Summary
Trypsin पचाने रेटिना वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है. यह पांडुलिपि वाहिकाओं के समग्र वास्तुकला जबकि संरक्षण तकनीक का अनुकूलन और गैर संवहनी ऊतक को हटाने के लिए कुंजी परिवर्तन सहित, विस्तार में विधि का वर्णन करता है.
Abstract
Trypsin पचाने रेटिना वाहिका 1-5 विश्लेषण करने के लिए सोने के मानक तरीका है. यह रेटिना के गैर संवहनी घटक के पाचन के बाद परस्पर संवहनी चैनलों की एक दो आयामी फ्लैट माउंट बनाकर जटिल तीन आयामी रेटिनल रक्त वाहिकाओं और capillaries के पूरे नेटवर्क के दृश्य की अनुमति देता है. यह एक ऐसी microaneurysms के रूप में विभिन्न वैकृत संवहनी परिवर्तन, केशिका अध: पतन, और pericyte अनुपात को असामान्य एन्दोथेलिअल अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, विधि जो क्योंकि आनुवंशिक जोड़तोड़ 6,7 में आसानी से रेटिना अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपलब्ध पशु मॉडल बन गए हैं, विशेष रूप से चूहों में, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. माउस आंख में, यह रेटिना की रक्त वाहिकाओं के समग्र वास्तुकला को बनाए रखते हुए पूरी तरह से गैर संवहनी घटकों को दूर करने के लिए विशेष रूप से कठिन है. तिथि करने के लिए, विस्तार से trypsin पचाने तकनीक का वर्णन करता है कि साहित्य की कमी नहीं है मैंमाउस n. भी मुश्किल कदम समस्या निवारण पर सुझाव प्रदान करते हुए यह पांडुलिपि, माउस रेटिना में trypsin पचाने की एक विस्तृत कदम दर कदम पद्धति प्रदान करता है.
Introduction
रेटिना की वाहिका Visualizing ऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में विभिन्न नेत्र रोगों के तंत्र को काटना एक अत्यंत महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है. यह एक microaneurysms, केशिका अध: पतन, और pericyte नुकसान 8,9 सहित जल्द से जल्द संवहनी असामान्यताएं, का आकलन करने के लिए अनुमति देता है. तिथि करने के लिए, रेटिना वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए विकसित कई तकनीकों की गई है. विभिन्न रंगों का छिड़काव जहाजों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन सभी समान सीमाओं को साझा किया है. जहाजों 1 rupturing और हानिकारक जोखिम जो एक उच्च दबाव में दिया है जब तक कि इंजेक्शन शायद ही कभी पूरे रेटिना वाहिका संरचना पर प्रकाश डाला गया. फ्लोरोफोरे लेबल जी बी 4 isolectin (; I21413, Invitrogen, संयुग्मित एलेक्सा Fluor 594 1:100 कमजोर पड़ने) के साथ संवहनी endothelium के immunostaining और रेटिना फ्लैट आरोह वाहिकाओं के समग्र वास्तुकला पर प्रकाश डाला, लेकिन केशिकाओं का विस्तृत दृश्य, तहखाने झिल्ली और pericytes बिना कर सकते हैं . यह द्वारा नोट किया गया थाजहाजों आवधिक एसिड-Schiff (पीए) या hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला 10 के साथ रेटिना के फ्लैट आरोह को धुंधला से प्रकाश डाला जा सकता है कि Friedenwald. हालांकि, धुंधला वाहिकाओं के लिए गैर विशिष्ट था और साथ ही गैर संवहनी ऊतक पर प्रकाश डाला, यह मुश्किल वाहिकाओं अंतर करने के लिए कर रही है. 1960 के दशक में, कोगन और Kuwabara यह आसान रेटिना 1 की nonvascular घटक पचाने द्वारा रेटिना वाहिका संरचना कल्पना करने के लिए बनाया है कि trypsin पचाने तकनीक विकसित की है. उस समय से, trypsin पचाने रेटिना 2-5 की वाहिका संरचना का विश्लेषण करने में सोने के मानक तरीका बन गया है. हालांकि, यह वाहिका अलग करने के लिए अन्य वैकल्पिक तकनीकों का वर्णन किया गया है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. आसमाटिक सेल का उपयोग वाहिका अलग और ऊतक 11,12 के जैव रासायनिक अध्ययन की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन प्रक्रिया संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक प्राथमिक तरीके के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया. ऊतक प्रिंट विधि कर दिया गया हैmicrovasculature के बड़े क्षेत्रों को अलग किया और vasculature 13 की इलेक्ट्रोटोनिक वास्तुकला का अध्ययन करने की क्षमता देता है. सिद्धांत रूप में, इस तकनीक को भी जहाजों की गुणवत्ता उच्च है, के रूप में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन, यह केवल वाहिका नेटवर्क पूरे के क्षेत्रों को अलग करने में सक्षम है. इन तरीकों trypsin पचाने की जगह नहीं कर सकते हैं, यह वे अलग फायदे और कमियों है और इस संबंध में पूरक हैं यह नोट करना महत्वपूर्ण है.
