Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

doi: 10.3791/50489 Published: June 13, 2013

Summary

التربسين هضم هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. يصف هذا المخطوط الأسلوب في التفاصيل، بما في ذلك التعديلات الرئيسية لتحسين تقنية وإزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للسفن.

Abstract

التربسين هضم هو الأسلوب معيار الذهب لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين 1-5. فإنه يسمح التصور من شبكة كاملة من ثلاثي الأبعاد الأوعية الدموية في شبكية العين المعقدة والشعيرات الدموية من خلال خلق ثنائية الأبعاد مسطحة جبل من القنوات المترابطة الأوعية الدموية بعد هضم مكونات غير الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يسمح احد لدراسة مختلف التغيرات المرضية الوعائية، مثل microaneurysms، انحطاط الشعرية، والبطانية غير طبيعية إلى نسب خلية حوطية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة صعبة من الناحية التقنية، لا سيما في الفئران، التي أصبحت نموذج حيواني معظم المتاحة على نطاق واسع لدراسة شبكية العين بسبب سهولة التلاعب الجيني 6،7. في العين الماوس، فإنه من الصعوبة بمكان إزالة المكونات غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للأوعية الدموية في شبكية العين. حتى الآن، ليس هناك ندرة في الأدبيات التي تصف هضم تقنية التربسين بالتفصيل أنان الماوس. يقدم هذا المخطوط منهجية خطوة بخطوة مفصل للهضم التربسين في الماوس شبكية العين، في الوقت الذي توفر أيضا نصائح حول مخرج الخطوات الصعبة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تصور الأوعية الدموية في شبكية العين نهجا هاما للغاية لتشريح آليات أمراض العيون المختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري. فإنه يسمح احد لتقييم أقرب شذوذ الأوعية الدموية، بما في ذلك microaneurysms، انحطاط الشعرية، وفقدان خلية حوطية 8،9. حتى الآن، كانت هناك العديد من التقنيات المتقدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. وقد استخدم نضح من مختلف الأصباغ لتسليط الضوء على السفن، ولكن كل تقاسمت قيود مماثلة. حقن نادرا ما يسلط الضوء على الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها ما لم يعطى في الضغط العالي، الذي يهدد بتمزيق واتلاف الاوعية 1. المناعية من بطانة الأوعية الدموية مع fluorophore المسمى G isolectin B4 (اليكسا فلور 594 مترافق؛ I21413؛ إينفيتروجن؛ 1:100 تمييع) يمكن أن يتصاعد وشقة الشبكية تسليط الضوء على البنية الكلية للسفن، ولكن من دون عرض التصور من الشعيرات الدموية والأغشية الطابق السفلي وpericytes . ولوحظ من قبلFriedenwald أن السفن يمكن إبراز بواسطة تلطيخ مسطحة يتصاعد من شبكية العين مع الدوري حمض شيف (PAS) أو الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ 10. ومع ذلك، كان تلطيخ غير محددة إلى السفن وسلطت الضوء على الأنسجة غير والأوعية الدموية وكذلك، مما يجعل من الصعب التفريق بين الأوعية. في 1960s، وضعت كوجان وكوابارا تقنية هضم التربسين التي جعلت من السهل تصور الأوعية الدموية في شبكية العين عن طريق هضم مكونات اوعائي من شبكية العين 1. منذ ذلك الوقت، أصبح التربسين هضم طريقة المعيار الذهبي في تحليل الأوعية الدموية للشبكية العين 2-5. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن تقنيات بديلة أخرى لعزل الأوعية الدموية وقد وصفت. وقد استخدمت استخدام تحلل التناضحي لعزل الأوعية الدموية والسماح الدراسات البيوكيميائية في الأنسجة 11،12، ولكن لم يتم استخدامه الإجراء كوسيلة الأولية للدراسة تشريحية. لقد كان الأسلوب Print الأنسجةتستخدم لعزل قطاعات واسعة من الأوعية الدموية الدقيقة ويسمح للقدرة لدراسة الهندسة المعمارية تيار كهربي من الأوعية الدموية 13. من الناحية النظرية، ويمكن أيضا أن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة التغيرات التشريحية، كما نوعية السفن عالية. ومع ذلك، أنها قادرة على عزل أجزاء من شبكة الأوعية الدموية بأكملها فقط. على الرغم من أن هذه الأساليب لا يمكن أن تحل محل التربسين هضم، فمن المهم أن نلاحظ أن لديهم مزايا وعيوب مختلفة ومكملة في هذا الصدد.

