह से विशेषता भोजी और / या organelle मार्कर के साथ इस जानकारी की तुलना करके, जीना सेल इमेजिंग विश्लेषण autophagosome गठन का अधिक से अधिक स्थानिक और लौकिक संदर्भ में POI को रख सकते हैं. लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण autophagosome गठन के सभी चरणों के साथ POI के स्थानीयकरण का दोहराव कैप्चरिंग पर आधारित है, तय कोशिकाओं की इमेजिंग एक भी कब्जा पर आधारित है, जबकि. तय कोशिकाओं की इमेजिंग केवल उनके lifecy के विभिन्न चरणों में एक साथ कब्जा कर कई autophagosomes में इसकी औसत स्थानीयकरण पर आधारित POI की भूमिका ग्रहण कर सकते हैं, जबकि इसलिए, जीना सेल इमेजिंग, autophagosome गठन के विशिष्ट चरणों में POI के योगदान को साबित कर सकते हैंcle.
जीना सेल इमेजिंग उच्च विश्लेषणात्मक शक्ति की एक विधि है, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जो कुछ निहित सीमाओं है. सबसे पहले, जीना सेल इमेजिंग एक या एक से अधिक एक्सोजेनस fluorescently लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है. फ्लोरोसेंट टैग आकार में बड़े हो जाते हैं और वे कभी कभी steric कारणों की वजह से एक प्रोटीन के व्यवहार को बदल सकते हैं. वे झिल्ली के 2 आयाम के सीमित स्थान में कार्य की आवश्यकता के रूप में यह स्थिति, झिल्ली प्रोटीन के लिए बढ़ रहा है. ध्यान से, autophagosomes झिल्लीदार संरचनाओं हैं, और उसके अनुसार अपने गठन झिल्ली से जुड़े प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है.
समस्याओं का एक और सेट POI की अभिव्यक्ति के स्तर से जुड़ा है. सिद्धांत रूप में, एक exogenous प्रोटीन अंतर्जात प्रोटीन के लिए तुलनीय स्तर पर व्यक्त की जानी चाहिए. यह अपने उप सेलुलर स्थानीयकरण की महत्वपूर्ण नियामकों संतृप्त नहीं किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है, और वेंई विश्लेषण जैविक प्रासंगिक हो जाएगा. वे अंतर्जात स्तर से ऊपर व्यक्त कर रहे हैं, जब वे भोजी प्रतिक्रिया 9 को बाधित करते हैं इसके अलावा, भोजी प्रोटीन की overexpression, बचा जाना चाहिए. इसके विपरीत, POI की अभिव्यक्ति के स्तर के बाद से तस्वीर विरंजन के बिना समय का एक अच्छा अवधि के लिए अपनी स्थानीयकरण निम्नलिखित अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च किया जाना चाहिए, एक समझौते पर पहुंच जाना है. Mammalians कोशिकाओं में एक exogenous प्रोटीन का इष्टतम अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के ठीक ट्यूनिंग की बहुत आवश्यकता है, लेकिन यह स्थिरतापूर्वक POI के विभिन्न स्तरों व्यक्त सेल लाइनों की स्थापना और स्क्रीनिंग के द्वारा संभव है.
मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि स्थानिक संकल्प एक और सीमित कारक है. संकल्प कारणों की एक संख्या के लिए सीमित किया जा सकता है, लेकिन सबसे अच्छे रूप में, पार्श्व संकल्प 250 एनएम के आसपास होगी. यह इस से छोटी एक दूरी से अलग किसी भी वस्तु (या किसी भी रूप में जुड़ा हुआ दिखाई देगा कि इसका मतलबवस्तु) और 250 एनएम से छोटी वस्तुओं वे वास्तव में कर रहे हैं से भी बड़ा छवि में प्रतिनिधित्व किया जाएगा. इसलिए छवियों हमेशा मन में इस के साथ व्याख्या की जानी चाहिए और इस तरह के ईएम के रूप में पूरक तकनीकों ठीक अल्ट्रा संरचनात्मक विस्तार से हल करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
अंत में, जीना सेल इमेजिंग स्वाभाविक समय की एक लम्बी अवधि के लिए संभावित, प्रकाश के लिए एक सेल को प्रकाश में लाने की आवश्यकता है. यह एक सेल, फोटो विषाक्तता के रूप में जाना जाता घटना की शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बदल सकता है.