trypsin पचाने विधि तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है और लगातार 6,7 प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, यह एक इच्छाओं रेटिना 6,7 के समग्र संवहनी वास्तुकला की रक्षा के लिए विशेष रूप से अगर trypsin पचाने में, एक माउस मॉडल पर विशेष रूप से कठिन है कि उल्लेख किया गया है. चुनौतियों की आवश्यकता होती है, (1) वाहिका संरचना के रूप में अच्छी तरह से गैर संवहनी ऊतक दोनों की हानि का कारण बनता है कि रेटिना के ऊपर-पाचन, (2) के तहत पाचन शामिलमें पोत बिस्तर की क्षति, गैर विशिष्ट धुंधला करने के लिए अग्रणी vasculature से गैर संवहनी ऊतक के (3) गरीब जुदाई का नेतृत्व करने के लिए बदल सकती है जो व्यापक यांत्रिक विच्छेदन. कई पांडुलिपियों इन चुनौतियों पर प्रकाश डाला है, लेकिन कोई भी उन्हें 14,15 काबू पाने के लिए एक विस्तृत और संगत प्रोटोकॉल प्रदान की है. इस पांडुलिपि को विशेष रूप से कठिन कदम से निपटने के लिए विशेष टिप्स के साथ माउस और चूहा रेटिना पर trypsin पचाने में प्रदर्शन करने के लिए तकनीक का ब्यौरा एक कदम दर कदम पद्धति को लागू करेगा. एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. रेटिना तैयारी
- माउस आंख साफ करना. एक हाथ का प्रयोग, आंख से दिखाई देता है तो उस आँख lids खुला. दूसरी ओर, एक घुमावदार संदंश (घुमावदार सामना कर ऊपर की तरफ) का उपयोग, कक्षा के बेहतर और अवर पहलुओं पर दबाव लागू दुनिया protrudes तक. धीरे आंख के पीछे के पहलू पर संदंश बंद और आंख पता लगाना करने के लिए एक सतत गति में उठा.
- तटस्थ 10% कम से कम 24 घंटे के लिए formalin बफर के साथ आँख को ठीक करें.
- एक छोटा सा पेट्री डिश में पीबीएस समाधान में जगह आंख.
- बड़े आँसू उत्प्रेरण से बचने के लिए, देखभाल करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे ध्यान से रेटिना काटना. विच्छेदन कैंची से कॉर्निया में एक प्रारंभिक कटौती करें. फिर, सीधे संदंश के साथ कटौती क्षेत्र दबाए हुए कॉर्निया को हटाने कॉर्निया और श्वेतपटल की सीमा पर कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें. ध्यान से श्वेतपटल और दूर ऑप्टिक तंत्रिका की ओर रेटिना से रंजित छील, ठीक मुड़े और सीधे संदंश का प्रयोग. इस कदम के रूप में धैर्य की आवश्यकताजल्दी से रेटिना को मुक्त आँसू करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. लेंस और रेटिना 16 से किसी भी अतिरिक्त आईरिस और मलबे को हटा दें.
2. जल Washes
- 24 अच्छी तरह से पकवान और पानी (कम से कम एक 45 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर्ड लगभग 500 μl,) के साथ कवर में रखें रेटिना.
- , हर 30 मिनट, 1 घंटा कम से कम 4-5 बार पानी बदलें.
- कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ पानी में रात भर के लिए छोड़ दें.