طريقة هضم التربسين يمثل تحديا تقنيا ويصعب تنفيذ باستمرار 6،7. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن التربسين هضم من الصعب خصوصا على نموذج الفأر، ولا سيما إذا كان أحد يرغب في الحفاظ على بنية الأوعية الدموية الشاملة للشبكية العين 6،7. وتشمل التحديات (1) الإفراط في الهضم من شبكية العين الذي يسبب خسارة كل من الأوعية الدموية وكذلك الأنسجة غير والأوعية الدموية، (2) وكيل الهضم، وتتطلبتشريح الميكانيكية واسعة النطاق والتي يمكن أن تؤدي بدورها إلى التلف من السرير السفينة، (3) فصل الفقيرة من الأنسجة غير والأوعية الدموية من الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تلطيخ غير محددة. وقد أبرزت العديد من المخطوطات لهذه التحديات، ولكن قدمت بلا بروتوكول مفصلة ومتسقة للتغلب عليها 14،15. وهذه المخطوطة تقديم منهجية خطوة بخطوة تفاصيل تقنية لتنفيذ التربسين هضم في شبكية العين الماوس والفئران مع نصائح محددة بشأن التعامل مع خطوات صعبة بشكل خاص. يتم عرض لمحة التخطيطي في الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تحضير الشبكية

  1. استأصل العين الماوس. باستخدام يد واحدة، فتح الجفون بحيث العين مرئيا. مع من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ملقط المنحني (صعودا تواجه المنحني)، والضغط على الجوانب الأعلى والأدنى من المدار حتى يبرز العالم. إغلاق بلطف ملقط في الجانب الخلفي من العين ورفع في حركة مستمرة لاستأصل العين.
  2. إصلاح العين مع 10٪ محايدة مخزنة الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
  3. مكان العين في حل PBS في طبق بتري الصغيرة.
  4. تشريح خارج شبكية العين بعناية تحت المجهر، مع الحرص على تجنب إحداث الدموع كبيرة. إجراء الخفض الأولي في القرنية مع مقص تشريح. ثم، في حين الضغط على منطقة قطع مع ملقط على التوالي، واستخدام مقص لقطع على طول الحدود بين القرنية والصلبة إزالة القرنية. باستخدام ملقط غرامة المنحنية والمستقيمة، بعناية قشر الصلبة والمشيمية بعيدا عن الشبكية نحو العصب البصري. هذه الخطوة يتطلب الصبر كمايمكن بسرعة الافراج عن الشبكية يؤدي إلى الدموع. إزالة العدسة والقزحية أي الزائد والحطام من شبكية العين 16.

2. يغسل الماء

  1. مكان شبكية العين في صحن 24 أيضا، وتغطي مع الماء (حوالي 500 ميكرولتر وتصفيتها مع ما لا يقل عن مرشح ميكرون 45).
  2. تغيير الماء كل 30 دقيقة، 1 ساعة، 4-5 مرات على الأقل.
  3. ترك بين عشية وضحاها في الماء مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة: الخطوات غسل مهمة جدا لأنها تساعد فصل طبقات الشبكية العصبية من الأوعية الدموية.

3. التربسين دايجست

  1. إزالة المياه وشبكية العين احتضان في محلول 3٪ التربسين (Difco 1:250) في 0.1 م تريس العازلة (درجة الحموضة 7.8) عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف للا. اكتمال التربسين هضم عندما تبدأ الأنسجة التي تظهر عليها علامات التفكك (حوالي 1.5 ساعة).
    ملاحظة: تجنب المصافحة السريعوهذا يمكن أن يتلف الأوعية الدموية.
  2. بعناية، ماصة من التربسين إلى منفصلة جيدا باستخدام المجهر لتجنب لمس شبكية العين. هذا التربسين الزائدة يمكن استخدامها في وقت لاحق، عند التعامل مع السفن تحت المجهر، في الخطوة 4.3.