हम सफलतापूर्वक autophagosomes ईआर किस्में 10,11 के साथ निकट सहयोग में हैं जो PI3P युक्त अंगूठी संरचनाओं की तरह करार दिया omegasomes, कि आरंभ से पहली बार के लिए का वर्णन करने के PI3P बाध्यकारी प्रोटीन DFCP1 का जीना सेल इमेजिंग का इस्तेमाल किया है. हम स्पष्ट रूप से LC3 पॉजिटिव संरचनाओं omegasomes के साथ निकट सहयोग में बनाने शुरू कर दिखाया है. हम यहाँ एक सेल लाइन को रोजगार स्थिरतापूर्वक जीवित कोशिका के लिए GFP-DFCP1 व्यक्त करने का सुझाव है किब्याज की प्रोटीन की इमेजिंग, autophagosome गठन में अपनी भूमिका के लक्षण वर्णन के लिए एक मजबूत स्थानिक और लौकिक फ्रेम स्थापित करता है.
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Protocol
1. सेल तैयार
- (2 के बाद 80% की एक confluency के लिए उद्देश्य 30-40% की एक confluency करने, Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) में रातोंरात संस्कृति कोशिकाओं, HEK-293T कोशिकाओं का बीज कम बीतने संख्या स्थिरतापूर्वक 22 मिमी दौर coverslips पर GFP-DFCP1 व्यक्त दिन - लाइव सेल इमेजिंग के दिन).
2. सेल अभिकर्मक
- मैं सीरम मध्यम, 3 μl एक्स tremeGENE 9 डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक, और pECFP-LC3 प्लास्मिड डीएनए की 0.5 ग्राम कम 100 μl OptiMEM युक्त, एक थाली के लिए अभिकर्मक जटिल मिश्रण तैयार करें. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिक्स और कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं. [ध्यान दें: हम बार बार इस तरह के 2000 Lipofectamine के रूप में अन्य अभिकर्मक अभिकर्मकों, विषाक्तता के एक बहुत है कि मिल गया है, और, के अलावा, वे कई माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ हस्तक्षेप जो अपने दम पर फ्लोरोसेंट कणों का उत्पादन.]
- प्लेटों से मध्यम Aspirate और ताजा DMEM पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस जोड़
- ट्रॅन जोड़ें24 घंटे के लिए सेते कोशिकाओं, pipetting द्वारा कोशिकाओं को जटिल sfection.
3. Organelle मार्कर (वैकल्पिक) के साथ सेल ऊष्मायन
- 75 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता में DMEM के लिए Mitotracker / lysotracker जोड़ें, और प्रकाश जोखिम और दोहराव ठंड और विगलन चक्र से बचने के लिए, पूरे प्रयोगात्मक दिन के साथ, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बाज़ ट्यूब में, बर्फ पर रहते हैं.
- Mitotracker / lysotracker युक्त मध्यम 2 मिलीलीटर की एक विभाज्य निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से aspirate मध्यम और Mitotracker / 30 के लिए मध्यम और सेते कोशिकाओं युक्त lysotracker साथ जगह - 60 मिनट.
4. लाइव सेल इमेजिंग के लिए ऊष्मायन चैंबर की तैयारी (चित्रा 1)
- स्वच्छ धातु और 75% इथेनॉल और धातु O-अंगूठी के रिम पर सिलिकॉन तेल लागू साथ O-अंगूठी प्लास्टिक की.
