Summary
Trypsine digest est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour analyser la vascularisation rétinienne. Ce manuscrit décrit la méthode en détail, y compris les modifications clés pour optimiser la technique et retirer le tissu non vasculaire tout en préservant l'architecture d'ensemble des navires.
Abstract
Trypsine digest est la méthode de référence pour analyser la vascularisation rétinienne 1-5. Il permet de visualiser l'ensemble du réseau de vaisseaux complexes tridimensionnels sanguins et des capillaires rétiniens en créant une plate-montage en deux dimensions des canaux vasculaires interconnectés après digestion des composants non-vasculaires de la rétine. Cela permet d'étudier diverses modifications pathologiques vasculaires, tels que les micro-anévrismes, la dégénérescence capillaire et anormal endothéliales des ratios pericyte. Cependant, la méthode est techniquement difficile, surtout chez la souris, qui sont devenus le modèle animal le plus largement disponible pour étudier la rétine en raison de la facilité de manipulations génétiques 6,7. Dans l'oeil de la souris, il est particulièrement difficile de supprimer complètement les composants non-vasculaires tout en conservant l'architecture globale des vaisseaux sanguins de la rétine. À ce jour, il ya une pénurie de littérature qui décrit la technique de digérer la trypsine en détail in la souris. Ce manuscrit fournit une méthodologie détaillée de la trypsine digest dans la rétine de souris, étape par étape, tout en fournissant des conseils sur les étapes de dépannage difficiles.
Introduction
Visualiser la vascularisation de la rétine est une approche extrêmement important de disséquer les mécanismes de diverses maladies oculaires comme la rétinopathie diabétique. Il permet d'évaluer les anomalies vasculaires premières, y compris les micro-anévrismes, la dégénérescence et la perte capillaire pericyte 8,9. À ce jour, il ya eu plusieurs techniques mises au point pour analyser la vascularisation rétinienne. Perfusion de divers colorants a été utilisé pour mettre en évidence les vaisseaux, mais tous ont partagé les mêmes limites. Injection met rarement toute la vascularisation rétinienne moins donné à une haute pression, ce qui risque de rupture et d'endommager les navires 1. Immunocoloration de l'endothélium vasculaire avec fluorophore marqué G isolectine B4 (Alexa Fluor 594 conjugué; I21413; Invitrogen; dilution 1:100) et les supports plats rétine peut mettre en évidence l'architecture globale des vaisseaux, mais sans visualisation détaillée des capillaires, les membranes basales et pericytes . Il a été noté parFriedenwald que les navires peuvent être mis en évidence par coloration plate-monts de rétine avec de l'acide périodique Schiff (PAS) ou hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration 10. Cependant, la coloration était non spécifique aux vaisseaux et a souligné le tissu non vasculaire ainsi, il est difficile de différencier les vaisseaux. Dans les années 1960, Cogan et Kuwabara développé la technique la trypsine digest qui a rendu plus facile de visualiser la vascularisation rétinienne en digérant les composantes non vasculaires de la rétine 1. Depuis ce temps, la trypsine digest est devenue la méthode de référence dans l'analyse de la vascularisation de la rétine 2-5. Cependant, il est important de noter que d'autres alternatives techniques pour isoler le système vasculaire ont été décrits. L'utilisation de lyse osmotique a été utilisée pour isoler le système vasculaire et permettre des études biochimiques du tissu 11,12, mais la procédure n'a pas été utilisé comme méthode principale pour l'étude anatomique. Procédé d'impression de tissu estutilisée pour isoler de larges segments de microvascularisation et permet la possibilité d'étudier l'architecture électrotonique de la vascularisation 13. En théorie, cette technique pourrait également être utilisée pour étudier les changements anatomiques, comme la qualité des vaisseaux est élevé. Cependant, il est seulement capable d'isoler les segments de l'ensemble du réseau vasculaire. Bien que ces méthodes ne peuvent pas remplacer la trypsine digérer, il est important de noter qu'ils ont des avantages et des inconvénients et sont complémentaires à cet égard.
La méthode digest trypsine est techniquement difficile et il est difficile de performer de façon constante 6,7. En outre, il a été noté que la trypsine digest est particulièrement difficile sur un modèle de souris, en particulier si l'on veut préserver l'architecture vasculaire global de la rétine 6,7. Les défis incluent (1) sur-digestion de la rétine qui entraîne une perte à la fois du système vasculaire ainsi que le tissu non vasculaire, (2) sous-digestion, exigeantdissection étendue mécanique qui pourrait à son tour conduire à des lésions de la chambre de cuve (3), une mauvaise séparation des tissus non vasculaires du système vasculaire qui conduit à une coloration non spécifique. Plusieurs manuscrits ont mis en évidence ces défis, mais aucune n'a fourni un protocole détaillé et cohérent pour les surmonter 14,15. Ce manuscrit va introduire une méthodologie étape par étape décrivant la technique pour effectuer la trypsine digest sur la souris et le rat rétines avec des conseils spécifiques sur la manipulation des étapes particulièrement difficiles. Un aperçu schématique est illustré à la figure 1.
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Protocol
1. Préparation rétinienne
- Énucléer l'oeil de la souris. En utilisant une main, ouvrir les paupières de sorte que l'œil est visible. Avec l'autre main, à l'aide d'une pince courbes (courbes vers le haut), appliquer une pression sur les aspects supérieurs et inférieurs de l'orbite jusqu'à ce que les dépasse globe. Fermez doucement forceps à la partie postérieure de l'œil et de soulever dans un mouvement continu pour énucléer l'œil.
- Corrigez les yeux avec 10% de formol tamponné neutre pendant au moins 24 heures.
- Lieu oeil dans une solution de PBS dans une petite boîte de Pétri.
- Disséquer rétine soigneusement sous un microscope, en prenant soin d'éviter de provoquer de grosses larmes. Faire une coupe initiale dans la cornée avec des ciseaux de dissection. Puis, tout en maintenant la zone de coupe avec des pinces droites, utilisez des ciseaux pour couper le long de la frontière de la cornée et la sclérotique de retirer la cornée. En utilisant des pinces courbes et droites fines, détachez soigneusement la sclérotique et la choroïde loin de la rétine vers le nerf optique. Cette étape exige de la patience commelibérant rapidement la rétine peut entraîner des larmes. Retirez l'objectif et tout excédent iris et les débris de la rétine 16.
2. Eau lave
- Lieu rétine dans un plat de 24 puits et couvrir d'eau (environ 500 pi, filtrée avec au moins un filtre de 45 um).
- Changez l'eau toutes les 30 min-1 heure, au moins 4-5 fois.
- Laissez sécher une nuit dans de l'eau avec agitation douce à température ambiante.
Remarque: Les étapes de lavage sont très importants car ils permettent de séparer les couches de la rétine de neurones à partir des vaisseaux sanguins.
3. Trypsine Digest
- Enlevez l'eau et de la rétine incuber dans une solution de 3% de trypsine (Difco 1:250) dans 0,1 M de tampon Tris (pH 7,8) à 37 ° C avec douceur à aucune secousse. Trypsine digestion est terminée lorsque le tissu commence à montrer des signes de désintégration (environ 1,5 heures).
Note: Eviter d'agiter rapidecar cela peut endommager le système vasculaire. - Soigneusement, une pipette à la trypsine dans un puits séparé en utilisant un microscope pour éviter de toucher la rétine. Cet excès de trypsine peut être utilisé plus tard, lors de la manipulation des vaisseaux sous le microscope, à l'étape 4.3.
4. Séparer le système vasculaire
- Ajouter de l'eau filtrée à la rétine. Ensuite, tenter de décoller la membrane limitante interne avec une pince, en utilisant des ciseaux si nécessaire. Agiter avec une légère agitation pendant 5 min. Soigneusement, une pipette à l'eau sous le microscope pour éviter d'endommager la rétine.
