Summary
Trypsine digest is een van de meest gebruikte methoden voor retinale vasculatuur analyseren. Dit manuscript beschrijft de methode in detail, met inbegrip van belangrijke wijzigingen aan de techniek te optimaliseren en te verwijderen van de niet-vaatweefsel met behoud van de algehele architectuur van de schepen.
Abstract
Trypsine digest is de gouden standaard methode voor het analyseren van de retinale vaatstelsel 1-5. Het maakt visualisatie van het gehele netwerk van complexe driedimensionale retinale bloedvaten en haarvaten door een tweedimensionale platte bevestiging van de verbonden vasculaire kanalen na digestie van de niet-vasculaire componenten van de retina. Hierdoor kan men verschillende pathologische vasculaire veranderingen, zoals microaneurysms, capillaire degeneratie en abnormale endotheliale te pericyte verhoudingen bestuderen. De methode is technisch moeilijk, vooral muizen, die de meest beschikbare diermodel om retina studie vanwege het gemak van genetische manipulaties 6,7 geworden. In de muis oog, is het bijzonder moeilijk de niet-vasculaire componenten volledig verwijderen terwijl de algehele architectuur van de retinale bloedvaten. Tot op heden is er een gebrek aan literatuur die de trypsine digest techniek beschrijft in detail in de muis. Dit manuscript bevat een gedetailleerde stap-voor-stap methode van de trypsine digest in muisretina, terwijl het ook tips over het oplossen van problemen moeilijke stappen.
Introduction
Visualiseren van de vasculatuur van het netvlies is een zeer belangrijke aanpak de mechanismen van verschillende oogziekten zoals diabetische retinopathie ontleden. Het maakt het mogelijk om de vroegste vasculaire afwijkingen, waaronder microaneurysms, capillaire degeneratie, en pericyte verlies 8,9 beoordelen. Tot op heden zijn er diverse technieken ontwikkeld om de retinale vasculatuur analyseren geweest. Perfusie van verschillende kleurstoffen is gebruikt om de schepen te markeren, maar ze hebben allemaal dezelfde beperkingen als gedeeld. Injectie zelden benadrukt het gehele retinale vasculatuur indien gegeven bij een hoge druk, welke risico scheuren en beschadiging van de vaten 1. Immunokleuring van vasculaire endotheel met fluorofoor-gelabelde G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 geconjugeerd; I21413, Invitrogen, 1:100 verdunning) en retinale platte mounts kan de algemene architectuur van de schepen te markeren, maar zonder gedetailleerde visualisatie van haarvaten, basaalmembranen en pericytes . Het werd opgemerkt doorFriedenwald dat schepen door kleuring flatscreen-mounts van het netvlies met periodieke zuur-Schiff (PAS) of hematoxyline en eosine (H & E) kleuring 10 kan worden gemarkeerd. Echter, kleuring was niet specifiek voor de vaartuigen en wezen niet-vasculaire weefsels alsmede, waardoor het moeilijk om de schepen differentiëren. In de jaren 1960, en Cogan Kuwabara ontwikkelde de trypsine digestie techniek die het gemakkelijker gemaakt om de retinale vasculatuur visualiseren digereren de vasculaire componenten van de retina 1. Sinds die tijd heeft het trypsine digest uitgegroeid tot de gouden standaard methode in het analyseren van het vaatstelsel van het netvlies 2-5. Het is echter belangrijk op te merken dat andere alternatieve technieken voor de vasculatuur isoleren zijn beschreven. Het gebruik van osmotische lysis is gebruikt om de vasculatuur te isoleren en laat biochemische studies van het weefsel 11,12, maar de procedure niet is gebruikt als een primaire methode voor anatomische studie. Het weefsel print-methode is geweestgebruikt om grote segmenten van capillairen isoleren en laat de mogelijkheid om de elektrotone architectuur van de vasculatuur 13 bestuderen. In theorie zou deze techniek ook gebruikt worden om anatomische veranderingen te bestuderen, aangezien de kwaliteit van de vaten hoog. Het is echter alleen in staat om delen van het gehele vaatstelsel netwerk isoleren. Hoewel deze methoden niet kan vervangen trypsine verteren, is het belangrijk op te merken dat ze verschillende voordelen en tekortkomingen en zijn complementair in dit verband.
De trypsine digest methode is technisch uitdagend en moeilijk om consequent 6,7 voeren. Voorts is geconstateerd dat trypsine digestie bijzonder moeilijk een muismodel, vooral wanneer men wenst de algemene vasculaire architectuur van de retina 6,7 bewaren. Uitdagingen omvatten (1) over-digestie van het netvlies dat het verlies van zowel de vasculatuur en niet-vasculair weefsel veroorzaakt, (2) onder-digestie, waarbijuitgebreide mechanische dissectie hetgeen weer leiden tot beschadiging van het membraan bed, (3) slechte scheiding van de niet-vasculair weefsel van het vaatstelsel leidt tot niet-specifieke kleuring. Verschillende handschriften hebben gewezen op deze uitdagingen, maar niemand heeft een gedetailleerde en consistente protocol om ze te overwinnen 14,15. Dit manuscript zal een stap-voor-stap methode waarin de techniek om de trypsine digest uitvoeren op muizen en ratten netvliezen met concrete tips over het omgaan met de bijzonder moeilijke stappen te introduceren. Een schematisch overzicht in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Retinale Voorbereiding
- Ophelderen van de muis oog. Met een hand, opent de oogleden zodat het oog zichtbaar is. Bij de andere kant, met een gebogen pincet (gebogen naar boven), druk uitoefenen op superieure en inferieure aspecten van de baan tot de wereld uitsteekt. Sluit tang op het achterste deel van het oog en til in een continue beweging voor het oog ophelderen.
- Bevestig oog met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende tenminste 24 uur.
- Plaats eye in PBS oplossing in een kleine petrischaal.
- Ontleden netvlies zorgvuldig onder een microscoop, de zorg om te voorkomen dat het induceren grote tranen. Maak een eerste snede in het hoornvlies met dissectie schaar. Dan, terwijl de cut gebied met rechte tang, met een schaar te snijden langs de grens van het hoornvlies en sclera verwijderen van het hoornvlies. Met behulp van fijne gebogen en rechte pincet, zorgvuldig verwijderen van de sclera en choroidea weg van het netvlies naar de optische zenuw. Deze stap vereist geduld alssnel vrijmaken van het netvlies kan leiden tot scheuren. Verwijder de lens en de overmaat iris en vuil van de retina 16.
2. Water Wast
- Plaats netvlies in een 24-well schotel en bedek met water (ongeveer 500 pl, gefilterd met minstens een 45 um filter).
- Verander water om de 30 min-1 uur, minstens 4-5 keer.
- Laat een nacht in water met een zacht schudden bij kamertemperatuur.
Opmerking: De wasstappen zijn zeer belangrijk omdat zij scheid de neurale retina lagen van de bloedvaten.
3. Trypsine Digest
- Verwijder water en incubeer retina in een oplossing van 3% trypsine (Difco 1:250) in 0,1 M Tris buffer (pH 7,8) bij 37 ° C onder zacht schudden om zonder. Trypsine digest wordt voltooid wanneer het weefsel begint tekenen van desintegratie (ongeveer 1,5 uur).
Opmerking: Vermijd snelle schuddenomdat dit het vaatstelsel beschadigen. - Zorgvuldig, pipet uit trypsine in een aparte goed met behulp van een microscoop om te voorkomen dat het aanraken van het netvlies. Deze overmaat trypsine kan later worden gebruikt, bij het manipuleren van de schepen onder de microscoop, in stap 4.3.
4. Het scheiden van de Vasculatuur
- Voeg gefilterd water aan de retina. Vervolgens proberen af te pellen van de interne grensmembraan met een pincet, met een schaar indien nodig. Schud met mild roeren gedurende 5 minuten. Zorgvuldig, pipet uit het water onder de microscoop beschadiging van het netvlies te voorkomen.
- Herhaal water wast (voor elke 5 min) om gratis het netwerk van schepen uit de adherente netvliesweefsel helpen. Water wast zijn voltooid wanneer er weinig tot geen vuil achterblijft in het water na het wassen.
- Zorgvuldige manipulaties onder een dissectie microscoop zijn nu nodig om verder vrij te maken van het netwerk van de schepen. Hieronder zijn enkele nuttige technieken die kunnen worden gebruikt in sequentie of individually om het gewenste resultaat op basis van technische voorkeur te bereiken:
- Met behulp van een 200 ul pipet voorzichtig pipet water omhoog en omlaag naast schepen, blazen water op schepen, waardoor zacht schudden.
- Met behulp van 200 ul pipet, pipet de trypsine op en neer om te helpen jas wanden van de pipet. Dan voorzichtig pipet het gehele netwerk schip keer op en neer om te helpen af te breken niet-vasculair weefsel.
Opmerking: centreren de pipetpunt in de oogzenuw plaats van de randen van het vasculaire netwerk kan ook voorkomen dat de vasculatuur plakken aan de tip. - Til vaatstelsel met fijne tang uit het water om niet-vasculaire componenten verjagen.
- Als de bovenstaande stappen niet werken, voeg trypsine aan het netvlies te helpen het weefsel afbreken, en incubeer bij 37 ° C gedurende enkele minuten. Verwijder vervolgens trypsine en herhaal de stappen 4,1-4,3.
<strong> Opmerking: Zorg ervoor dat de vacht alle instrumenten die in contact met de schepen in trypsine (bv. pipet tip, tangen) zal komen. Zo voorkomt hechting van vasculatuur van de apparatuur.
5. Visualiseren van het vaatstelsel
- Plaats een druppel water op een schoon objectglas. Met behulp van een 200 ul pipet of tang, overdracht van de verteerde schepen in het water. Zorg ervoor dat de vasculaire flat-mount is ontvouwd. De oppervlaktespanning van het water helpt om de nu doorschijnende vasculaire netwerk ontvouwen. Als het weefsel niet ontvouwen, voeg extra water en schud de dia te vergemakkelijken ontvouwen.
- Verwijder overtollig water heel langzaam door pipetteren of met behulp van een papieren handdoek.
- Laat dia's volledig drogen.
- Vlek slides via geschikte protocol met ofwel PAS / hematoxylin of H & E kleuring.
Opmerking: PAS / hematoxyline zijn nuttig om vaatwand celkernen, H & E is nuttig voor demonstration van RBC ook. - Uitdrogen en mount (Permount montage medium).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het eindproduct van een succesvolle procedure is een platte montage van het gehele netwerk van de muis retinale vasculatuur, met de architectuur behouden, gekleurd met ofwel PAS / hematoxyline of H & E, zoals getoond in figuren 2-4. Duidelijke differentiatie van endotheliale cellen en pericyten te zien zoals weergegeven in figuur 3. In de retina, de kernen van endotheelcellen ovaal of langwerpig en liggen geheel binnen de vaatwand. Pericyte kernen zijn kleine, bolvormige, vlek dicht en hebben over het algemeen een uitpuilend positie langs de capillaire wand.
Trypsine digest is een gemeenschappelijke procedure te analyseren vasculaire pathologie bij diabetes diermodellen. Pathologische vasculaire laesies zoals microaneurysms, pericyte ghosts (bewijs pericyte verlies), acellulair capillairen en capillaire degeneratie zijn beschreven. Figuur 4 toont een voorbeeld van capillaire degeneratie gezien in db / db muizen, een model voor het type II diabetes. Hoewel de procedure geoptimaliseerd voor muizen netvlies zijn soortgelijke resultaten ook verkregen in rat retina zoals getoond in figuur 5. Het is belangrijk op te merken dat de rat netvliezen zijn veel groter, en een 12-well plaat werd gebruikt in plaats van een 24-wells plaat. De vasculatuur netwerk van de rat retina is ook minder kwetsbaar dan de muis tegenhanger.
Het is uiterst belangrijk om zoveel mogelijk van de niet-vaatweefsel mogelijk opheffen. Restanten zal leiden tot niet-specifieke kleuring en kan de visualisatie van het vaatstelsel. Figuur 6 geeft een voorbeeld van mislukte verwijdering van alle niet-vaatweefsel in stap 4. Evenzo is het ook belangrijk de retina worden uitgevouwen bij montage om visualisatie van de bloedvaten te verbeteren hebben. Figuur 7 toont ongelijk ontvouwen van de vasculaire flat-mount in stap 5.1.
ure 1 "fo: content-width =" 5.75in "fo: src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/>
Figuur 1. . Schematische voorstelling van trypsine Digest Protocol (1) Netvlies Bereiding: isoleren netvlies van het oog; (2) Water wast: Was in gefilterd water 's nachts; (3) trypsine Digest: Incubate in 3% trypsine bij 37 ° C gedurende 1-1,5 uur; (4) Het scheiden van het vaatstelsel: isoleren vaatstelsel via serie water wast en dissectie onder microscoop; (5) Beweeg vaatstelsel te schuiven en laten drogen; (6) Het visualiseren van het vaatstelsel:. vlek dia met PAS of H & E, uitdrogen en monteer Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Controle db / m muis trypsine digest (H & E, 20x).Dit cijfer is een overzicht van de retinale vasculaire netwerk met normale vasculaire architectuur.
Figuur 3. Controle db / m muis trypsine digest (H & E, 600x). Dit is een vergroot aanzicht van de retina in figuur 2 met normale vasculaire architectuur. Endotheelcellen (witte pijl) en pericyte (zwarte pijl) worden gemarkeerd.
Figuur 4. Diabetische db / db muis trypsine digest (H & E, 500x). Per 52 weken, db / db muizen beginnen te vasculaire pathologie te ontwikkelen, zoals capillaire degeneratie (witte pijl).
Figuur 5. Normale ratretina trypsine verteren, (PAS, 20x [a], 100x [b]). Een overzicht en uitvergroot beeld van een normale rat vasculaire netwerk.
Figuur 6. Controle C57/Bl6 muis trypsine verteren, niet-vasculair weefsel intact (H & E, 20x [a], 100x [b]). Met slechte verwijdering van de niet-vaatweefsel, is er niet-specifieke kleuring afbreuk visualisatie van schepen.
Figuur 7. Controle db / m muis trypsine digest, slechte montage (H & E, 20x). Als het netvlies niet adequaat ontvouwd, is er onvoldoende visualisatie van het vasculaire netwerk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypsine digest is een standaardmethode om de vasculatuur van het netvlies te beoordelen. Helaas, het is technisch uitdagend en kan leiden tot een hoge mate van specimen verlies indien niet correct uitgevoerd. Verder is de bijzonder moeilijk in muizen, waarin de toepassing van deze techniek in het algemeen gebruikte genetische diermodellen van oogziekten kunnen beperken. Dit document geeft richtlijnen over hoe de procedure doeltreffend en consequent uit te voeren in de muis ogen.
Er zijn een aantal cruciale stappen in het protocol. Ten eerste, is het cruciaal dat de retina zorgvuldig uitgesneden om eventuele grote scheuren te vermijden, zodat het vasculaire netwerk intact blijft. Ten tweede, het wassen van het netvlies in het gefilterde water 's nachts is belangrijk omdat het de afzonderlijke neuroretinal lagen van de bloedvaten, wat een makkelijkere scheiding na trypsine digest faciliteert helpt. Een modificatie dat het proces kan versnellen is om de retina te plaatsen in 1% triton X-100 gemengd in gefilterd water voor 1-2 uur. Vervolgens kan trypsine verteren op dezelfde dag worden uitgevoerd na een reeks van water wast aan de triton X te verwijderen
Het is belangrijk dat de retinale weefsels voortdurend gecontroleerd tijdens de trypsine digestie om onbedoelde oplossen van vasculatuur weefsel voorkomen. Gebaseerd op onze ervaring, rond 1-1,5 uur is voldoende om de spijsvertering van het zenuwweefsel te bereiken, met behoud van de bloedvaten intact. Minder tijd nodig is voor de jongere muizen. Zachtjes schudden kan tijdens de trypsine digestie uitgevoerd om scheiding van de bloedvaten van het restmateriaal te vergemakkelijken, maar is niet noodzakelijk. Het is belangrijk om sterke agitatie vermijden aangezien dit kan leiden tot scheuren van de vaten.