- संदंश थाली से coverslip को हटाने और coverslip के नीचे की तरफ से मध्यम से अधिक सूखी प्रयोग,इस रूप में, तेल के साथ बहुत ज्यादा मध्यम मिश्रण से बचने के रिसाव की संभावना में वृद्धि होगी.
- एक बंद कक्ष बनाने के क्रम में, बीच में sandwiched coverslip साथ, प्लास्टिक O-अंगूठी के कगार पर आराम और प्लास्टिक O-अंगूठी के शीर्ष पर धातु O-अंगूठी फिट करने के लिए coverslip के लिए छोड़ दें.
- थाली से मध्यम के साथ शीर्ष चैम्बर, DMEM के बाइकार्बोनेट बफर सिस्टम कृत्रिम सीओ 2 एकाग्रता की आवश्यकता के रूप में इस बिंदु से और पर, उत्पन्न करने के लिए पीएच में परिवर्तन को रोकने के लिए, एक बफरिंग एजेंट बिना DMEM मध्यम में कोशिकाओं की लंबी ऊष्मायन से बचने 5-10% की और परिवेश हवा के सीओ 2 एकाग्रता बहुत कम है.
5. प्रकोष्ठों की भुखमरी
- खुर्दबीन मंच पर ऊष्मायन चैम्बर रखो.
- पूरा मध्यम Aspirate और भुखमरी मध्यम 2 मिलीलीटर 3 बार से धो लें, कोई अमीनो एसिड अंततः भोजी प्रतिक्रिया रोकना होगा जो DMEM, से बनी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, सेटपर टाइमर.
6. माइक्रोस्कोपी
- जीवित कोशिका व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति के लिए विन्यस्त एक उपयुक्त इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता होगी. यह आमतौर पर एक शोध ग्रेड उलटा माइक्रोस्कोप फ्रेम, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस) / ब्याज की डाई (एस), एक उच्च गुणवत्ता के उद्देश्य लेंस, एक संवेदनशील सीसीडी / sCMOS के लिए विशिष्ट एक गहन व्यापक स्पेक्ट्रम प्रकाश स्रोत, दर्पण और फिल्टर शामिल होंगे कैमरा और एक ऊष्मायन चैम्बर. (सभी प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं जीना सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त पूरा व्यापक क्षेत्र प्रणाली प्रदान करते हैं, लेकिन यह निर्माताओं की एक किस्म से घटकों का उपयोग कर एक प्रणाली घर का निर्माण भी करने के लिए संभव है और इस तरह माइक्रो प्रबंधक के रूप में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इसे नियंत्रित : एचटीटीपी / / valelab.ucsf.edu / ~ एम एम / MMwiki / ). हमारी राय में सबसे महत्वपूर्ण पहलू फ्लोरोसेंट पत्रकारों की अभिव्यक्ति के स्तर को कम से कम रखा जा सकता है कि इतनी अधिक संवेदनशीलता की एक प्रणाली का उपयोग करने के लिए है.
- Selछवि के लिए उपयुक्त कोशिकाओं ecting.
- अधिक autophagosome गठन घटनाओं पर कब्जा कर लिया जा करने की अनुमति देगा कि बड़े और फ्लैट कक्षों का चयन करें. इसके अलावा, पहले से ही omegasomes की एक बड़ी संख्या का उत्पादन शुरू कर दिया है कि कोशिकाओं के लिए चुनते हैं.
- वीडियो प्रति autophagosome गठन की घटनाओं का एक बड़ा अनुपात पर कब्जा करने के क्रम में, 30 मिनट के बाद या अच्छी तरह से भोजी प्रतिक्रिया में वीडियो पर कब्जा शुरू करो.
- इमेजिंग.
- एक उच्च बढ़ाई लेंस (100x 1.4 एनए) का प्रयोग करें.
- तस्वीर विरंजन रोकने के लिए अधिकतम की 10-20% तक उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें.
- 100-500 मिसे जोखिम, 2x2 binning और 100 हासिल करने के लिए कैमरा (हमामात्सू ORCA ईआर, पिक्सेल आकार 6.45 माइक्रोन) निर्धारित करें.