- Répétez lavages à l'eau (pendant 5 minutes chacun) pour aider à libérer le réseau de vaisseaux du tissu rétinien adhérente. lavages à l'eau sont terminés quand il ya peu ou pas de débris restant dans l'eau après le lavage.
- Manipulations soigneuses sous un microscope de dissection sont maintenant nécessaires pour libérer davantage le réseau de vaisseaux. Voici quelques techniques utiles, qui peuvent être utilisés dans l'ordre ou individually pour atteindre le résultat souhaité en fonction des préférences technique:
- Avec une pipette 200 pi, une pipette soigneusement l'eau de haut en bas à côté de bateaux, l'eau soufflant à bateaux, provoquant une agitation douce.
- Utilisation de la pipette 200 ul, Pipette la trypsine de haut en bas pour aider les parois de manteau de la pipette. Ensuite, ATTENTIVEMENT pipette le réseau de vaisseaux tout haut et en bas une fois pour aider à briser le tissu non vasculaire.
Note: Le centrage de la pointe de la pipette au niveau du nerf optique plutôt que sur les bords du réseau vasculaire peut également empêcher la vascularisation de coller à la pointe. - Soulevez doucement vasculaire avec une pince fine hors de l'eau pour déloger les composants non-vasculaires.
- Si les étapes précédentes ne fonctionnent pas, ajoutez la trypsine de la rétine pour aider à briser le tissu et incuber à 37 ° C pendant plusieurs minutes. Ensuite, retirez la trypsine et répétez les étapes 4.1-4.3.
<strong> Note: Assurez-vous de bien enrober tous les instruments qui entrent en contact avec les navires de la trypsine (par exemple la pointe de pipette, forceps). Cela permettra d'éviter l'adhérence de la vascularisation de l'équipement.
5. Visualiser la vascularisation
- Déposer une goutte d'eau sur une lame propre. Avec une pipette ou une pince 200 pi, transférer les vaisseaux digérés dans l'eau. Assurez-vous que la plate-mount vasculaire est déplié. La tension superficielle de l'eau permet de déplier le réseau vasculaire maintenant diaphane. Si le tissu ne se déroule pas, ajouter de l'eau et secouez doucement la lame pour faciliter le déroulement.
- Retirer l'excès d'eau très lentement par la pipette ou en utilisant une serviette en papier.
- Laisser les lames sécher complètement.
- Colorer diapositives via le protocole approprié avec soit PAS / hématoxyline ou H & E tache.
Note: PAS / hématoxyline est utile pour identifier paroi de la cuve et des noyaux cellulaires, H & E est utile pour da démonstration de RBC ainsi. - Déshydrater et monter (Moyen Permount montage).
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Representative Results
Le produit final d'une procédure réussie est une plate-montage de l'ensemble du réseau de la vascularisation rétinienne de la souris, avec l'architecture maintenu, colorées avec soit PAS / hématoxyline ou H & E, comme indiqué dans les figures 2-4. Effacer la différenciation des cellules endothéliales et des péricytes peut être considéré comme le montre la figure 3. Dans la rétine, les noyaux des cellules endothéliales sont de forme ovale ou allongée et se trouvent entièrement à l'intérieur de la paroi du vaisseau. Noyaux pericyte sont de petite taille, de forme sphérique, aux taches denses et ont généralement une position saillante le long de la paroi des capillaires.
Trypsine digest est une procédure courante pour analyser la pathologie vasculaire dans des modèles animaux diabétiques. Lésions vasculaires pathologiques tels que micro-anévrismes, des fantômes pericyte (en cas de perte des péricytes), acellulaire capillaires et la dégénérescence capillaire ont été décrits. Figure 4 montre un exemple de dégénérescence capillaire vu chez la souris db / db, un modèle pour le type Diabète de type II. Bien que la procédure a été optimisé pour les rétines de souris, des résultats similaires ont été obtenus dans les rétines de rat comme le montre la Figure 5. Il est important de noter que la rétine de rats sont beaucoup plus grandes, et une plaque de 12 puits a été utilisé à la place d'une plaque de 24 puits. Le réseau vasculaire de la rétine de rat est aussi moins fragile que la contrepartie de la souris.
