Summary
트립신 다이제스트 망막 혈관을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 원고는 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 기술을 최적화하고 비 혈관 조직을 제거 키 변경 등 세부 방법을 설명합니다.
Abstract
트립신 다이제스트는 망막 혈관 1-5 분석하는 황금 표준 방법입니다. 이것은 망막의 비 혈관 구성 요소의 소화 한 후 상호 혈관 채널의 2 차원 평면 마운트를 작성하여 복잡한 3 차원 망막 혈관과 모세 혈관의 전체 네트워크를 시각화 할 수 있습니다. 이것은 하나의 같은 microaneurysms 등 다양한 병리학 적 혈관 변화, 모세 혈관 변성 및 혈관 주위 세포 비율에 비정상적인 내피 세포를 연구 할 수 있습니다. 그러나, 메소드는 때문에 유전자 조작 6,7의 용이성의 망막을 연구하는 데 가장 널리 사용되는 동물 모델이 있고, 특히 생쥐에서, 기술적 도전이다. 마우스의 눈에서는 망막 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 완전히 비 혈관 구성 요소를 제거하는 것이 특히 어렵습니다. 지금까지, 세부 사항에 트립신 다이제스트 기술을 설명 문학의 부족이 난마우스를 명. 또한 어려운 단계의 문제를 해결에 대한 도움말을 제공하는 동안이 원고 마우스 망막에 트립신 다이제스트의 자세한 단계별 방법을 제공합니다.
Introduction
망막의 혈관을 시각화하는 등 당뇨 망막 병증 등 다양한 안과 질환의 메커니즘을 해부하는 매우 중요한 방법입니다. 그것은 하나의 microaneurysms, 모세 혈관 변성 및 혈관 주위 세포 손실 8,9 등 초기 혈관 이상을 평가할 수 있습니다. 지금까지, 망막 혈관을 분석하기 위해 개발 된 여러 가지 기술이 있었다. 다양한 염료의 혈류가 혈관을 강조하기 위해 사용되었지만, 모두 비슷한 한계를 공유했습니다. 선박 1 파열 및 손상 위험이 높은 압력에서 제공하지 않는 주사는 거의 전체 망막 혈관을 강조합니다. 형광 표지 된 G의 B4 isolectin (; I21413, Invitrogen의, 복합 알렉사 플 루어 594 1:100 희석)와 혈관 내피 세포의 면역 염색 및 망막 평면 마운트하면 혈관의 전반적인 구조를 강조하지만, 모세 혈관의 상세한 시각화, 기저막과 혈관 주위 세포없이 할 수 있습니다 . 그것은에 의해 관찰되었다혈관 정기 산 쉬프 (PAS) 또는 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색을 10으로 망막의 평면 마운트 염색에 의해 강조 할 수 Friedenwald. 그러나 염색은 혈관에 비 특이뿐만 아니라 비 혈관 조직을 강조 어려운 혈관을 차별화하고 있습니다. 1960 년대에, 코간와 쿠와 바라보다 쉽게 망막 1 혈관성 구성 요소를 소화하여 망막 혈관을 시각화 한 트립신 다이제스트 기술을 개발했다. 그 이후, 트립신 다이제스트 망막 2-5의 혈관을 분석하는 황금 표준 방법이되었다. 그러나, 그것은 혈관을 분리 할 수있는 다른 대체 기술이 기술되었다 것을주의하는 것이 중요합니다. 삼투 용해의 사용은 혈관을 분리하고 조직 11,12의 생화학 적 연구를 허용하는 데 사용되었지만, 절차는 해부학 적 연구를위한 주요 방법으로 사용되지 않았습니다. 조직의 인쇄 방법은있다미세 혈관의 큰 세그먼트를 분리하는 데 사용하고 혈관 13 electrotonic 구조를 연구 할 수있는 기능을 할 수 있습니다. 이론적으로,이 기술은 또한 혈관의 품질이 높은대로, 해부학 적 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 그것은 단지 혈관의 전체 네트워크 세그먼트를 분리 할 수 있습니다. 이러한 방법 트립신 다이제스트를 대체 할 수 있지만, 그것은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있으며이 점에서 보완하는 것이 중요하다.