- छवि अधिग्रहण दर 1 फ्रेम हर 10 सेकंड पर सेट करें.
7. ImageJ के साथ autophagosome गठन घटनाक्रम के montages बनाने
[यह सिर्फ ई के लिए मर्ज किए गए वीडियो स्कैनिंग द्वारा एक गैर व्यवस्थित तरीके से किया जा सकता हैब्याज के झरोखों, लेकिन नीचे उल्लिखित के रूप में यह भी व्यवस्थित किया जा सकता है.]
- 3 (या 2) के लिए खुला छवि के ढेर ImageJ / फिजी में चैनलों पर कब्जा कर लिया.
- इसी चैनल के लिए हरे, लाल और नीले रंग के इस lut (लुकअप तालिकाएँ) लागू करें, 3 रंगों के विलय और बचाने के लिए.
- विश्लेषण टैब से, उपकरण> रॉय प्रबंधक का चयन करें ... > निर्दिष्ट करें, तो ढेर की पहली छवि में परिभाषित आकार की एक यादृच्छिक क्षेत्र का चयन करें.
- छवि टैब से, ढेर के चयनित क्षेत्र नकल करने के क्रम में, नकल का चयन करें.
- छवि टैब से, ढेर चयन> असेंबल करें ... जिसमें एक अस्थायी असेंबल बनाने के लिए सभी फ्रेम पर कब्जा कर लिया. एक पूरा autophagosome गठन घटना के लिए असेंबल में सभी फ्रेम स्कैन, घटना के पहले और अंतिम फ्रेम के नोट रखने.
- विश्लेषण टैब से, उपकरण> रॉय प्रबंधक का चयन करें ... अन्य 2 रंग के लिए ढेर की पहली छवि में और साथ ही विलय रंग छवि के लिए एक ही क्षेत्र का चयन करें और ढेर नकली.
- टी सेवह टैब फाइल, नई> छवि का चयन करें, और ऊंचाई के लिए सेट रॉय प्रबंधक का उपयोग शुरू में चयनित पिक्सल की संख्या के अनुसार चौड़ाई के लिए सेट 4 बार रॉय प्रबंधक में निर्धारित ऊंचाई से अधिक 3 रंग और बीच में अंतरिक्ष के लिए 3 पिक्सल प्रत्येक ढेर में फ्रेम की संख्या के रूप में मिला दिया, और सेट स्लाइसें.
- छवि टैब से, चयन के ढेर> उपकरण> डालें ..., तो बीच में 1 पिक्सेल की जगह छोड़कर, दूसरे के शीर्ष पर प्रत्येक उप ढेर एक सम्मिलित करें.
- छवि टैब से, ढेर चयन> असेंबल करें ... एक असेंबल शुरू करने और कब्जा कर लिया autophagosome गठन घटना के पहले और अंतिम फ्रेम के साथ पूरा बनाने के लिए.
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Representative Results
प्रोटोकॉल वर्णित में, हम स्थिरतापूर्वक भोजी उत्प्रेरण परिस्थितियों में, GFP टैग DFCP1 व्यक्त एक सेल लाइन में पाकिस्तानी टैग LC3 का स्थानीयकरण पालन करने के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया है. इस प्रयोग के परिणाम 2 श्रृंखला या GFP-DFCP1 और पाकिस्तानी-LC3 के लिए इसी छवियों, हरे रंग से एक और नीले चैनल से एक है, के ढेर का कब्जा है. हम आगे के रूप में प्रोटोकॉल खंड में वर्णित एक autophagosome गठन घटनाओं, के लिए इसी montages बनाने के क्रम में, ImageJ का उपयोग इन वीडियो का विश्लेषण किया है. यह विश्लेषण हमें एक LC3 पॉजिटिव autophagosome एक DFCP1 पॉजिटिव omegasome से निकलती है कि साबित करने के लिए अनुमति दी. चित्रा 2 में दिखाया असेंबल में एक omegasome के गठन के लिए एक छोटी सी जगह के रूप में, दूसरे फ्रेम से स्पष्ट हो जाता है. omegasome विशेषता अंगूठी जैसी संरचना फार्म के क्रम में विस्तार शुरू होता है, और 6 मिनट बाद इसकी अधिकतम व्यास तक पहुँचता है. अगला, omegasome ग शुरू होता हैलगभग 10 मिनट के बाद, ollapsing और अंत में यह गायब हो जाता है. अब omegasome गठन के संदर्भ में LC3 पॉजिटिव संरचना या autophagosome के गठन लाना, हम autophagosome omegasome के बाद दिखाई देता है, और लगभग 15 मिनट के बाद स्पष्ट रूप से दिखाई हो जाता है कि निरीक्षण करते हैं. autophagosome omegasome, पहले स्थान पर और फिर रिंग के साथ निकट सहयोग में विस्तार शुरू होता है, और omegasome autophagosome कलियों बंद गिर शुरू होता है. आखिरकार autophagosome omegasome गायब हो जाता है के बाद जाहिरा तौर पर, लाइसोसोम साथ फ्यूज करने के पीछे रहता है. इस विश्लेषण जो LC3 सकारात्मक autophagosomes इसी omegasomes से उत्पन्न के अनुसार, 2 संरचनाओं के बीच कार्यात्मक संबंध के बारे में एक स्पष्ट संकेत देता है.
एक अन्य उदाहरण में, हम लाइसोसोम साथ बनाने autophagosome के अस्थायी और स्थानिक संघ (चित्रा 3 पर कब्जा करने के क्रम में एक lysosome नजर रखने को शामिल किया है
हालांकि, विश्लेषण का एक ही तरह के कई कारणों की वजह से uninterpretable परिणाम, उत्पादन कर सकते हैं. चित्रा 4 में प्रस्तुत उदाहरण में, परिणाम uninterpretable ध्यान में बहाव के कारण बन जाते हैं. वीडियो सफलतापूर्वक एक autophagosome के गठन पर कब्जा शुरू होता है, लेकिन ध्यान देने में एक बहाव 3 मिनट के निशान के बाद होता है. वीडियो पर कब्जा अगले 6 मिनट के लिए ध्यान से बाहर जारी है, लेकिन अंत में ध्यान केंद्रित मैन्युअल 9 से 10 मिनट के निशान के बाद ठीक किया है. इस विश्लेषण हालांकि, ध्यान से सही है जब autophagosome गठन घटना पर कब्जा कर लिया है कि क्या भेदभाव करने के लिए असंभव बना देता हैलगभग पूरा हो गया है जो प्रारंभिक घटना, या ध्यान में बहाव के बाद शुरू कर दिया है कि एक नया एक.
अतिरिक्त समस्याओं संवर्धित कोशिकाओं की confluency के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं इष्टतम confluency से अधिक में बड़े हो रहे हैं, वे काफी चुनौतीपूर्ण ध्यान केंद्रित करता है जो एक बगल सेल, के शीर्ष पर विस्तार करने के लिए मजबूर कर रहे हैं. इसके अलावा, उच्च confluency में बड़े हो रहे हैं कि कोशिकाओं भुखमरी की दीक्षा से पहले पृष्ठभूमि भोजी गतिविधि के स्तर को बढ़ाने पर बल दिया हो जाते हैं.