Il est extrêmement important d'enlever autant de tissu non vasculaire que possible. Les restes vont conduire à une coloration non spécifique et conduire à une mauvaise visualisation de la vascularisation. Figure 6 représente un exemple de suppression infructueuses de l'ensemble du tissu non vasculaire à l'étape 4. De même, il est également important d'avoir la rétine être déplié lors du montage afin d'améliorer la visualisation de la vascularisation. Figure 7 représente infructueux déploiement de la plate-mount vasculaire à l'étape 5.1.
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Figure 1. . Schéma de trypsine protocole Digest (1) Préparation rétine: isoler la rétine de l'œil, (2) L'eau lave: Laver à l'eau filtrée pendant la nuit, (3) la trypsine Digest: incuber à 3% de trypsine à 37 ° C pendant 1-1,5 heures; (4) séparer le système vasculaire: isoler vasculaire via série de lavages à l'eau et dissection sous microscope; (5) Déplacez vasculaire à glisser et laisser sécher; (6) Visualisation du système vasculaire:. diaporama tache avec SAP ou H & E, déshydrater et monter Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Contrôle db / m souris trypsine digest (H & E, 20x).Ce chiffre est une vue d'ensemble du réseau vasculaire rétinienne montrant l'architecture vasculaire normal.
Figure 3. Contrôle db / m souris trypsine digest (H & E, 600x). Ceci est une vue agrandie de la rétine à la figure 2, montrant l'architecture vasculaire normal. Cellules endothéliales (flèche blanche) et pericyte (flèche noire) sont mis en évidence.
Figure 4. Diabétique souris db / db trypsine digest (H & E, 500x). Par 52 semaines, les souris db / db commencent à se développer pathologie vasculaire comme la dégénérescence capillaire (flèche blanche).
Figure 5. Rat normalrétine trypsine digest, (PAS, 20x [a], 100x [b]). Un aperçu et une image agrandie d'un réseau vasculaire de rat normal.
Figure 6. Contrôle C57/BL6 souris trypsine digest, tissu non vasculaire intact (H & E, 20x [a], 100x [b]). Avec une mauvaise ablation du tissu non vasculaire, il ya coloration non spécifique visualisation atteinte des vaisseaux.
Figure 7. Contrôle db / m souris trypsine digest, montage pauvres (H & E, 20x). Si la rétine n'est pas suffisamment déployé, il ya visualisation insuffisante du réseau vasculaire.
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Discussion
Trypsine digest est une méthode standard pour évaluer la vascularisation de la rétine. Malheureusement, il est techniquement difficile et peut entraîner des taux de perte de spécimen s'il n'est pas effectué correctement. En outre, la procédure est particulièrement difficile chez la souris, ce qui peut limiter l'application de cette technique dans les modèles animaux génétiques couramment utilisés de maladies oculaires. Ce document fournit des conseils sur la façon d'exécuter de manière efficace et cohérente de la procédure dans les yeux de souris.
Il ya plusieurs étapes critiques dans le protocole. Tout d'abord, il est crucial que la rétine est disséqué avec soin pour éviter les grosses larmes, pour s'assurer que le réseau vasculaire reste intacte. Deuxièmement, le lavage de la rétine dans l'eau filtrée est du jour au lendemain important car il permet de séparer les couches neurorétinien des vaisseaux sanguins, ce qui facilite une séparation plus facile après la trypsine digest. Une modification qui pourrait accélérer le processus serait de placer la rétine à 1% de tritonne X-100 mélangé à de l'eau filtrée pendant 1-2 heures. Ensuite, la trypsine digest peut être effectuée le jour même après une série d'eau lave pour enlever le triton X.