नोट: वे रक्त वाहिकाओं से तंत्रिका रेटिना परतों को अलग करने में मदद के रूप में धोने कदम बहुत महत्वपूर्ण हैं.
3. Trypsin डाइजेस्ट
- 37 में 0.1 एम Tris बफर (7.8 पीएच) में 3% trypsin (Difco 1:250) की एक समाधान डिग्री सेल्सियस कोई झटकों को कोमल के साथ में पानी और सेते रेटिना निकालें. ऊतक विघटन के संकेत (लगभग 1.5 घंटे) दिखाने शुरू होता है जब trypsin पचाने में पूरा हो गया है.
नोट: तीव्र झटकों से बचेंइस वाहिका को नुकसान पहुंचा सकते हैं. - ध्यान से, रेटिना को छू से बचने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग अच्छी तरह से एक अलग में trypsin के बाहर विंदुक. 4.3 चरण में खुर्दबीन के नीचे बर्तन, जोड़ तोड़ जब इस अतिरिक्त trypsin, बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. Vasculature को अलग
- रेटिना को फ़िल्टर्ड पानी जोड़ें. फिर, यदि आवश्यक हो तो कैंची का उपयोग, संदंश के साथ आंतरिक सीमित झिल्ली बंद छील करने का प्रयास है. 5 मिनट के लिए हल्के आंदोलन के साथ हिलाओ. ध्यान से, रेटिना को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए खुर्दबीन के नीचे पानी बाहर विंदुक.
- पक्षपाती रेटिना ऊतक से जहाजों का मुक्त नेटवर्क की मदद करने के लिए पानी धोने (5 मिनट प्रत्येक के लिए) दोहराएँ. धोने के बाद पानी में शेष कोई मलबे के लिए कुछ नहीं है जब पानी washes के पूरा कर रहे हैं.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे सावधान जोड़तोड़ अब वाहिकाओं के नेटवर्क के आगे मुक्त करने की जरूरत है. नीचे अनुक्रम या उद्योग में इस्तेमाल किया जा सकता है जो कई उपयोगी तकनीकों हैंividually तकनीकी वरीयता के आधार पर वांछित परिणाम हासिल करने के लिए:
- एक 200 μl विंदुक का प्रयोग, ध्यान कोमल आंदोलन के कारण, बर्तन में पानी उड़ाने, नीचे आसन्न जहाजों को पानी विंदुक ऊपर और.
- 200 μl विंदुक का प्रयोग, पिपेट की कोट दीवारों में मदद करने के लिए नीचे trypsin विंदुक ऊपर और. फिर, सावधानीपूर्वक गैर संवहनी ऊतक नीचे तोड़ने में मदद करने के लिए एक बार पूरे पोत नेटवर्क विंदुक ऊपर और नीचे.
नोट: बल्कि संवहनी नेटवर्क के किनारों से ऑप्टिक तंत्रिका में पिपेट टिप एकत्रित भी टिप के लिए चिपके से वाहिका रोका जा सकता है. - धीरे गैर संवहनी घटक बेदखल करने के लिए पानी से बाहर ठीक संदंश के साथ वाहिका उठा.
- उपरोक्त कदम काम नहीं करते हैं, ऊतक नीचे तोड़ने में मदद, और कई मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं रेटिना को trypsin जोड़ें. फिर, trypsin हटाने और कदम 4.1-4.3 दोहराएँ.
<मजबूत> नोट: कोट trypsin में जहाजों (जैसे पिपेट टिप, संदंश) के साथ संपर्क में आ जाएगा कि सभी उपकरणों के लिए सुनिश्चित करें. इस उपकरण के लिए vasculature की आसंजन से बचने में मदद मिलेगी.
5. Vasculature Visualizing
- एक साफ स्लाइड पर पानी की एक बूंद रखें. एक 200 μl विंदुक या संदंश का प्रयोग, पानी में पचा वाहिकाओं हस्तांतरण. सुनिश्चित करें कि संवहनी फ्लैट माउंट सामने आया है. पानी की सतह तनाव अब पारदर्शक संवहनी नेटवर्क प्रकट करने के लिए मदद करता है. ऊतक प्रकट नहीं होता है, तो अतिरिक्त पानी को जोड़ने और धीरे खुलासा सुविधाजनक बनाने के लिए स्लाइड हिला.