अंत में, प्रतिदीप्ति से संबंधित समस्याओं बहुत आम हैं. पाकिस्तानी GFP की तुलना में कमजोर प्रतिदीप्ति गतिविधि है, और अक्सर वीडियो कैप्चरिंग के बाद के चरणों में फोटो प्रक्षालित हो जाता है. इस तरह के वीडियो का विश्लेषण बनाने autophagosomes साथ POI के स्थानिक संघ के बारे में झूठी नकारात्मक निष्कर्ष तक ले सकते हैं. हालांकि, इन समस्याओं ऐसे mTurquise2 रूप संस्करणों में से एक का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. एक अन्य आम phenomenoएन लाल टैग की प्रतिदीप्ति लाइसोसोम के निचले पीएच पर बुझती नहीं है कि इस तथ्य से उपजा है. Autophagosomes अंततः लाइसोसोम के साथ फ्यूज, जबकि कई भोजी प्रोटीन physiologically, लाइसोसोम में अपने जीवन चक्र खत्म. इसके अलावा, गैर कार्यात्मक प्रोटीन अक्सर लाइसोसोम में गिरावट के लिए लक्षित कर रहे हैं. इसलिए, एक के बजाय एक लाल टैग POI और omegasomes के बीच की एक वास्तविक शारीरिक संघ के लाइसोसोम साथ autophagosomes की गैर संबंधित संघ के बाद खत्म हो सकता है.
चित्रा 1. ऊष्मायन चैम्बर. प्लास्टिक O-अंगूठी धातु O-अंगूठी के रिम के आसपास बैठता है और नीचे में अंदर की ओर फैली हुई है जो एक पतली कगार है. coverslip के प्लास्टिक O-अंगूठी के कगार पर रखा गया है, और फिर प्लास्टिक O-अंगूठी धातु O-अंगूठी के निचले भाग में फिट है. इस तरह, coverslip के रेत हैएक बंद कक्ष बनाने, 2 O-छल्ले के बीच wiched.
चित्रा 2. GFP-DFCP1 और पाकिस्तानी-LC3 व्यक्त कोशिकाओं 30 मिनट के लिए भूखे हैं और 1 फ्रेम हर 10 सेकंड की दर से imaged थे. एक प्रतिनिधि autophagosome गठन घटना के एक असेंबल प्रस्तुत किया है. हरे और नीले चैनलों से सिग्नल छद्म रंग हरा और तदनुसार लाल कर रहे हैं. तीर पहला प्रत्यक्ष omegasome और autophagosome संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
फाईgure 3. GFP-DFCP1 और पाकिस्तानी-LC3 व्यक्त कोशिकाओं, lysotracker लाल के साथ incubated 30 मिनट के लिए भूखे हैं और 1 फ्रेम हर 15 सेकंड की दर से imaged थे. एक प्रतिनिधि autophagosome गठन घटना के एक असेंबल प्रस्तुत किया है. हरे, लाल और नीले चैनलों से सिग्नल छद्म रंग, हरे नीले और लाल तदनुसार हैं. तीर पहला प्रत्यक्ष omegasome और autophagosome संकेत मिलता है. Arrowhead लाइसोसोम साथ autophagosome संलयन के पहले कब्जा इंगित करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
4 चित्रा. GFP-DFCP1 और पाकिस्तानी-LC3 व्यक्त कोशिकाओं 30 मिनट के लिए भूखे हैं और 1 फ्रेम हर 10 सेकंड की दर से imaged थे. उप ओ का एक उदाहरण के एक असेंबल ptimal कब्जा प्रस्तुत किया है. हरे और नीले चैनलों से सिग्नल छद्म रंग हरा और तदनुसार लाल कर रहे हैं. तीर पहला प्रत्यक्ष omegasome और autophagosome संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
वीडियो 1. चित्रा 2 में प्रस्तुत autophagosome गठन घटना का वीडियो. प्लेबैक दर प्रति सेकंड 4 फ्रेम है. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
वीडियो 2. चित्रा 3 में प्रस्तुत autophagosome गठन घटना का वीडियो. तीर, omegasome के गठन, और दूसरा, लाइसोसोम साथ autophagosome का विलय पहले इंगित करता है. प्लेबैक दर प्रति सेकंड 4 फ्रेम है."> फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.
वीडियो 3. चित्रा 4 में प्रस्तुत autophagosome गठन घटना का वीडियो. प्लेबैक दर प्रति सेकंड 4 फ्रेम है. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
तालिका 1. इसी प्रदाता और सूची संख्या के साथ, प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की सूची.
बैकअप
| बफर | रचना | खेतों में कदम |
| भुखमरी मध्यम | 20 मिमी HEPES पीएच 7.4 | 5.2 |
| 140 मिमी NaCl | ||
| 1 मिमी 2 CaCl | ||
| 1 मिमी 2 MgCl | ||
| 5 मिमी ग्लूकोज | ||
| 1% बीएसए |
तालिका 2. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया बफ़र्स की सूची. इस्तेमाल किया बफ़र्स, उनकी संरचना और वे प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, जिस पर पहला कदम सूचीबद्ध हैं.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि autophagosome गठन के दौरान एक प्रोटीन के स्थानीयकरण के दृश्य की अनुमति देता है. हम घटनाओं डिस्क confocal और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी कताई, बिंदु स्कैनिंग confocal सहित वर्णित दृश्यमान करने के विभिन्न तरीकों की कोशिश की है. हम सामान्य उद्देश्यों के लिए मानक व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति संवेदनशीलता और संकल्प के बीच सबसे अच्छा समझौता प्रदान करता है कि मिल गया है. यह शोर, न्यूनतम photo-bleaching/photo-toxicity और तेजी से अधिग्रहण करने के लिए अच्छा संकेत यह सुनिश्चित करता है. सेल का उचित क्षेत्रों सेल फैला है और फ्लैट है जहां परिधि यानी छवि को चुना जाता है अगर ऑप्टिकल सेक्शनिंग की कमी एक मुद्दा नहीं है. हालांकि, यह प्रयोग किया इमेजिंग प्रणाली को उचित (प्रयुक्त हार्डवेयर और सिस्टम सेटिंग्स के मामले में दोनों) विन्यस्त है कि महत्वपूर्ण है.
सबसे अच्छा स्थानिक संकल्प के लिए, यह एक उच्च वृद्धि, ज का उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैigh संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन लेंस (पानी विसर्जन लेंस coverslip करने के लिए करीब निकटता में कोई लाभ नहीं इमेजिंग की पेशकश करेगा). यह संकेत करने वाली शोर को अधिकतम और विरंजन कम करने के लिए रोशनी की तीव्रता (तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ जैसे), कैमरा सेटिंग्स (जोखिम समय, binning और लाभ) को संतुलित करने का सुझाव दिया है. इस अनुभव से किया जा होगा, लेकिन एक गाइड के रूप में, एक 100x 1.4 एनए लेंस का उपयोग करते समय हम आम तौर पर अधिकतम की 10-20% करने के लिए हमारे उत्तेजना प्रकाश की शक्ति को कम करने और कैमरा (हमामात्सू ORCA ईआर, पिक्सेल आकार 6.45 माइक्रोन) सेट 100-500 मिसे जोखिम, 2x2 binning और 100 हासिल करने के लिए.
छवि अधिग्रहण दर 1 फ्रेम हर 1-10 सेकंड की सीमा में स्थापित किया जाना चाहिए. उच्च फ्रेम दर पर छवियों को प्राप्त छवियों (बेहतर अस्थायी समाधान) के बीच बेहतर निरंतरता सुनिश्चित करेगा लेकिन अधिक प्रकाश करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने और इस प्रकार photo-bleaching/photo-toxicity वृद्धि होगी.
इमेजिंग अधिक fluorescenc हैंई चैनलों, यह चैनल कब्जा बीच विलंब (तेजी से फिल्टर परिवर्तकों फिट, समय जोखिम को कम) कम से कम है कि यह सुनिश्चित किया जाना है. यह संयुक्त छवि में दिखने गति कलाकृतियों की संभावना कम हो जाएगा. गति कलाकृतियों एक छवि अलगानेवाला (एक कैमरे का उपयोग कर दो प्रतिदीप्ति चैनलों का एक साथ अधिग्रहण की सुविधा के लिए एक उपकरण) या एक दोहरी कैमरा अनुकूलक का उपयोग पर विचार से बचने के लिए मुश्किल साबित हो रहे हैं.