De kritische stappen die de meeste aandacht vereisen betrekken scheiden van het vaatstelsel na trypsinedigestie. Bij het uitvoeren van het wassen met water, is het belangrijk te voorkomen pipetteren het vaatstelsel. Pipetteren vanhet vaatstelsel alleen worden gebruikt als een methode voor het scheiden van de vasculatuur na de wanden zijn bekleed met trypsine. Alle manipulaties moeten zorgvuldig onder de dissectie microscoop worden gedaan als het netwerk van vaten gemakkelijk kunnen worden beschadigd. De verschillende technieken in stap 4 met succes kan worden gebruikt in verschillende combinaties. Uiteindelijk zal het aan de individuele onderzoeker aan de aanpak die het beste werkt voor hen te vinden. Het is belangrijk dat alle gereedschappen die in contact met de bloedvaten zijn bekleed worden met trypsine. Dompelen tools intermitterend en vaak in trypsine gedurende de procedure hechting van vasculatuur en mogelijke voorkoming van de verstoring.
De doeltreffendheid van de procedure is ook afhankelijk van de achtergrond muismodel. Sommige muis achtergronden zijn niet zo bevorderlijk voor het behoud van het gehele vaatstelsel netwerk. Bijvoorbeeld, de FVB achtergrond homozygoot voor een fosfodiësterase-6 mutatie waardoor ze gevoelig zijn voor retinal degeneratie 17. Vanuit onze ervaring, hebben we ontdekt dat hun netvlies vaatstelsel is inherent kwetsbaar, en we waren niet in staat om het gehele vaatstelsel netwerk te behouden. Aldus is het belangrijk dat de achtergrond in overweging voordat wordt geprobeerd deze techniek.
Uiteindelijk is de belangrijkste beperking van deze procedure is een individu dissectie vaardigheden. Het is belangrijk op te merken dat zelfs indien een individuele kent de technieken die kan het aantal pogingen voordat ze beginnen om consistente resultaten. Zo zouden we adviseren dat de geïnteresseerde laboratoriumpersoneel voeren verschillende praktijk dissecties om vertrouwen te winnen en te komen tot de beste en meest consistente aanpak voorafgaand aan het uitvoeren van de procedure op hun experimentele weefsel. Het is belangrijk op te merken dat wanneer de knie, trypsine digestie is een waardevolle techniek die kan worden gebruikt om te beoordelen vasculaire pathologie (figuur 4). Trypsine digest kan ook suc worden uitgevoerdces op bewaarde netvliezen die zijn in fixatief voor meerdere jaren 1.
Concluderend, trypsine digestie blijft een zeer nuttige methode om de retinale vasculatuur analyseren aangezien de beschrijving van Cogan en Kuwabara in de jaren 1960. Het mogelijk gedetailleerd visualisatie van het hele vasculaire netwerk in vergelijking met immunofluorescentie / H & E / PAS-gekleurde coupes, flat-mounts en dye-injecties. Hoewel het technisch moeilijk, dit manuscript de procedure beschreven in detail, zodat het met succes kan worden uitgevoerd. Hierdoor hopen we beginnende onderzoekers de methode voldoende aanwijzingen moeten succesvolle en consistente analyse van de retinale vasculatuur toestaan op hun experimentele modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Vereniging voor Preventie van Blindheid (JCC, AAF), onbeperkte middelen om de afdeling Oogheelkunde van het Onderzoek om Blindheid (RPB) voorkomen, NY en RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