트립신 다이제스트 방법은 기술적으로 도전하고 지속적으로 6,7 수행하기가 어렵습니다. 또한, 그것은 하나의 욕망 망막 6,7의 전체 혈관 구조를 보존하는 경우 특히 트립신 다이제스트, 마우스 모델에 특히 어렵다는 것을 지적하고있다. 과제 요구 (1) 혈관뿐만 아니라 비 혈관 조직 모두의 손실을 일으키는 원인이되는 망막의 이상 소화, (2)에 따라 소화를 포함의 혈관 침대의 손상, 비특이적 염색으로 이어지는 혈관의 비 혈관 조직 (3)별로 분리로 이어질 돌 수 있었다 광범위한 기계적 박리. 몇몇 원고는 이러한 문제를 강조, 그러나 아무도 그들에게 14,15을 극복하기 위해 상세하고 일관된 프로토콜을 제공했다. 이 원고는 특히 어려운 단계를 처리에 대한 구체적인 팁 마우스 및 쥐의 망막에 트립신 다이제스트를 수행하는 방법을 자세히 설명하는 단계별 방법을 소개합니다. 개략도는 그림 1에 표시됩니다.
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Protocol
1. 망막 준비
- 마우스 눈을 명백히. 한 손으로 사용하면 눈이 볼 수 있도록 눈 뚜껑을 엽니 다. 다른 손으로, 곡선 포셉 (곡선에 직면 위쪽)를 사용하여 궤도의 우수하고 열등한 측면에 압력을 세계 돌출 될 때까지. 부드럽게 눈의 후방 측면에서 집게를 닫고 눈을 명백히하는 연속 동작으로 들어 올립니다.
- 중립 10 %가 최소 24 시간 동안 포르말린에 눈을 고정합니다.
- 작은 페트리 접시에 PBS 용액에 넣어 눈.
- 큰 눈물을 유발하지 않도록주의하면서 현미경으로 조심스럽게 망막을 해부하다. 해부 가위로 각막 초기 상처를합니다. 그런 다음, 바로 집게로 잘라 내기 영역을 잡고, 각막을 제거 각막과 공막의 국경을 따라 잘라 가위를 사용합니다. 주의 공막 멀리 시신경으로 망막 맥락막 껍질, 고급 곡선과 직선 집게를 사용. 이 단계는 인내심이 필요합니다신속하게 망막을 해제하면 눈물을 초래할 수 있습니다. 렌즈와 망막 16 일부터 초과 아이리스와 이물질을 제거합니다.
2. 물은 씻는다
- 24 잘 접시에 물 (최소 45 μm의 필터로 여과 약 500 μL)와 커버 장소 망막.
- , 매 30 분 - 1 시간 이상 4-5 번 물을 변경할 수 있습니다.
- 실온에서 부드럽게 흔들어 물에 하룻밤 둡니다.
참고 :이 혈관에서 신경 망막 층을 분리하는 데 도움이로 세척 단계는 매우 중요합니다.
3. 트립신 다이제스트
- 37 0.1 M 트리스 버퍼 (산도 7.8)의 3 % 트립신 (Difco 1:250)의 솔루션 ° C없이 흔들림에 부드러운로 물과 부화 망막을 제거합니다. 조직이 붕괴의 징후 (약 1.5 시간)를 보여주는 시작할 때 트립신 다이제스트가 완료됩니다.
참고 : 빠른 동요를 피해야이 혈관을 손상시킬 수 있으므로. - 조심스럽게 망막에 손이 닿지 않도록 현미경을 사용하여 잘 분리에 트립신 아웃 피펫. 4.3 단계에서 현미경 혈관을 조작 할 때이 초과 트립신은 나중에 사용할 수 있습니다.
4. 혈관을 분리
- 망막에 정수 된 물을 추가합니다. 그런 다음, 필요한 경우 가위를 사용하여 집게로 내 경계 막 벗기는 시도합니다. 5 분 동안 가벼운 동요 동요. 조심스럽게 망막 손상을 방지하기 위해 현미경으로 물을 피펫.
- 부착 망막 조직에서 혈관의 무료 네트워크를 돕기 위해 물 세척 (5 분마다)를 반복합니다. 세척 후 물에 남아있는 파편 거의가있을 때 물 세척이 완료됩니다.