4. فصل الأوعية الدموية

  1. إضافة الماء المصفى إلى شبكية العين. ثم، محاولة لتقشر الغشاء الداخلي يحد بالملقط، وذلك باستخدام مقص إذا لزم الأمر. يهز مع الإثارة خفيفة لمدة 5 دقائق. بعناية، ماصة خارج الماء تحت المجهر لتجنب إتلاف شبكية العين.
  2. كرر يغسل الماء (لمدة 5 دقائق لكل منهما) للمساعدة في الافراج عن شبكة من الأوعية من الأنسجة الشبكية ملتصقة. يتم الانتهاء من يغسل الماء عندما يكون هناك قليل من دون الحطام المتبقي في الماء بعد الغسيل.
  3. وهناك حاجة إلى التلاعب حذرا تحت المجهر تشريح الآن إلى مزيد من تحرير شبكة من الأوعية. وفيما يلي العديد من التقنيات المفيدة، التي يمكن استخدامها في تسلسل أو دائرة الهجرة والجنسيةividually لتحقيق النتيجة المرجوة على أساس تفضيل التقنية:
    1. باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة بعناية الماء صعودا وهبوطا المتاخمة للسفن، تهب المياه في الأوعية، مما تسبب في الإثارة لطيف.
    2. باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة التربسين صعودا وهبوطا للمساعدة في الجدران معطف من ماصة. ثم، ماصة بعناية شبكة السفينة بأكمله صعودا وهبوطا مرة واحدة للمساعدة في كسر الأنسجة غير والأوعية الدموية.
      ملاحظة: يمكن توسيط طرف ماصة في العصب البصري بدلا من حواف شبكة الأوعية الدموية أيضا منع الأوعية الدموية من الالتصاق إلى الحافة.
    3. رفع بلطف الأوعية الدموية مع ملقط غرامة للخروج من الماء لطرد عناصر غير والأوعية الدموية.
    4. إذا لم يعمل الخطوات المذكورة أعلاه، إضافة التربسين إلى الشبكية للمساعدة في تحطيم الأنسجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لعدة دقائق. ثم، وإزالة التربسين وكرر الخطوات من 4،1-4،3.

<STRONG> ملاحظة: تأكد من معطف جميع الصكوك التي سوف تأتي في اتصال مع السفن في التربسين (مثل ماصة، ملقط). وهذا سوف يساعد على تجنب التصاق من الأوعية الدموية إلى المعدات.

5. تصور الأوعية الدموية

  1. وضع قطرة من الماء على شريحة نظيفة. باستخدام ماصة ميكرولتر 200 أو ملقط، نقل السفن هضمها في الماء. تأكد من تكشفت الأوعية الدموية مسطحة جبل. والتوتر السطحي للماء يساعد على تتكشف شبكة الأوعية الدموية الآن شفاف. إذا لم تتكشف الأنسجة، وإضافة كميات إضافية من الماء ويهز بلطف الشريحة لتسهيل تتكشف.
  2. إزالة المياه الزائدة ببطء شديد من قبل pipetting أو باستخدام منشفة ورقية.
  3. تسمح الشرائح لتجف تماما.
  4. وصمة عار الشرائح عبر البروتوكول المناسب إما مع PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E وصمة عار.
    ملاحظة: PAS / الهيماتوكسيلين مفيد لتحديد جدار الوعاء الدموي والنوى الخلوية؛ H & E مفيد لدemonstration من RBC كذلك.
  5. يذوى وجبل (Permount تصاعد متوسطة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المنتج النهائي من إجراء الناجح هو جبل المسطح من شبكة كاملة من الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس، مع الحفاظ على العمارة، ملطخة إما PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E، كما هو موضح في الشكلين 2-4. تمايز واضح من الخلايا البطانية وpericytes يمكن أن ينظر إليه كما هو مبين في الشكل (3). في شبكية العين، ونوى الخلايا البطانية بيضاوية أو ممدود وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. نواة خلية حوطية صغيرة، كروية، وصمة عار المكتظة وعموما لديهم موقف ناشز على طول الجدار الشعرية.

التربسين هضم هو إجراء شائع لتحليل الأوعية الدموية أمراض السكري في النماذج الحيوانية. وقد وصفت الآفات الوعائية مرضية مثل microaneurysms، وأشباح خلية حوطية (دليل على فقدان خلية حوطية)، ديكي الشعيرات الدموية والضمور الشعرية. ويبين الشكل 4 مثالا للانحطاط شعري ينظر في الماوس ديسيبل / ديسيبل، نموذجا للنوع الثاني من مرض السكري. على الرغم من أن الإجراء على النحو الأمثل لشبكية العين الماوس، كما تم الحصول على نتائج مماثلة في شبكية العين الفئران كما هو مبين في الشكل 5. من المهم أن نلاحظ أن شبكية العين الفئران هي أكبر من ذلك بكثير، وكان يستخدم لوحة 12 أيضا بدلا من 24 لوحة جيدا. شبكة الأوعية الدموية في شبكية العين الفئران هي أيضا أقل هشاشة من نظيره الماوس.