- एक कागज तौलिया pipetting या का उपयोग करके बहुत धीरे से अतिरिक्त पानी निकाल दें.
- स्लाइड पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें.
- पीए / hematoxylin या एच ई दाग या तो साथ उचित प्रोटोकॉल के माध्यम से स्लाइड दाग.
नोट: पीए / hematoxylin पोत दीवार और सेलुलर नाभिक की पहचान करने के लिए उपयोगी है, एच ई डी के लिए उपयोगी हैआरबीसी की emonstration के रूप में अच्छी तरह से. - (Permount मध्यम बढ़ते) निर्जलीकरण और माउंट.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक सफल प्रक्रिया के अंतिम उत्पाद के आंकड़े 2-4 में दिखाया के रूप में वास्तुकला, पीए / hematoxylin या एच ई के साथ या तो दाग, बनाए रखा के साथ, माउस रेटिना vasculature की सम्पूर्ण नेटवर्क का एक फ्लैट माउंट है. 3 चित्र में दिखाया के रूप में endothelial कोशिकाओं और pericytes की स्पष्ट भेदभाव देखा जा सकता है. रेटिना में, endothelial कोशिकाओं के नाभिक अंडाकार या लम्बी हैं और पोत दीवार के भीतर पूरी तरह झूठ है. Pericyte नाभिक छोटे हैं, गोलाकार, घनी दाग और आम तौर पर केशिका दीवार के साथ एक असमान स्थिति है.
Trypsin पचाने में मधुमेह के पशु मॉडल में संवहनी विकृति का विश्लेषण करने के लिए एक सामान्य प्रक्रिया है. ऐसे microaneurysms, pericyte भूत (pericyte नुकसान का सबूत), अकोशिकीय केशिकाओं और केशिका अध: पतन के रूप में पैथोलॉजिक संवहनी घावों वर्णित किया गया है. चित्रा 4 एक डीबी / डीबी माउस में देखा केशिका अध: पतन, प्रकार के लिए एक मॉडल का एक उदाहरण से पता चलता है द्वितीय मधुमेह. प्रक्रिया माउस retinas के लिए अनुकूलित किया गया था हालांकि चित्रा 5 में दिखाया गया है, इसी तरह के परिणाम भी चूहा retinas में प्राप्त किया गया है. यह चूहा retinas के बहुत बड़े होते हैं कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है, और एक 12 अच्छी तरह से थाली के बजाय एक 24 अच्छी तरह से थाली का इस्तेमाल किया गया था. चूहा रेटिना की वाहिका नेटवर्क भी माउस समकक्ष से कम नाजुक है.
यह संभव के रूप में गैर संवहनी ऊतक के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. कोई अवशेष गैर विशिष्ट धुंधला करने के लिए नेतृत्व और vasculature की गरीब दृश्य पैदा होती हैं. चित्रा 6 चरण 4 में पूरे गैर संवहनी ऊतक के असफल हटाने का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करेंगे. इसी तरह, वाहिका के दृश्य में सुधार के रूप में तो जब बढ़ते रेटिना सामने आया है करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. चित्रा 7 कदम 5.1 में संवहनी फ्लैट माउंट का खुलासा असफल का प्रतिनिधित्व करता है.
1 ure "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 5.75in "के लिए: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/ files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg>
चित्रा 1. . ट्रिप्सिन डाइजेस्ट प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध (1) रेटिना तैयारी: आंख से रेटिना को अलग, (2) पानी washes: रातोंरात फ़िल्टर्ड पानी में धोएं, (3) ट्रिप्सिन डाइजेस्ट: सेते 37 पर 3% trypsin में ° 1-1.5 घंटे के लिए सी; (4) वाहिका अलग: खुर्दबीन के नीचे पानी washes और विच्छेदन की श्रृंखला के माध्यम से वाहिका अलग, (5) स्लाइड और सूखे को वाहिका हटो, (6) वाहिका Visualizing:. पीए या एच ई, के साथ दाग स्लाइड निर्जलीकरण और माउंट यहां क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने के लिए .
चित्रा 2. नियंत्रण डीबी / मी माउस trypsin पचाने (एच ई, 20x).यह आंकड़ा सामान्य संवहनी वास्तुकला दिखा रेटिना संवहनी नेटवर्क के एक सिंहावलोकन है.
चित्रा 3. नियंत्रण डीबी / मी माउस trypsin पचाने (एच ई, 600x). यह सामान्य संवहनी वास्तुकला दिखा चित्रा 2 में रेटिना के एक बढ़ाया दृश्य है. Endothelial सेल (सफेद तीर) और pericyte (काला तीर) डाला जाता है.
4 चित्रा. मधुमेह डीबी / डीबी माउस trypsin पचाने (एच ई, 500x). 52 सप्ताह तक, डीबी / डीबी चूहों ऐसे केशिका अध: पतन (सफेद तीर) के रूप में संवहनी विकृति विकसित करने के लिए शुरू करते हैं.
चित्रा 5. सामान्य चूहेरेटिना trypsin पचाने, (पीए, 20x [एक], 100x [ख]). एक सामान्य चूहे संवहनी नेटवर्क का अवलोकन और बढ़ाया छवि.
6 चित्रा. नियंत्रण C57/BL6 माउस trypsin पचाने, गैर संवहनी बरकरार ऊतक (एच ई, 20x [एक], 100x [ख]). गैर संवहनी ऊतक के गरीब हटाने के साथ, जहाजों की गैर विशिष्ट धुंधला आई. दृश्य है.
चित्रा 7. रेटिना पर्याप्त रूप से सामने आया नहीं है, तो नियंत्रण डीबी / मी माउस trypsin पचाने, गरीब बढ़ते (एच ई, 20x)., संवहनी नेटवर्क की अपर्याप्त दृश्य है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypsin पचाने रेटिना की वाहिका संरचना का आकलन करने के लिए एक मानक तरीका है. दुर्भाग्य से, यह तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है और सही ढंग से प्रदर्शन नहीं अगर नमूना नुकसान की उच्च दर में परिणाम कर सकते हैं. इसके अलावा, प्रक्रिया नेत्र रोगों का अधिक इस्तेमाल आनुवंशिक पशु मॉडल में इस तकनीक का आवेदन सीमित कर सकते हैं, जो चूहों में विशेष रूप से कठिन है. इस पत्र माउस आँखों में प्रभावी ढंग से और लगातार प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए पर मार्गदर्शन प्रदान करता है.
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, यह रेटिना संवहनी नेटवर्क बरकरार है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, किसी भी बड़े आँसू से बचने के लिए सावधानी से बाहर विच्छेदित किया कि महत्वपूर्ण है. यह trypsin पचाने के बाद एक आसान जुदाई सुविधा है, जो रक्त वाहिकाओं से neuroretinal परतों अलग मदद करता है के रूप में द्वितीय, फ़िल्टर्ड पानी में रेटिना धोने रातोंरात महत्वपूर्ण है. इस प्रक्रिया को तेज कर सकता है कि एक संशोधन 1% त्रि में रेटिना जगह होगीटन एक्स 100 में 1-2 घंटे के लिए फ़िल्टर्ड पानी में मिलाया. फिर, trypsin पचाने में पानी की एक श्रृंखला के बाद उसी दिन किया जा सकता है ट्राइटन एक्स दूर करने के लिए washes
यह रेटिना के ऊतकों वाहिका ऊतक के अनजाने विघटन से बचने के क्रम में trypsin पचाने के दौरान लगातार नजर रखी जा महत्वपूर्ण है. वाहिका अक्षुण्ण बनाए रखने, जबकि हमारे अनुभव के आधार पर, 1-1.5 आसपास घंटा, तंत्रिका ऊतक के पाचन को पूरा करने के लिए पर्याप्त है. कम समय युवा चूहों के लिए आवश्यक है. कोमल झटकों शेष ऊतकों से रक्त वाहिकाओं की जुदाई सुविधाजनक बनाने में मदद करने के लिए trypsin पचाने के दौरान प्रदर्शन किया है, लेकिन जरूरी नहीं है हो सकता है. इस वाहिकाओं के फाड़ करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में यह मजबूत आंदोलन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
सबसे अधिक ध्यान देने की जरूरत है कि महत्वपूर्ण कदम trypsin पाचन के बाद वाहिका को अलग शामिल है. पानी washes के प्रदर्शन, यह वाहिका pipetting से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. के pipettingवाहिका केवल दीवारों trypsin के साथ लेपित किया गया है के बाद वाहिका को अलग करने की एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. जहाजों के नेटवर्क को आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है के रूप में सभी जोड़तोड़ विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे सावधानी से किया जाना चाहिए. चरण 4 में वर्णित विभिन्न तकनीकों के संयोजन की एक किस्म में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, यह उनके लिए सबसे अच्छा काम करता है कि दृष्टिकोण को खोजने के लिए ऊपर व्यक्तिगत प्रयोगकर्ता के लिए किया जाएगा. यह रक्त वाहिकाओं के साथ संपर्क में आ जाएगा कि सभी उपकरण trypsin के साथ लेपित किया कि महत्वपूर्ण है. प्रक्रिया के दौरान trypsin में रहकर और अक्सर उपकरणों की सूई वाहिका और संभावित विघटन के आसंजन रोका जा सकता है.