Il est important que les tissus rétiniens être surveillés en permanence pendant la trypsine digest afin d'éviter la dissolution involontaire du tissu vasculaire. Basé sur notre expérience, autour de 1-1,5 heures est suffisante pour accomplir la digestion du tissu neural, tout en préservant la vascularisation intact. Moins de temps est nécessaire pour jeunes souris. Agitation douce peut être effectuée au cours de la trypsine digest pour faciliter la séparation des vaisseaux sanguins du tissu restant, mais n'est pas nécessaire. Il est important d'éviter une forte agitation car cela peut conduire à la déchirure des vaisseaux.
Les étapes critiques qui nécessitent le plus d'attention impliquent séparer le système vasculaire après digestion par la trypsine. Lorsque vous effectuez les lavages à l'eau, il est important d'éviter le pipetage de la vascularisation. Pipetagele système vasculaire ne doit être utilisé en tant que procédé de séparation de la vascularisation après que les parois ont été revêtues avec de la trypsine. Toutes les manipulations doivent être faites avec soin sous le microscope de dissection que le réseau de vaisseaux peut facilement être endommagé. Les différentes techniques décrites à l'étape 4 peut être utilisé avec succès dans une variété de combinaisons. En fin de compte, ce sera à l'expérimentateur individu de trouver l'approche qui leur convient le mieux. Il est important que tous les outils qui entreront en contact avec les vaisseaux sanguins être revêtus de la trypsine. Tremper les outils intermittence et souvent dans la trypsine pendant la procédure peut empêcher l'adhésion de perturbation vasculaire et potentiels.
L'efficacité de la procédure dépend également du modèle de souris de fond. Certains milieux de la souris ne sont pas aussi propice à la préservation de l'ensemble du réseau vasculaire. Par exemple, le fond FVB est homozygote pour une phosphodiestérase-6 mutation qui les rend sujettes à nouveaudégénérescence intestinal 17. De notre expérience, nous avons constaté que leur vascularisation rétinienne est intrinsèquement plus fragile, et nous avons été incapables de préserver l'ensemble du réseau vasculaire. Ainsi, il est important que le fond soit prise en considération avant de tenter cette technique.
En fin de compte, la principale limitation de cette procédure est des compétences de dissection d'un individu. Il est important de noter que même si une personne connaît les techniques bien, cela peut prendre plusieurs tentatives avant de commencer à obtenir des résultats cohérents. Ainsi, nous recommandons que le personnel du laboratoire intéressées remplissent plusieurs dissections de pratique pour gagner la confiance et arriver à la meilleure et la plus cohérente approche avant d'effectuer la procédure sur leur tissu expérimental. Il est important de noter que, une fois maîtrisé, la trypsine digest est une technique utile qui peut être utilisé pour évaluer la pathologie vasculaire (figure 4). Trypsine digest peut également être effectuée succèsavec succès sur préservé rétines qui ont été dans un fixateur pendant plusieurs années 1.
En conclusion, la trypsine digest continue d'être une méthode extrêmement utile pour analyser la vascularisation rétinienne depuis sa description par Cogan et Kuwabara dans les années 1960. Il permet la visualisation détaillée de l'ensemble du réseau vasculaire, par rapport à immunofluorescence / H & E / PAS sections colorées, plates-supports et colorant injections. Bien qu'il soit techniquement difficile, ce manuscrit décrit la procédure en détail afin qu'il puisse être effectuée avec succès. En conséquence, nous espérons que les chercheurs débutants à la méthode aura des indications suffisantes pour permettre une analyse efficace et cohérente de la vascularisation rétinienne dans leurs modèles expérimentaux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement financé par le NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Société pour la Prévention de la Cécité (JCC, AAF), les fonds non affectés au Département d'ophtalmologie de la recherche pour prévenir la cécité (RPB), New York et RPB étudiant en médecine Fellowship Grant (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
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