Summary
Трипсин дайджеста является одним из наиболее широко используемых методов анализа ретинальных сосудов. Эта рукопись описывает способ, в деталях, в том числе ключевых изменений для оптимизации техники и удалить не-сосудистой ткани, сохраняя при этом общую архитектуру сосудов.
Abstract
Трипсин дайджеста является золотым стандартом метод анализа сосудистой сети сетчатки 1-5. Это позволяет визуализировать всю сеть сложных трехмерных кровеносных сосудов сетчатки и капилляров путем создания двумерной плоской горы взаимосвязанных сосудистые каналы, после переваривания несосудистые компонентов сетчатки. Это позволяет изучать различные патологические изменения сосудов, таких как микроаневризмы, капиллярные дегенерации, и аномальные эндотелиальных к перицитами соотношениях. Тем не менее, этот метод является технически сложным, особенно у мышей, которые стали наиболее широко доступны животная модель для изучения сетчатки из-за легкости генетических манипуляций 6,7. У мышей глаз, это особенно трудно полностью удалить несосудистые компонентов при сохранении общей архитектуры кровеносных сосудов сетчатки. На сегодняшний день существует нехватка литературы, описывающий технику трипсина дайджест подробно яп мыши. Эта рукопись содержит подробный шаг за шагом методологии трипсина дайджеста в сетчатке мышей, а также предоставляет советы по устранению неисправностей трудных шагов.
Introduction
Визуализация сосудистой сети сетчатки является чрезвычайно важным подходом к рассекают механизмы различных заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия. Это позволяет оценить ранние сосудистые аномалии, в том числе микроаневризмы, капиллярные дегенерации и потери перицитами 8,9. На сегодняшний день было проведено несколько методов, разработанных для анализа сосудистой сети сетчатки. Перфузии различные красители были использованы для выделения сосудов, но все они сталкиваются с аналогичными ограничениями. Инъекции редко освещает всю сосудистую сеть сетчатки если не дано при высоком давлении, что риск разрушения и повреждения судов 1. Иммуноокрашивание сосудистого эндотелия с флуорофором меченных G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 конъюгированные; I21413; Invitrogen; разведении 1:100) и сетчатки плоские крепления можно выделить общую архитектуру сосудов, но без детальной визуализацией капилляров, базальной мембраны и перицитах . Было отмечено,Friedenwald, что суда могут быть выделены путем окрашивания плоским крепления сетчатки с периодическими кислотно-Шиффа (PAS) или гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание 10. Тем не менее, окрашивание неспецифической к сосудам и особо не-сосудистой ткани, а также, что делает его трудно отличить сосудов. В 1960 году Коган и Кувабара разработана методика трипсина дайджеста, который сделал его легче визуализировать сосудистую сеть сетчатки расщеплением несосудистой компонентов сетчатки 1. С того времени, трипсин дайджест стала золотым стандартом метод в анализе сосудистой сетчатки 2-5. Однако, важно отметить, что другие альтернативные методы, чтобы изолировать сосудистой были описаны. Использование осмотический лизис был использован, чтобы изолировать сосудистой и позволяют биохимических исследований тканей 11,12, но процедура не был использован в качестве основного метода для анатомического исследования. Метод печати ткань былаиспользована для выделения больших сегментов микрососудов и позволяет способности к обучению электротоническим архитектуры сосудистой 13. Теоретически, этот метод может быть также использован для изучения анатомических изменений, так как качество сосудов является высокой. Тем не менее, это только возможность изолировать сегменты всей сосудистой сети. Хотя эти методы не могут заменить трипсин дайджест, важно отметить, что они имеют различные преимущества и недостатки, и дополняют друг друга в этом отношении.
Метод трипсина дайджеста является технически сложным и трудно выполнить последовательно 6,7. Кроме того, было отмечено, что трипсин дайджест особенно трудно на мышиной модели, в частности, если он желает сохранить общую архитектуру сосудистой сетчатки 6,7. Проблемы включают в себя (1) по-пищеварению сетчатки, которая приводит к потере как сосудистую, а также не-сосудистую ткань, (2) при-пищеварения, требующихобширные механические рассечение который в свою очередь может привести к повреждению сосуда кровать, (3) плохое разделение не-сосудистую ткань из сосудистой приводит к неспецифическое окрашивание. Несколько рукописей выявили эти проблемы, но ни один не представил подробный и последовательный протокол их преодоления 14,15. Эта рукопись представит шаг за шагом методологии подробно технику для выполнения трипсина дайджест на мышей и крыс с сетчатки конкретные советы по обращению с особенно трудным шагом. Схематический обзор показано на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка сетчатки
- Выяснять мыши глазом. Использование одной стороны, открыть веки таким образом, что глаз является видимым. С другой стороны, использование пинцетов (изогнутые вверх), оказать давление на высших и низших аспектов орбите до мира выступает. Аккуратно закройте щипцы на задней поверхности глаз и поднимают в непрерывном движении выяснять глаз.