- 해부 현미경 하에서 조심 조작은 현재 혈관의 네트워크까지 더 무료로 필요합니다. 아래의 순서 나 공업에서 사용될 수있는 몇 가지 유용한 기술이 있습니다ividually 기술 선호도에 따라 원하는 결과를 달성하기 위해 :
- 200 μL 피펫을 사용하여 조심스럽게 교반을 일으키는 원인이 혈관에 물을 불고, 아래로 인접한 혈관에 물을 피펫.
- 200 μL 피펫 사용하여 피펫의 코트 벽을 돕기 위해 아래 트립신을 피펫. 그런 다음 조심스럽게 비 혈관 조직을 무너 뜨리는 데 도움이 한 번 용기 전체 네트워크를 피펫 아래.
참고 : 오히려 혈관 네트워크의 가장자리보다 시신경에 피펫 팁을 중심으로하여도 끝까지 고집에서 혈관을 방지 할 수 있습니다. - 부드럽게 비 혈관 구성 요소를 꺼 내려 물 밖으로 미세 집게로 혈관을 올립니다.
- 위의 단계가 작동하지 않으면 조직을 분해하는 데 도움이, 그리고 몇 분 동안 37 ° C에서 배양 망막에 트립신을 추가합니다. 그런 다음, 트립신을 제거하고 단계 4.1-4.3를 반복합니다.
<강해> 참고 : 코트 트립신의 혈관 (예 : 피펫 팁, 집게)과 접촉하는 모든 악기에 있는지 확인합니다. 이 장비에 혈관의 부착을 방지하는 데 도움이됩니다.
5. 혈관을 시각화
- 깨끗한 슬라이드에 물 한 방울을 넣습니다. 200 μL 피펫이나 집게를 사용하여 물에 소화 혈관을 전송할 수 있습니다. 확인 혈관 평면 마운트는 전개된다. 물의 표면 장력은 이제 투명한 혈관 네트워크를 전개하는 데 도움이됩니다. 조직이 전개되지 않는 경우, 추가 물을 추가하고 부드럽게 전개 촉진하기 위해 슬라이드를 흔들어.
- 종이 타월을 피펫 또는 사용하여 매우 느리게 과잉의 물을 제거합니다.
- 슬라이드가 완전히 건조하도록 허용합니다.
- PAS / 헤 마톡 실린이나 H & E 염색 하나를 사용하여 해당 프로토콜을 통해 슬라이드를 얼룩.
참고 : PAS / 헤 마톡 실린은 혈관 벽 세포의 핵을 식별하는 데 유용합니다, H & E는 D에 유용합니다RBC의 emonstration뿐만 아니라. - (글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입이 매체를 장착) 탈수 및 마운트합니다.
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Representative Results
성공적인 절차의 최종 제품은 그림 2-4에서와 같이 아키텍처, PAS / 헤 마톡 실린이나 H & E 염색을하거나, 유지와 마우스 망막 혈관의 네트워크 전체의 평면 마운트입니다. 그림 3과 같이 내피 세포와 혈관 주위 세포의 감별법을 볼 수 있습니다. 망막 내피 세포의 핵은 타원형 또는 길쭉한하고 혈관 벽 내에 완전히 거짓말. 혈관 주위 세포의 핵은 작고, 구형, 밀도 얼룩 일반적으로 모세관 벽을 따라 돌출 위치에 있습니다.
트립신 다이제스트는 당뇨병 동물 모델에서 혈관 병리를 분석하는 일반적인 절차입니다. 같은 microaneurysms, 혈관 주위 세포 유령 (혈관 주위 세포 손실 증거), 무세 포성 모세 혈관과 모세 혈관 변성 등의 병리 혈관 병변을 설명하고 있습니다. 그림 4는 DB / DB 마우스에서 볼 모세 혈관 변성 유형에 대한 모델의 예를 보여줍니다 당뇨병. 프로 시저를 마우스 망막에 최적화되었지만 그림 5와 같이 유사한 결과는 쥐의 망막에서 얻은되었습니다. 그것은 쥐의 망막이 훨씬 큰 것을주의하는 것이 중요하고, 12 웰 플레이트 대신 24 - 웰 플레이트의 사용되었다. 쥐의 망막의 혈관 네트워크는 마우스 대응보다 허약하다.