इमेजिंग नीले चैनल ग्रीन चैनल के लिए नीले रंग की रोशनी के पार के उत्सर्जन को रोकने के लिए उपयुक्त फिल्टर और दर्पण के चयन की आवश्यकता है. हम सफलतापूर्वक तरंगदैर्ध्य, बैंडविड्थ और तीव्रता के विशिष्ट चयन को सक्षम करने, विचित्र वी प्रकाशक तक का उपयोग करता है और इसलिए बहुत लचीला है, जो एक ओलिंप CellR माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया है. हालांकि, प्रकाश स्रोत हम फिट है इस कारण (बहु) में bandpass उत्तेजना फिल्टर कुछ सफेद प्रकाश चयनित wavelengths.For के अलावा के माध्यम से आने के साथ 'टपका' हैक्यूब्स, इसलिए उत्तेजना प्रकाश की छानने के अतिरिक्त है. दर्पण / फिल्टर के निम्नलिखित संयोजन (सभी Semrock) का इस्तेमाल किया गया था. एक्साइटर FF01-479-585, Emitter FF02-525/40 (GFP) के और FF01-607/36 (mCherry), dichroic दर्पण FF505/606-Di01: GFP और mCherry लिए. एक्साइटर FF01-416/501, Emitter FF01-523/610, dichroic दर्पण FF440/520-Di01: पाकिस्तानी के लिए. हम भी ग्रीन चैनल के लिए नीले रंग प्रतिदीप्ति के पार उत्सर्जन के साथ, उप इष्टतम परिणाम दिया है जो एक अलग CellR माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया है. इस माइक्रोस्कोप एक सफेद प्रकाश स्रोत का उपयोग करता है और उत्तेजना wavelengths.This तरंगदैर्ध्य चयन पहिया में 8 फिल्टर तक सीमित है इसका मतलब है कि चयन करने के लिए एक तेजी से फिल्टर पहिया है, लेकिन तीव्रता को विनियमित करने के लिए एक अलग पहिया है. दर्पण / फिल्टर के निम्नलिखित संयोजन इस्तेमाल किया गया था. एक्साइटर FF01-470/40, Emitter FF02-525/50, dichroic दर्पण FF495-Di02: GFP (Semrock) के लिए. एक्साइटर FF01-427/10 (रवांडा, Semrock) 572/23 (mCherry, क्रोमा), Emitter FF01-472/30 (: पाकिस्तानी और mCherry लिएरवांडा, Semrock) 632/60 (mCherry, क्रोमा), dichroic दर्पण 89006bs (क्रोमा).
अन्य इमेजिंग तकनीक की तुलना में इस तकनीक का महत्व दो गुना है: सबसे पहले, यह जीवित कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन का स्थानीयकरण, और दूसरा कब्जा कर सकते हैं, यह समय के चौथे आयाम जोड़ने निकाले जानकारी बढ़ा सकते हैं. हालांकि, एक्सोजेनस प्रोटीन के साथ के रूप में mislocalization की संभावना है, या तो हमेशा वृद्धि की अभिव्यक्ति के स्तर की वजह से या टैगिंग की वजह से नहीं है, इसलिए जीना सेल इमेजिंग, क्रम में निर्धारित कक्षों में अंतर्जात POI के इम्युनो धुंधला के साथ जोड़ा जाना चाहिए परिणामों की पुष्टि करने के लिए . अंत में, यह है कि जीना सेल इमेजिंग विश्लेषण के स्थानिक संकल्प को बढ़ाने के क्रम में, इम्युनो ईएम के साथ जोड़ा जा सकता है टिप्पण सार्थक है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हमारा काम जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है. हमारा अनुरोध है कि पाकिस्तानी-LC3 की अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड के साथ हमें आपूर्ति के लिए प्रोफेसर Tamotsu Yoshimori धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
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