प्रक्रिया की प्रभावकारिता भी पृष्ठभूमि माउस मॉडल पर निर्भर है. कुछ माउस पृष्ठभूमि पूरे वाहिका नेटवर्क के संरक्षण के रूप में अनुकूल नहीं हैं. उदाहरण के लिए, FVB पृष्ठभूमि फिर से उन्हें खतरा बना एक फॉस्फोडाइस्टरेज़ -6 उत्परिवर्तन के लिए homozygous हैtinal अध: पतन 17. हमारे अनुभव से, हम अपने रेटिना वाहिका स्वाभाविक रूप से अधिक कमजोर है कि मिल गया है, और हम वाहिका नेटवर्क पूरी की रक्षा करने में असमर्थ थे. इस प्रकार, यह पृष्ठभूमि में इस तकनीक का प्रयास करने से पहले ध्यान में रखा जाना जरूरी है.
अंत में, इस प्रक्रिया को मुख्य सीमा एक व्यक्ति के विच्छेदन कौशल है. यह एक व्यक्ति को अच्छी तरह से तकनीक जानता है कि भले ही वे अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए शुरू करने से पहले, यह कई प्रयास लग सकता है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, हम रुचि प्रयोगशाला कर्मियों विश्वास हासिल है और उनके प्रयोगात्मक ऊतक पर प्रक्रिया का प्रदर्शन करने से पहले सबसे अच्छा और सबसे सुसंगत दृष्टिकोण पर पहुंचने के लिए कई अभ्यास विच्छेदन प्रदर्शन की सिफारिश करेगा. यह एक बार में महारत हासिल है, यह नोट करना महत्वपूर्ण है, trypsin पचाने संवहनी विकृति (चित्रा 4) का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक महत्वपूर्ण तकनीक है. Trypsin पचाने में भी सफल किया जा सकता हैcessfully पर कई वर्षों के लिए 1 लगानेवाला में किया गया है कि रेटिना संरक्षित.
अंत में, trypsin पचाने में 1960 के दशक में कोगन और Kuwabara द्वारा उसके वर्णन के बाद से रेटिना वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी तरीका होना जारी है. इम्यूनोफ्लोरेसेंस / एच ई / पीए दाग वर्गों, फ्लैट आरोह और डाई इंजेक्शन की तुलना में यह पूरे संवहनी नेटवर्क का विस्तृत दृश्य देता है. यह तकनीकी रूप से कठिन है हालांकि इसे सफलतापूर्वक किया जा सकता है, ताकि इस पांडुलिपि में विस्तार प्रक्रिया का वर्णन करता है. नतीजतन, हम विधि को नौसिखिया जांचकर्ताओं उनके प्रयोगात्मक मॉडल में रेटिना vasculature की सफल और लगातार विश्लेषण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त मार्गदर्शन करेंगे.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम आंशिक रूप एनआईएच RO1-EY019951 (aaf), दृष्टिहीनता की रोकथाम के लिए इलिनोइस सोसायटी (जेसीसी, AAF), दृष्टिहीनता (RPB) को रोकने के लिए अनुसंधान से नेत्र विज्ञान विभाग को अप्रतिबंधित धन, न्यूयॉर्क और RPB मेडिकल छात्र फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (जेसीसी).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