فمن الأهمية بمكان للغاية لإزالة أكبر قدر من الأنسجة والأوعية الدموية غير ممكن. وسوف أي بقايا تؤدي إلى تلطيخ غير محددة ويؤدي إلى سوء التصور من الأوعية الدموية. يمثل الشكل 6 مثال على إزالة فاشلة من الأنسجة والأوعية الدموية غير كامل في الخطوة 4. وبالمثل، فإنه من المهم أيضا أن يكون أن تكشفت شبكية العين عند تركيب وذلك لتحسين التصور من الأوعية الدموية. الشكل 7 يمثل ناجحة تتكشف من الأوعية الدموية مسطحة جبل في الخطوة 5.1.

لدى عودتهم 1 "FO: محتوى العرض =" 5.75in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/>
الشكل 1. . التخطيطي من التربسين بروتوكول دايجست (1) إعداد الشبكية: عزل شبكية العين من العين، (2) يغسل الماء: تغسل في ماء تصفيتها بين عشية وضحاها، (3) التربسين دايجست: احتضان في التربسين 3٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 1-1.5 ساعة؛ (4) فصل الأوعية الدموية: عزل الأوعية الدموية عن طريق سلسلة من يغسل الماء وتشريح تحت المجهر، (5) نقل الأوعية الدموية على الانزلاق واسمحوا الجافة؛ (6) تصور الأوعية الدموية:. الشريحة وصمة عار مع PAS أو H & E، يذوى وجبل اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. السيطرة ديسيبل / م الماوس التربسين هضم (H & E، 20X).هذا الرقم هو لمحة عامة عن شبكة الأوعية الدموية في شبكية العين تبين العمارة الأوعية الدموية الطبيعية.

الشكل (3)
الشكل (3). السيطرة ديسيبل / م الماوس التربسين هضم (H & E، 600X). هذه نسخة مكبرة من شبكية العين في الشكل 2 يظهر العمارة الأوعية الدموية الطبيعية. ويسلط الضوء على الخلايا البطانية (أبيض السهم) وخلية حوطية (السهم الأسود).

الشكل 4
الشكل 4. السكري ديسيبل / ديسيبل الماوس التربسين هضم (H & E، 500X). بنسبة 52 أسابيع، ديسيبل / ديسيبل الفئران تبدأ في تطوير علم الأمراض الوعائية مثل تنكس الشعرية (السهم الأبيض).

الرقم 5
الشكل 5. الفئران العاديةشبكية العين التربسين هضم، (PAS، 20X [أ]، 100X [ب]). نظرة عامة وصورة مكبرة من شبكة الأوعية الدموية الفئران العادية.

الشكل (6)
الشكل (6). السيطرة C57/Bl6 الماوس التربسين هضم، والأنسجة والأوعية الدموية غير سليمة (H & E، 20X [أ]، 100X [ب]). مع الفقراء إزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية، وهناك تلطيخ غير محددة التصور إضعاف الأوعية.

الرقم 7
الرقم 7. السيطرة ديسيبل / م الماوس التربسين هضم، وضعف التركيب (H & E، 20X). إذا لم يتم كشف شبكية العين على نحو كاف، وهناك غير كافية التصور من شبكة الأوعية الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التربسين هضم هي طريقة قياسية لتقييم الأوعية الدموية في شبكية العين. لسوء الحظ، فإنه يمثل تحديا تقنيا ويمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل فقدان العينة إذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء صعب وخاصة في الفئران، والتي يمكن أن تحد من تطبيق هذه التقنية في النماذج الحيوانية الوراثية شيوعا من أمراض العيون. وتقدم هذه الورقة توجيهات بشأن كيفية تنفيذ الإجراء بفعالية وباستمرار في عيون الماوس.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، من المهم أن يتم تشريح شبكية العين بعناية لتجنب أي الدموع كبير، للتأكد من أن شبكة الأوعية الدموية لا تزال سليمة. الثانية، وغسل شبكية العين في الماء المصفى هو بين عشية وضحاها مهم لأنه يساعد منفصلة طبقات neuroretinal من الأوعية الدموية، مما يسهل على فصل أسهل بعد التربسين هضم. والتعديل الوحيد الذي يمكن أن يعجل عملية تكون لوضع شبكية العين في 1٪ ثلاثيطن X-100 مختلطة في الماء المصفى لمدة 1-2 ساعة. ثم، التربسين هضم يمكن أن يؤديها في نفس اليوم بعد سلسلة من الماء يغسل لإزالة تريتون اكس.