그것은 가능한 비 혈관 조직의 많은을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 모든 나머지는 비특이적 염색으로 이어질 혈관의 가난한 시각화로 이어집니다. 그림 6은 4 단계에서 전체 비 혈관 조직의 실패 제거의 예를 나타냅니다 것입니다. 마찬가지로, 혈관의 시각화를 개선하는만큼 장착 할 때 망막 전개 할 수있을 것도 중요하다. 그림 7 단계 5.1에서 혈관 평면 마운트의 전개 실패를 나타냅니다.
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그림 1. . 트립신 다이제스트 프로토콜의 도식 (1) 망막 준비 : 눈에서 망막을 분리 (2) 물 세척 : 하룻밤 여과 물 세척 (3) 트립신 다이제스트 : 부화 37 3 % 트립신의 ° ~ 1.5 시간 동안 C; (4) 혈관을 분리 : 현미경 물 세척 및 박리의 시리즈를 통해 혈관을 분리, (5)를 밀어 건조하게 혈관으로 이동, (6) 혈관 시각화 :. PAS 또는 H & E와 얼룩 슬라이드 탈수 및 마운트를 여기를 클릭 더 큰 그림을 볼 수 있습니다 .
그림 2. 제어 DB / m 마우스 트립신 다이제스트 (H & E 20 배).이 그림은 정상 혈관 구조를 보여주는 망막 혈관 네트워크의 개요입니다.
그림 3. 제어 DB / m 마우스 트립신 다이제스트 (H & E, 600X). 이것은 정상적인 혈관 구조를 보여주는 그림 2의 망막의 확대보기입니다. 내피 세포 (흰색 화살표)과 혈관 주위 세포 (검은 색 화살표)가 강조 표시됩니다.
그림 4. 당뇨병 DB / DB 마우스 트립신 다이제스트 (H & E, 500X)가. 52주으로 DB / DB 마우스는 모세 혈관 변성 (흰색 화살표)로 혈관 병리를 개발하기 시작합니다.
그림 5. 정상 쥐망막 트립신 다이제스트 (PAS, 20X [A], 100 배 [B]). 정상 쥐의 혈관 네트워크의 개요 및 확대 이미지입니다.
그림 6. 제어 C57/BL6 마우스 트립신 다이제스트, 비 혈관 손상 조직 (H & E, 20 배 [A], 100 배 [B]). 비 혈관 조직의 가난한 제거로, 혈관의 비특이적 염색을 방해하는 시각화있다.
그림 7. 망막이 적절하게 전개되지 않은 경우 제어 DB / m 마우스 트립신 소화 불량 설치 (H & E, 20X)가., 혈관 네트워크의 불충분 한 시각화가있다.
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Discussion
트립신 다이제스트는 망막의 혈관을 평가하는 표준 방법입니다. 불행히도, 기술적으로 도전하고 정확하게 수행이되지 않을 경우, 시료 손실의 높은 비율이 발생할 수 있습니다. 또한, 절차는 안과 질환의 일반적으로 사용되는 유전자 동물 모델에서이 기술의 적용을 제한 할 수있는 마우스에서 특히 어렵습니다. 이 논문은 마우스 눈에 효과적이고 지속적으로 절차를 수행하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.
프로토콜 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 망막 혈관 네트워크가 그대로 유지되도록하기 위해, 어떤 큰 눈물을 피하기 위해 조심스럽게 해부하는 것이 중요합니다. 이 트립신 소화 후 쉽게 분리를 용이하게 혈관에서 시신경 층 분리하는 데 도움이 둘째, 여과수의 망막을 세척하는 것은 하룻밤 중요합니다. 이 과정을 촉진 수있는 하나의 수정은 1 %의 세 배에 망막을 배치하는 것톤 X-100은 1 ~ 2 시간 동안 여과 물에 혼합. 그런 다음, 트립신 다이제스트 물 일련의 후 같은 날 수행 할 수있는 것은 트리톤 X를 제거하는 세척
그것은 망막 조직은 혈관 조직의 부주의 용해를 방지하기 위해 트립신 다이제스트 동안 지속적으로 모니터링하는 것이 중요합니다. 혈관은 그대로 유지하면서 우리의 경험에 근거하여, 1.5 정도 시간이 신경 조직의 소화를 달성하기에 충분합니다. 적은 시간은 젊은 쥐에 필요합니다. 부드러운 흔들림이 남아있는 조직에서 혈관의 분리를 용이하게하는 데 도움이되는 트립신 다이제스트 동안 수행하지만, 필요하지 않습니다 수 있습니다. 이 혈관을 찢어로 이어질 수로 강한 교반을 방지하는 것이 중요합니다.
가장주의를 요하는 중요한 단계는 트립신 소화 후 혈관을 분리 포함한다. 물 세척을 수행 할 때, 그것은 혈관을 피펫하지 않도록하는 것이 중요합니다. 의 피펫혈관은 벽을 트립신으로 코팅 한 후 혈관을 분리하는 방법으로 사용되어야한다. 혈관의 네트워크가 쉽게 손상 될 수있는 모든 조작은 해부 현미경으로 신중하게 수행해야합니다. 4 단계에서 설명한 다른 기술은 다양한 조합에서 성공적으로 사용할 수 있습니다. 궁극적으로, 그것은 그들을 위해 최선을 작동하는 방법을 찾기 위해 각각의 실험 될 것이다. 그것은 혈관과 접촉하는 모든 도구가 트립신로 코팅하는 것이 중요합니다. 절차를 수행하는 동안 트립신에 간헐적으로 자주 도구를 담그는 것은 혈관과 잠재적 중단의 부착을 방지 할 수 있습니다.
절차의 효과는 배경 마우스 모델에 따라 달라집니다. 일부 마우스 배경은 전체 혈관 네트워크를 유지하는 등 공헌 없습니다. 예를 들어, FVB 배경을 다시하기가 쉬운 만드는 포스-6 돌연변이 동형이다tinal 변성 17. 우리의 경험에서, 우리는 그들의 망막 혈관이 본질적으로 취약한 것으로 나타났습니다, 우리는 혈관 네트워크 전체를 보존 할 수 없습니다. 따라서, 배경이이 기술을 시도하기 전에 고려하는 것이 중요합니다.
궁극적으로,이 절차의 주요 제한은 개인의 해부 기술이다. 그것은 개인이 아니라 기술을 알고있는 경우에도 그들이 일관된 결과를 달성하기 위해 시작하기 전에, 그것은 몇 가지 시도 걸릴 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 관심 실험실 직원이 자신감을 얻고 자신의 실험 조직의 절차를 수행하기 전에 최고의 그리고 가장 일관성있는 접근 방식에 도달하기 위해 몇 가지 연습 해부를 수행하는 것이 좋습니다 것입니다. 한 번 마스터, 것을주의하는 것이 중요합니다, 트립신 다이제스트 혈관 병리 (그림 4) 평가하는 데 사용할 수있는 유용한 기술입니다. 트립신 다이제스트는 SUC 수행 할 수 있습니다cessfully에 몇 년 1 정착액에왔다 망막을 유지.
결론적으로, 트립신 다이제스트는 1960 년대에 코간와 쿠와 바라에 의하여 그것의 설명부터 망막 혈관을 분석 할 수있는 매우 유용한 방법이 될 것을 계속한다. 면역 / H & E / PAS 염색 부분, 평면 마운트 및 염료 주사에 비해 그것은 전체 혈관 네트워크의 상세한 시각화 할 수 있습니다. 기술적으로 어렵지만 성공적으로 수행 할 수 있도록,이 원고는 세부 절차를 설명합니다. 결과적으로, 우리는 방법 초보자 연구자들은 실험 모델에서 망막 혈관의 성공과 일관성있는 분석을 할 수 있도록 충분한 지침이있을 것이라는 점을 희망한다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 NIH RO1-EY019951 (AAF), 실명 예방 일리노이 학회 (JCC, AAF), 실명 (RPB)를 방지하는 연구에서 안과에 무제한 자금, NY 및 RPB 의료 학생 친목 부여에 의해 지원되었다 (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
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