Summary
Digestión con tripsina es uno de los métodos más comúnmente utilizados para analizar vasculatura de la retina. Este manuscrito describe el método en detalle, incluyendo alteraciones clave para optimizar la técnica y eliminar el tejido no vascular, mientras que la preservación de la arquitectura general de los vasos.
Abstract
Digestión con tripsina es el método estándar de oro para analizar la vasculatura de la retina 1-5. Se permite la visualización de la totalidad de la red de vasos complejas tridimensionales retina y capilares sanguíneos mediante la creación de un plano de montaje en dos dimensiones de los canales vasculares interconectados después de la digestión de los componentes no-vasculares de la retina. Esto permite estudiar varios cambios patológicos vasculares, tales como microaneurismas, degeneración capilar, y anormal endoteliales a las relaciones de pericitos. Sin embargo, el método es técnicamente difícil, especialmente en los ratones, que se han convertido en el modelo animal más ampliamente disponible para estudiar la retina debido a la facilidad de manipulaciones genéticas 6,7. En el ojo del ratón, que es particularmente difícil de eliminar por completo los componentes no vasculares, mientras que el mantenimiento de la arquitectura general de los vasos sanguíneos de la retina. Hasta la fecha, hay una escasez de literatura que describe la técnica de digestión con tripsina en detalle in el ratón. Este manuscrito ofrece una metodología detallada de la digestión con tripsina en la retina del ratón, paso a paso, mientras que también proporciona consejos para la solución de problemas difíciles pasos.
Introduction
Visualización de la vasculatura de la retina es un enfoque extremadamente importante para diseccionar los mecanismos de diversas enfermedades oculares tales como retinopatía diabética. Esto permite evaluar las anormalidades vasculares tempranas, como microaneurismas, degeneración capilar, y la pérdida de pericitos 8,9. Hasta la fecha, se han realizado varias técnicas desarrolladas para analizar la vasculatura de la retina. La perfusión de varios tintes se ha utilizado para resaltar los vasos, pero todos han compartido las mismas limitaciones. Inyección rara vez se pone de relieve toda la vasculatura de la retina a menos dado a una alta presión, lo que corre el riesgo de romperse y dañar los vasos 1. La inmunotinción del endotelio vascular con fluoróforo marcado con T isolectina B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; dilución 1:100) y montajes planos de retina puede resaltar la arquitectura general de los vasos, pero sin visualización detallada de los capilares, la membrana basal y pericitos . Se tomó nota deFriedenwald que los barcos se pueden destacar por tinción planas montes de retina con ácido periódico de Schiff (PAS) o hematoxilina y eosina (H & E) tinción 10. Sin embargo, la tinción no era específica para los vasos y pone de relieve el tejido no vascular, así, por lo que es difícil de diferenciar de los vasos. En la década de 1960, Cogan y Kuwabara desarrollaron la técnica de digestión con tripsina que hace más fácil la visualización de la vasculatura de la retina mediante la digestión de los componentes no vasculares de la retina 1. Desde ese momento, la digestión con tripsina se ha convertido en el método estándar de oro en el análisis de la vasculatura de la retina 2-5. Sin embargo, es importante señalar que se han descrito otras técnicas alternativas para aislar la vasculatura. El uso de la lisis osmótica se ha utilizado para aislar la vasculatura y permitir estudios bioquímicos del tejido 11,12, pero el procedimiento no se ha utilizado como un método principal para el estudio anatómico. El método de impresión tejido ha sidoutilizado para aislar grandes segmentos de la microvasculatura y permite la posibilidad de estudiar la arquitectura electrotónico de la vasculatura 13. En teoría, esta técnica podría utilizarse también para estudiar los cambios anatómicos, como la calidad de los vasos es alta. Sin embargo, sólo es capaz de aislar segmentos de toda la red de vasculatura. Aunque estos métodos no pueden sustituir a digestión con tripsina, es importante tener en cuenta que tienen diferentes ventajas y desventajas y son complementarias a este respecto.
El método de digestión con tripsina es técnicamente difícil y es difícil de realizar consistentemente 6,7. Por otra parte, se ha observado que la digestión con tripsina es especialmente difícil en un modelo de ratón, en particular si se desea preservar la arquitectura vascular general de la retina 6,7. Los desafíos incluyen (1) sobre la digestión de la retina que causa la pérdida tanto de la vasculatura así como el tejido no vascular, (2) bajo la digestión, lo que requiereamplia disección mecánica que podría a su vez conducir a un daño de la cama buque, (3) pobre separación del tejido no vascular de los vasos principales de la tinción inespecífica. Varios manuscritos han destacado estos desafíos, pero ninguno ha proporcionado un protocolo detallado y consistente para superarlos 14,15. Este manuscrito introducirá una metodología paso a paso que detalla la técnica para realizar la digestión con tripsina en ratón y rata retinas con consejos específicos sobre el manejo de los pasos particularmente difíciles. Una visión general esquemática se muestra en la Figura 1.
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Protocol
1. Preparación de retina
- Enucleación del ojo del ratón. Uso de un lado, abrir las tapas del ojo para que el ojo es visible. Con la otra mano, usando unas pinzas curvas (curvas mirando hacia arriba), aplique presión en los aspectos superior e inferior de la órbita hasta que sobresalga el globo. Cierre suavemente fórceps en el aspecto posterior del ojo y levantar en un movimiento continuo a enucleación del ojo.
- Fijar ojo con 10% formalina tamponada neutra durante al menos 24 horas.
- Lugar ojo en una solución de PBS en una placa de Petri pequeña.
- Diseccionar retina cuidadosamente bajo un microscopio, teniendo cuidado de evitar la inducción de grandes lágrimas. Hacer un corte inicial en la córnea con tijeras de disección. Entonces, mientras se mantiene la zona de corte con unas pinzas rectas, utilice unas tijeras para cortar a lo largo de la frontera de la córnea y la esclerótica retirar la córnea. El uso de pinzas curvas y rectas finas, con cuidado la cáscara de la esclerótica y la coroides a la retina hacia el nervio óptico. Este paso requiere paciencia,liberar rápidamente la retina puede llevar a las lágrimas. Retirar la lente y cualquier exceso del iris y los residuos de la retina 16.
2. Lavados con agua
- Colocar la retina en una placa de 24 pocillos y se tapa con agua (aproximadamente 500 l, se filtra con al menos un filtro de 45 micras).
- Cambie el agua cada 30 minutos-1 hora, por lo menos 4-5 veces.
- Deja toda la noche en agua con agitación suave a temperatura ambiente.
Nota: Los pasos de lavado son muy importantes ya que ayudan a separar las capas de la retina neural de los vasos sanguíneos.
3. Digestión con tripsina
- Eliminar el agua y la retina se incuban en una solución de 3% de tripsina (Difco 1:250) en tampón Tris 0,1 M (pH 7,8) a 37 ° C con agitación suave a ninguna. Tripsina digestión se completa cuando el tejido comienza a mostrar signos de desintegración (aproximadamente 1,5 horas).
Nota: Evite una agitación rápidaya que esto puede dañar los vasos. - Con cuidado, pipetear cabo tripsina en un pocillo separado usando un microscopio para evitar tocar la retina. Este exceso de tripsina puede ser utilizado más tarde, cuando la manipulación de los buques bajo el microscopio, en el paso 4.3.
4. La separación de la vasculatura
- Añadir agua filtrada a la retina. A continuación, tratar de desprenderse de la membrana limitante interna con pinzas, con unas tijeras si es necesario. Agitar con agitación suave durante 5 min. Con cuidado, pipetear el agua bajo el microscopio para evitar dañar la retina.
- Repita los lavados con agua (por 5 minutos cada uno) para ayudar a liberar a la red de vasos del tejido retinal adherente. Lavados con agua se completan cuando hay poco o ningún residuo que queda en el agua después del lavado.
- Manipulación cuidadosa bajo un microscopio de disección ahora son necesarios para liberar más la red de vasos. A continuación se presentan varias técnicas útiles, que pueden utilizarse en secuencia o individually para lograr el resultado deseado basada en la preferencia técnica:
- Usando una pipeta de 200, pipeta cuidadosamente agua hacia arriba y hacia abajo al lado de los barcos, que sopla del agua en los vasos, causando agitación suave.
- Con 200 l pipeta pipeta la tripsina arriba y hacia abajo para ayudar a las paredes del escudo de la pipeta. Y luego, cuidadosamente pipeta toda la red de vasos hacia arriba y hacia abajo una vez para ayudar a romper el tejido no vascular.
Nota: Centrado de la punta de la pipeta en el nervio óptico en lugar de los bordes de la red vascular también puede prevenir la vasculatura se pegue a la punta. - Levante suavemente vasculatura con unas pinzas finas de agua para desalojar a los componentes no vasculares.
- Si los pasos anteriores no funcionan, añadir tripsina a la retina para ayudar a romper el tejido, y se incuba a 37 ° C durante varios minutos. A continuación, retire la tripsina y repita los pasos 4.1-4.3.
<strong> Nota: Asegúrese de cubrir todos los instrumentos que entren en contacto con los vasos de tripsina (por ejemplo, puntas de pipeta, pinzas). Esto ayudará a evitar la adhesión de la vasculatura para el equipo.
5. Visualización de la vasculatura
- Coloque una gota de agua sobre un portaobjetos limpio. Usando una pipeta de 200 o fórceps, transferir los vasos digeridos en el agua. Asegúrese de que el vascular plana de montaje se desarrolló. La tensión superficial del agua ayuda a desplegar la red vascular ahora diáfano. Si el tejido no se desarrolla, añada más agua y agite suavemente el portaobjetos para facilitar despliegue.
- Retire el exceso de agua muy lentamente con la pipeta o con una toalla de papel.
- Permita que se sequen por completo.
- Teñir diapositivas a través del protocolo adecuado, ya sea con PAS / hematoxilina o H & E tinción.
Nota: PAS / hematoxilina es útil para identificar pared del vaso y núcleos celulares, H & E es útil para demonstration de RBC también. - Deshidratar y montar (Permount medio de montaje).
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Representative Results
El producto final de un procedimiento exitoso es un montaje plana de toda la red de la vasculatura de la retina del ratón, con la arquitectura mantiene, se tiñeron con cualquiera de PAS / hematoxilina o H & E, como se muestra en las Figuras 2-4. Claro diferenciación de las células endoteliales y los pericitos se puede ver como se muestra en la Figura 3. En la retina, los núcleos de las células endoteliales son oval o alargada y situada completamente dentro de la pared del vaso. Pericitos núcleos son pequeños, esféricos, mancha densamente y generalmente tienen una posición protuberante a lo largo de la pared del capilar.
Digestión con tripsina es un procedimiento común para analizar la patología vascular en modelos animales diabéticos. Se han descrito las lesiones vasculares patológicas tales como microaneurismas, fantasmas pericitos (evidencia de la pérdida de pericitos), capilares acelular y la degeneración capilar. Figura 4 muestra un ejemplo de la degeneración capilar visto en un ratón db / db, un modelo para el tipo Diabetes II. Aunque el procedimiento se ha optimizado para las retinas de ratón, también se han obtenido resultados similares en las retinas de rata como se muestra en la Figura 5. Es importante tener en cuenta que las retinas de ratas son mucho más grandes, y una placa de 12 pocillos se utiliza en lugar de una placa de 24 pocillos. La red de la vasculatura de la retina de rata también es menos frágil que la contrapartida del ratón.
Es extremadamente importante para eliminar la mayor cantidad de tejido no vascular como sea posible. Cualquier restos conducirán a tinción no específica y conducir a una mala visualización de la vasculatura. Figura 6 representa un ejemplo de retirada infructuosa del tejido no vascular entero en el paso 4. Del mismo modo, también es importante tener la retina ser desplegada durante el montaje así como para mejorar la visualización de la vasculatura. Figura 7 representa éxito despliegue de la vascular plana de montaje en el paso 5.1.
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Figura 1. . Esquema de tripsina Protocolo Resumen (1) Preparación de retina: aislar a la retina del ojo, (2) El agua lava: Lavar con agua filtrada durante la noche, (3) digestión con tripsina: Incubar en el 3% de tripsina a 37 º C durante 1 a 1,5 horas; (4) La separación de la vasculatura: aislar vascular a través de una serie de lavados con agua y disección bajo microscopio (5) Mueva vasculatura para deslizarse y dejar secar; (6) Visualización de la vasculatura:. diapositivas tinción con PAS o H & E, deshidratar y montar clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Control de db / m mouse digestión con tripsina (H & E, 20x).Esta figura es una vista general de la red vascular de la retina que muestra la arquitectura vascular normal.
Figura 3. Control de db / m mouse digestión con tripsina (H & E, 600x). Esta es una vista ampliada de la retina en la Figura 2 que muestra la arquitectura vascular normal. Células endoteliales (flecha blanca) y pericitos (negro flecha) se destacan.
La Figura 4. Diabetic ratón db / db digestión con tripsina (H & E, 500x). Por 52 semanas, los ratones db / db comenzar a desarrollar la patología vascular como la degeneración capilar (flecha blanca).
Figura 5. Rata normalretina digestión con tripsina, (PAS, 20x [a], 100x [b]). Una visión general y la imagen ampliada de una red vascular de rata normal.
La Figura 6. Control de C57/Bl6 ratón digestión con tripsina, el tejido no vascular intacta (H & E, 20x [a], 100x [b]). Con una eliminación deficiente del tejido no vascular, no hay tinción no específica que perjudican la visualización de los vasos.
Figura 7. Control de db / m mouse digestión con tripsina, montaje deficiente (H & E, 20x). Si la retina no se desarrolló adecuadamente, hay una visualización inadecuada de la red vascular.
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Discussion
Digestión con tripsina es un método estándar para evaluar la vasculatura de la retina. Por desgracia, es técnicamente difícil y puede dar lugar a alta tasa de pérdida de muestra si no se realiza correctamente. Además, el procedimiento es especialmente difícil en ratones, lo cual puede limitar la aplicación de esta técnica en los modelos animales genéticos comúnmente utilizados de enfermedades de los ojos. Este documento proporciona una guía sobre cómo llevar a cabo con eficacia y coherencia del procedimiento en los ojos de ratón.
Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, es crucial que la retina se diseca cuidadosamente para evitar cualquier grandes lágrimas, para asegurar que la red vascular permanece intacta. En segundo lugar, el lavado de la retina en el agua filtrada durante la noche es importante, ya que ayuda a separar las capas NEURORRETINIANO de los vasos sanguíneos, lo que facilita una separación más fácil después de digestión con tripsina. Una modificación que podría acelerar el proceso sería colocar la retina en 1% de triton X-100 mezclado con agua filtrada durante 1-2 horas. Entonces, digestión con tripsina se puede realizar el mismo día después de una serie de agua lava para eliminar el tritón X.
Es importante que los tejidos de la retina ser monitoreados constantemente durante la digestión con tripsina con el fin de evitar la disolución inadvertida del tejido vascular. Basándonos en nuestra experiencia, en torno a 1-1,5 horas es suficiente para llevar a cabo la digestión del tejido neural, preservando al mismo tiempo la vasculatura intacta. Se necesita menos tiempo para ratones más jóvenes. Agitación suave se puede realizar durante la digestión con tripsina para ayudar a facilitar la separación de los vasos sanguíneos desde el tejido restante, pero no es necesario. Es importante evitar la agitación fuerte ya que esto puede conducir a la rotura de los vasos.
Los pasos críticos que requieren la mayor atención implican separar el sistema vascular después de la digestión con tripsina. Al realizar los lavados con agua, es importante para evitar la vasculatura de pipeteado. El pipeteo dela vasculatura sólo debe utilizarse como un método de separación de la vasculatura después de que las paredes se han recubierto con tripsina. Todas las manipulaciones deben hacerse con cuidado bajo el microscopio de disección como la red de vasos se puede dañar fácilmente. Las diferentes técnicas que se describen en el paso 4 se pueden utilizar con éxito en una variedad de combinaciones. En última instancia, será hasta el experimentador individuo a encontrar el método que funciona mejor para ellos. Es importante que todas las herramientas que entrarán en contacto con los vasos sanguíneos pueden recubrir con tripsina. Inmersión de las herramientas de forma intermitente y con frecuencia en tripsina durante el procedimiento puede evitar la adhesión de interrupción vasculatura y el potencial.
La eficacia del procedimiento depende también el modelo de ratón de fondo. Algunos fondos de ratón no son tan aptas para conservar toda la red vasculatura. Por ejemplo, el fondo FVB es homocigotos para una mutación de la fosfodiesterasa-6 haciéndolos propensos a volverdegeneración tinal 17. Desde nuestra experiencia, hemos encontrado que la vasculatura retinal es inherentemente más frágil, y no fueron capaces de preservar toda la red vascular. Por lo tanto, es importante que se tomen en consideración los antecedentes antes de intentar esta técnica.
En última instancia, la principal limitación de este procedimiento es la habilidad de disección de un individuo. Es importante tener en cuenta que incluso si un individuo conoce las técnicas bien, puede tomar varios intentos antes de que comiencen a lograr resultados consistentes. Por lo tanto, recomendamos que el personal de laboratorio interesados realizan varias disecciones práctica para ganar confianza y llegar al enfoque mejor y más consistente antes de realizar el procedimiento en su tejido experimental. Es importante tener en cuenta que, una vez dominado, digestión con tripsina es una técnica valiosa que se puede utilizar para evaluar la patología vascular (Figura 4). Digestión con tripsina también se puede realizar éxitocessfully en conserva retinas que han estado en fijador durante varios años 1.
En conclusión, la digestión con tripsina sigue siendo un método extremadamente útil para analizar la vasculatura de la retina desde su descripción por Cogan y Kuwabara en la década de 1960. Se permite la visualización detallada de la totalidad de la red vascular, en comparación con inmunofluorescencia / H & E secciones teñidas / PAS, plana-monturas y tinte-inyecciones. A pesar de que es técnicamente difícil, este manuscrito describe el procedimiento en detalle para que pueda realizarse con éxito. Como resultado, esperamos que los investigadores noveles con el método tendrán una orientación suficiente para permitir el análisis exitoso y consistente de la vasculatura de la retina en sus modelos experimentales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por el NIH RO1-EY019951 (AAF), Sociedad de Illinois para la Prevención de la Ceguera (JCC, AAF), los fondos de libre disposición para el Departamento de Oftalmología de la investigación para prevenir la ceguera (RPB), Nueva York y RPB Medical Student Fellowship subvención (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
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