- Исправить глаз с 10% нейтральный буферный формалин по крайней мере 24 часов.
- Место глазом в PBS решение в небольшой чашке Петри.
- Рассеките из сетчатки тщательно под микроскопом, стараясь избежать вызывая крупные слезы. Сделайте первичный разрез в роговице с рассечение ножницами. Затем, удерживая место надреза с прямыми щипцами, используйте ножницы, чтобы вырезать по границе роговицы и склеры удаление роговицы. Использование тонких изогнутых и прямых щипцов, осторожно снимите склеры и сосудистой оболочки от сетчатки к зрительному нерву. Этот шаг требует терпения,быстро освобождая сетчатки может привести к слезам. Снимите объектив и любой избыток радужной оболочки и мусора от сетчатки 16.
2. Вода смывает
- Место сетчатки в 24-луночный планшет и залить водой (приблизительно 500 мкл, фильтруют с по меньшей мере 45 мкм).
- Меняйте воду каждые 30 минут-1 час, по крайней мере в 4-5 раз.
- Оставить на ночь в воде при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
Примечание: промывки очень важны, поскольку они помогают отделить нейронных слоев сетчатки из кровеносных сосудов.
3. Трипсин Дайджест
- Удалить воды и инкубируют сетчатки в растворе 3%-ным трипсином (Difco 1:250) в 0,1 М Трис-буфера (рН 7,8) при 37 ° С при легком встряхивании на нет. Трипсин дайджест завершается, когда ткань начинает показывать признаки распада (примерно 1,5 часа).
Примечание: Не быстрым встряхиваниемтак как это может привести к повреждению сосудов. - Осторожно, пипетка из трипсина в отдельную также с помощью микроскопа, не прикасаясь к сетчатке. Этот избыток трипсина могут быть использованы в дальнейшем, при обработке судов под микроскопом, на этапе 4.3.
4. Разделение сосудистую
- Добавить фильтрованной воды к сетчатке. Тогда, пытаются снять с внутренней пограничной мембраны пинцетом, с помощью ножниц, если необходимо. Дрожать от слабом перемешивании в течение 5 мин. Осторожно, пипетка из воды под микроскопом, чтобы не повредить сетчатку.
- Повторите воды автомойки (по 5 мин), чтобы помочь освободить сеть сосудов от соседних тканей сетчатки. Вода смывает завершены когда там практически нет мусора, оставшегося в воде после стирки.
- Тщательное манипуляций при вскрытии микроскопом теперь, необходимых для дальнейшего освободить сеть сосудов. Ниже приведены некоторые полезные методы, которые могут быть использованы в последовательности или индividually для достижения желаемого результата на основе технических предпочтения:
- С помощью 200 мкл пипетки, пипетки тщательно водой вверх и вниз рядом с судами, дует на воду сосудов, вызывая легкое перемешивание.
- С помощью 200 мкл пипеткой пипетки трипсин вверх и вниз, чтобы помочь слой стены пипетки. Затем осторожно пипеткой всей сети судно вверх и вниз один раз, чтобы помочь сломать несосудистые ткани.
Примечание: Центрирование пипетки на зрительный нерв, а не на краях сосудистой сети может также предотвратить сосудистую от прилипания к наконечнику. - Аккуратно поднимите сосудистой с тонким пинцетом из воды, чтобы выбить несосудистые компонентов.
- Если перечисленные выше меры не работают, добавить трипсина к сетчатке, чтобы помочь разрушить ткань, и инкубировать при 37 ° С в течение нескольких минут. Затем удалите трипсина и повторите шаги 4.1-4.3.
<сильной ноте>: Убедитесь, чтобы покрыть все инструменты, которые будут вступать в контакт с судов в трипсин (например, пипетки, пинцет). Это поможет избежать сосудистой адгезии к оборудованию.
5. Визуализация сосудистой
- Поместить каплю воды на чистое предметное. С помощью 200 мкл пипеткой или щипцы, передавать расщепленную сосудов в воду. Убедитесь, что сосудистые плоским крепление развернулись. Поверхностное натяжение воды помогает разворачиваться теперь прозрачной сосудистой сети. Если ткань не разворачиваться, добавлять дополнительное количество воды и аккуратно встряхните слайд для облегчения развертывания.
- Удалите излишки воды, очень медленно с помощью пипетки или с помощью бумажного полотенца.
- Разрешить слайды до полного высыхания.
- Пятно слайды с помощью соответствующего протокола либо PAS / гематоксилином или H & E пятно.
Примечание: PAS / гематоксилином полезен для выявления сосудистой стенки и клеточные ядра, H & E является полезным для гemonstration РБК, а также. - Дегидрировать и смонтировать (Permount монтажа среды).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конечный продукт успешной процедуры с плоским горе всей сети сосудистой сети сетчатки мыши, с архитектурой поддерживается, либо окрашивают PAS / гематоксилином или H & E, как показано на рисунках 2-4. Ясно дифференцировки эндотелиальных клеток и перицитов можно рассматривать как показано на фиг.3. В сетчатке ядер эндотелиальных клеток овальные или удлиненные и находиться полностью внутри стенки сосуда. Перицитов ядер малы, сферические, пятно плотно и как правило, имеют выпуклое положение вдоль стенки капилляра.
Трипсин дайджеста является обычной процедурой для анализа сосудистой патологии у больных сахарным диабетом животных моделях. Патологические сосудистых поражений, таких как микроаневризм, перицитов призраков (свидетельство перицитов потерь), бесклеточной капилляров и капиллярного дегенерация были описаны. 4 показан пример капиллярного дегенерации видели в дБ / дБ мышь, модель тип II диабета. Хотя процедура была оптимизирована для сетчатки мыши, аналогичные результаты были получены также в сетчатке крысы, как показано на рисунке 5. Важно отметить, что крысы сетчатки намного больше, и в 12-луночный планшет был использован вместо 24-луночного планшета. Сосудистую сеть сетчатки крысы также менее хрупкими, чем мыши аналога.
Крайне важно, чтобы удалить как можно больше не-сосудистую ткань насколько это возможно. Любые остатки приведет к неспецифическое окрашивание и привести к ухудшению визуализации сосудов. Рисунок 6 представляет собой пример неудачной удаление всего не-сосудистой ткани в пункте 4. Кроме того, важно также, чтобы иметь сетчатки быть развернут при монтаже, чтобы улучшить визуализации сосудов. Рисунок 7 представляет неудачной разворачивается сосудистой плоским креплением на шаге 5.1.
рисунке 1 "FO: Content-ширина =" 5.75in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/>
Рисунок 1. . Схема Трипсин Digest протокола (1) сетчатки Приготовление: изолировать от сетчатки глаза, (2) вода смывает: вымыть в фильтрованной воде на ночь, (3) Трипсин Дайджест: инкубируют в 3% трипсина при 37 ° С в течение 1-1,5 ч; (4) отделение сосудистой: изолировать сосудистую через серию воде моет и рассечение под микроскопом; (5) Переместить сосудистой скользить и дайте высохнуть; (6) Визуализация сосудистой:. пятно слайд с PAS или H & E, обезвоживает и смонтировать Нажмите здесь , чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Управление дБ / м мыши трипсина Digest (H & E, 20x).Эта цифра представляет собой обзор сосудов сетчатки сети показывает нормальную сосудистую архитектуры.
Рисунок 3. Управление дБ / м мыши трипсина Digest (H & E, 600x). Это увеличенное изображение сетчатки на фиг.2, показывающий нормальную архитектуру сосудистых. Эндотелиальных клеток (белая стрелка) и перицитами (черная стрелка) будут выделены.
Рисунок 4. Диабетическая дБ / дБ мыши трипсина Digest (H & E, 500x). На 52 недель, дБ / дБ мышей начинают развиваться сосудистой патологии, такие как капиллярные дегенерации (белая стрелка).
Рисунок 5. Нормальные крысысетчатки трипсина Дайджест (PAS, 20x [], 100x [B]). обзор и увеличенное изображение нормальные крысы сосудистой сети.
Рисунок 6. Управление мышью C57/BL6 трипсина дайджеста, Номера для сосудистой ткани нетронутыми (H & E, 20x [], 100x [B]). При плохой удаления не-сосудистой ткани, есть неспецифическое окрашивание затрудняющего визуализацию сосудов.
Рисунок 7. Управление дБ / м мыши трипсина дайджеста, плохой монтаж (H & E, 20x). Сетчатки Если должным образом не развернул, неадекватным визуализации сосудистой сети.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трипсин дайджеста является стандартным методом оценки сосудистой сетчатки. К сожалению, это технически сложно и может привести к высокой скорости потери образца при их неправильном выполнении. Кроме того, процедура особенно трудно у мышей, которые могут ограничить применение этого метода в часто используемых генетических моделей животных заболеваний глаз. Эта статья содержит указания о том, как выполнить процедуру эффективно и последовательно в мышиных глаз.
Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, очень важно, что сетчатка быть вырезали тщательно во избежание все крупные слезы, чтобы гарантировать, что сосудистая сеть остается неизменным. Во-вторых, стиральная сетчатки в фильтрованной воде на ночь важна, поскольку она помогает отделить нейроретинального слоев из кровеносных сосудов, что способствует более легкому разделению после трипсина дайджеста. Одна из модификаций, которые могли бы ускорить процесс будет размещение сетчатки в 1% Triтонну Х-100 смешивают в фильтрованной воде в течение 1-2 часов. Тогда, трипсин дайджест могут быть выполнены в тот же день после серии вода смывает снять тритона X.
Важно, чтобы ткань сетчатки контролировать постоянно в течение трипсин дайджест во избежание случайного растворения сосудистой ткани. Основываясь на нашем опыте, около 1-1,5 часов достаточно для достижения переваривание нервной ткани, сохраняя при сосудистой нетронутыми. Меньше времени необходимо для молодых мышей. Осторожном встряхивании может быть выполнена в течение трипсин дайджест, чтобы способствовать разделению кровеносных сосудов от остальной ткани, но не является необходимым. Важно, чтобы избежать интенсивного перемешивания, так как это может привести к разрыву сосудов.
Важнейших мер, которые требуют наибольшего внимания включают отделения сосудистой после переваривания трипсином. При проведении промывок водой, важно, чтобы избежать пипетки сосудистой сети. Пипетированиесосудистой следует использовать только в качестве способа отделения сосудистой после того, как стены были покрыты трипсина. Все манипуляции должны быть сделаны тщательно под микроскопом рассечение как сеть сосудов могут быть легко повреждены. Различные методы, описанные в пункте 4 могут быть успешно использованы в различных комбинациях. В конечном счете, это будет до отдельного экспериментатора найти подход, который работает лучше для них. Важно то, что все инструменты, которые вступают в контакт с кровеносными сосудами быть покрыты с помощью трипсина. Погружение инструментов периодически и часто в трипсин во время процедуры может предотвратить адгезию сосудистой и потенциального нарушения.
Эффективность процедуры также зависит от модели мыши фоне. Некоторые мыши фонов не так способствует сохранению всей сети сосудов. Например, фоновый FVB является гомозиготным по фосфодиэстеразы-6 мутация делает их склонными к повторнойкишечного дегенерации 17. Исходя из нашего опыта, мы обнаружили, что их сосудистой сети сетчатки по своей природе более хрупким, и мы не смогли сохранить весь сосудистой сети. Таким образом, важно, чтобы фоновый быть приняты во внимание перед попыткой этой техники.
В конечном счете, основным ограничением этой процедуры вскрытия индивидуума навыков. Важно отметить, что даже если человек знает методики, хорошо, это может занять несколько попыток, прежде чем они начнут получать устойчивые результаты. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы заинтересованные сотрудники лаборатории выполняют несколько вскрытий практике обрести уверенность и прибыть в лучших и наиболее последовательный подход до выполнения процедуры на их экспериментальные ткани. Важно отметить, что, как только освоен, трипсин дайджест представляет собой ценный метод, который может быть использован для оценки сосудистой патологии (рис. 4). Трипсин дайджест также может быть выполнена успешнопешно сохранились на сетчатке, которые были в фиксатор в течение нескольких лет 1.
В заключение, трипсин дайджест продолжает быть чрезвычайно полезным методом для анализа сосудистой сети сетчатки, так как ее описание и Кувабара Коган в 1960 году. Это позволяет детальной визуализацией всей сосудистой сети, по сравнению с иммунофлюоресценции / H & E / PAS окрашенных срезов, телевизор с плоским монтирует и красителей инъекций. Хотя это технически сложно, эта рукописный описана процедура подробно, так что оно может быть выполнено успешно. В результате, мы надеемся, что следователи новичка до метода достаточных указаний, чтобы успешно и последовательный анализ сосудистой сети сетчатки в их экспериментальных моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана NIH RO1-EY019951 (AAF), Иллинойс общества по профилактике слепоты (СКК, AAF), свободные средства на кафедре офтальмологии от научных исследований до предотвратить слепоту (РПБ), Нью-Йорк и РПБ студент-медик стипендии, (СКК).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