فمن المهم أن أنسجة الشبكية يتم رصدها باستمرار خلال التربسين هضم من أجل تجنب انحلال غير مقصود من الأنسجة الأوعية الدموية. وبناء على تجربتنا، وحول 1-1.5 ساعة كافية لإنجاز عملية الهضم من الأنسجة العصبية، مع الحفاظ على الأوعية الدموية سليمة. هناك حاجة إلى وقت أقل للفئران الأصغر سنا. الهز لطيف لا يمكن أن يؤديها خلال التربسين هضم للمساعدة في تسهيل فصل الأوعية الدموية من الأنسجة المتبقية، ولكن ليس من الضروري. ومن المهم تجنب الانفعالات قوية وهذا يمكن أن يؤدي إلى تمزق في الأوعية.

الخطوات الحاسمة التي تتطلب أكبر قدر من الاهتمام تنطوي على فصل الأوعية الدموية بعد التربسين الهضم. عند أداء يغسل الماء، فمن المهم تجنب pipetting لالأوعية الدموية. pipetting لمنيجب فقط أن تستخدم الأوعية الدموية كوسيلة لفصل الأوعية الدموية بعد أن تم المغلفة الجدران مع التربسين. تحتاج كل التلاعبات الذي يتعين القيام به بعناية تحت المجهر تشريح باسم شبكة من الأوعية يمكن أن تتلف بسهولة. التقنيات المختلفة هو موضح في الخطوة 4 يمكن أن تستخدم بنجاح في مجموعة متنوعة من التشكيلات. في نهاية المطاف، وسوف يكون ما يصل الى المجرب الفردية للعثور على النهج الذي يعمل على نحو أفضل بالنسبة لهم. من المهم أن جميع الأدوات التي سوف تأتي في اتصال مع الأوعية الدموية تكون مغلفة مع التربسين. يمكن غمس الأدوات بشكل متقطع وغالبا في التربسين أثناء إجراء منع التصاق من اضطراب الأوعية الدموية والمحتملين.

فعالية هذا الإجراء هو أيضا تعتمد على نموذج الفأر الخلفية. بعض الخلفيات الماوس ليست مواتية كما في الحفاظ على شبكة الأوعية الدموية بأكملها. على سبيل المثال، على خلفية FVB هو متماثل لطفرة فسفودايستراز-6 مما يجعلها عرضة للإعادةتنكس tinal 17. من تجربتنا، وجدنا أن الأوعية الدموية في شبكية العين الخاصة بهم هي بطبيعتها أكثر هشاشة، وكنا قادرين على المحافظة على شبكة الأوعية الدموية بأكملها. وبالتالي، فمن المهم أن الخلفية أن تؤخذ بعين الاعتبار قبل محاولة هذه التقنية.

في نهاية المطاف، والقيد الرئيسي لهذا الإجراء هو تشريح مهارات الفرد. ومن المهم أن نلاحظ أنه حتى إذا كان هناك شخص يعرف جيدا تقنيات، قد يستغرق عدة محاولات قبل أن تبدأ في تحقيق نتائج متسقة. وبالتالي، فإننا نوصي أن أفراد المختبر المهتمة تنفيذ العديد من تشريح الممارسة لاكتساب الثقة والتوصل إلى نهج أفضل وأكثر اتساقا قبل تنفيذ الإجراء على أنسجتهم التجريبية. ومن المهم أن نلاحظ أنه يتقن مرة واحدة، التربسين هضم هو أسلوب القيمة التي يمكن استخدامها لتقييم الأوعية الدموية علم الأمراض (الشكل 4). ويمكن أيضا التربسين هضم أن يؤديها يمثcessfully على الحفاظ على شبكية العين التي كانت في تثبيتي لعدة سنوات 1.

في الختام، لا تزال التربسين هضم لتكون وسيلة مفيدة للغاية لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين منذ وصفه من قبل كوجان وكوابارا في 1960s. انها تسمح برؤية مفصلة من شبكة الأوعية الدموية بأكملها، بالمقارنة مع المناعي / H & E / PAS أقسام الملون، مسطحة يتصاعد وصبغ الحقن. على الرغم من أنه من الصعب من الناحية الفنية، يصف هذا المخطوط الإجراء بالتفصيل بحيث لا يمكن أن يؤديها بنجاح. ونتيجة لذلك، نأمل أن المحققين المبتدئين إلى الأسلوب ديك إرشادات كافية للسماح للتحليل ناجحة ومتسقة من الأوعية الدموية في شبكية العين في نماذجها التجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1-EY019951 (AAF)، جمعية إلينوي للوقاية من العمى (JCC، AAF)، والأموال غير المقيد إلى قسم العيون من البحوث للوقاية من العمى (RPB)، NY وRPB الطبية زمالة طالب المنحة (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047
Microscope Slides VWR 82027-132

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. Chapter 30. Diabetic Retinopathy. Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156, (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  18. The Jackson Laboratory [Internet]. Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).More

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter