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Immunology and Infection

肺炎链球菌在鼻内殖民期间炎症反应的特征

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

描述了 肺炎链球菌 的鼻咽结肠化以及随后对附体或招募细胞的提取。该技术涉及冲洗鼻咽和收集流体通过鼻孔，并适应各种读数，包括微分细胞定量和分析的mRNA表达 原位。

Abstract

肺炎链球菌的鼻咽结肠是侵入肺部或血液的先决条件。这种生物体能够殖民鼻咽的粘膜表面，在那里它可以居住，繁殖，并最终克服宿主防御入侵到宿主的其他组织。在通常的下呼吸道中发现感染会导致肺炎。或者，细菌可以传播到血液中，导致细菌血症，这与高死亡率2有关，否则直接导致肺炎球菌脑膜炎的发展。了解鼻咽结肠的动能和免疫反应是S.肺炎感染模型的一个重要方面。

我们的小鼠内殖民化模型改编自人类模型3， 并被多个研究小组用于鼻咽4-7宿主病原体反应的研究。在模型的第一部分，我们使用 肺炎 的临床分离建立一个自我限制的细菌殖民化，类似于人类成人的运输事件。此处详细说明的程序包括准备细菌接种，然后通过通过鼻内管理途径传递接种库建立殖民化事件。在稳定状态下，居民巨噬细胞是鼻咽的主要细胞类型。通常，在未受感染的小鼠8中，淋巴细胞很少，但粘膜结肠会导致低至高档炎症（取决于细菌物种和菌株的毒性），从而产生免疫反应，并随后招募宿主免疫细胞。这些细胞可以通过气管内含物的厕所进行分离，并与殖民化细菌的密度相关，以更好地了解感染的动能。

Protocol

在开始之前：除非另有说明，否则所有步骤均在生物危害 2 级 （BSL2） 生物安全柜 （BSC） 中完成。请确保在开始实验之前，您已获得适当的生物危害批准，以便根据机构指南使用传染性细菌病原体。此外，请确保您拥有进行事先准备的程序所需的所有材料和试剂。这些实验中使用的老鼠包括杰克逊实验室、查尔斯河或塔科尼奇的雌性C57BL/6小鼠，年龄在10-14周（尽管我们尚未发现鼻腔结肠间隙或感染的动能存在任何性别依赖性显著差异）。这些实验中使用的所有小鼠都是在无病原体条件下繁殖和维持的，并且没有常见的病毒（LCMV、MNV、MPV、病毒ECTV和其他）细菌（如幽转杆菌）和寄生虫（如针虫、异位虫），通过粪便样本检测，以及经常对其设施内的哨点小鼠进行解剖评估。在进行这些实验时，我们建议使用年龄不小于10-12周、年龄不小于6个月的对照小鼠。小鼠比这个年龄范围小或大，更容易受到更长的鼻咽运输持续时间和传播感染的可能性增加的影响。小鼠背景是另一个重要的考虑因素，可能会影响殖民化实验的结果，因为几个小组已经证明，不同遗传背景的小鼠有不同的易感性，以S.肺炎D39（血清型2）株9，10。肺炎不是天然存在的穆林病原体，它唯一的天然储液库是人类鼻咽。传播通过呼吸液滴发生，由于小鼠不产生呼吸分泌物，个别小鼠不能将细菌传染给其他小鼠，因此对小鼠对小鼠的传播没有顾虑。有关本手稿中描述的程序的视觉概述，请参阅图1。

1. 准备肺炎文化

  1. 接种5毫升的试用大豆，用于 肺炎链球菌的暂停生长。
  2. 静态条件下的培养在 37 °C 的 5% CO2 中，直到细菌接种达到日志阶段增长，相应的液体密度为 108 CFU/ml，由设定为 600 nm 的里程表确定。与此 CFU 对应的确切读数将因特定选定的细菌菌株而异：对于大多数 S.肺炎 菌株，这相当于OD600 范围0.45-0.55。通常，在建议条件下，液体培养中的 S.肺炎 菌株将在1.5-2.5小时内增长到这种密度，无需亚文化。不应允许该培养物过度生长（超出 0.75 的 OD 读数），因为这意味着细菌不再处于日志阶段生长并正在经历广泛的自动分析。
  3. 每只老鼠将接种约107 种细菌。因此，每9只小鼠被殖民，移液器1毫升的接种进入埃彭多夫管和旋转在15，000 x 克1分钟。应该可以看到白丸。去除超标物，小心不要干扰颗粒，并补充磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 100 μl 中的细菌，从而将浓度提高到 109 CFU/ml。在这个阶段，细菌应该保持存活，但不会轻易复制。
  4. 如果使用多个单引，则组合成一个管子，以控制细菌密度的轻微样本间变化。
  5. 将细菌保存在冰上，直到准备好接种，最长1小时。
  6. 要获得精确的细菌计数，请执行从整洁的细菌接种开始的日志串行稀释系列。连续稀释 10 倍，将 10μl 添加到 90μl 的无菌 PBS 中。
  7. 将 10 μl 稀释样本 10-5 - 10-9的 3 滴，加上 PBS 专用污染控制，放到单独标记的试用大豆 agar （TSA） 板上，并辅以 5% 羊血（图 2）。确保每一步从较高的 CFU 浓度稀释到较低的 CFU 浓度时，移液器提示都会更改，以避免携带过量的细菌并增加结果的变异性。人血阿加 （HBA） 板也可以用来代替 TSA 。由于许多 肺炎 菌株对新霉素（从5-20微克/毫升）有耐药性，这种抗生素也可能在制片阶段添加到首选的阿加介质中。这有助于列举，因为它消除了非耐受细菌。必须事先测试每种菌株的抗生素易感性，以确定每个细菌菌株使用抗生素的最佳浓度。
  8. 允许干燥15-30分钟，然后覆盖板，倒置在细菌孵化器设置为37°C和5%CO2。在盘子里长出细菌菌落24小时。
  9. 确定殖民地形成单位的数量及其相应的浓度。根据OD600值的确定，浓度应在1-4 x 109 CFU/ml范围内。 S. 肺炎菌落应以小而圆形的殖民地出现，呈黄色米色，中心为小凹陷，使其外观类似甜甜圈（图3）。

2. 穆林内纳萨尔殖民化

  1. 将小鼠放入小鼠约束装置（经过改装的 50 毫升猎鹰管，尖端被切断以创建光圈）用拇指固定它们的身体底部，使其鼻子从约束器装置的锥形末端（图 4）中浮现出来。使用这种装置可以固定老鼠的头部和隔离其鼻孔的方式，尽量减少运动，以及阻碍动物试图粘乳移液器尖端，允许完全交付的接种。或者，小鼠可以通过颈部擦伤和手动约束来固定。我们不建议在进行内接种之前对动物进行麻醉。在麻醉下给动物接种接种导致一些接种剂扩散到肺部12，13。
  2. 使用P10或P20移液器，通过沉积10微克的预制培养物给每只小鼠接种疫苗，在两个鼻孔之间均匀分布（允许接种者通过逐渐脉动接种滴入鼻子，使小鼠需要时间吸入接种）。为了实现接种的完全交付，暂停管理在任何时候，老鼠开始过度移动它的鼻子。整个接种不能注射到鼻腔中，因为老鼠在呼气时可能会通过鼻子排出一些疫苗：然而，由于被驱逐的量往往是微不足道的，而且接种中含有极高的细菌量，这不会显著影响殖民细菌的负荷。此外，可用于鼻咽粘膜殖民化的表面积有限，因此我们和其他人发现，建议的107 剂量足以获得所有小鼠的细菌水平一致，导致最初殖民细菌14，15 的变异性最小。
  3. 如果将体重指标用作端点监控的一部分，则称量小鼠。每 12-24 小时监测一次小鼠的临床症状，包括嗜睡、毛皮褶皱和体重减轻。小鼠通常不会表现出疾病的症状，直到3-5天后殖民化，这些将之前减肥，可能平均每天约5%的总体重。随着老鼠病得越来越重，它们会采取驼背姿势，表现出活动减少和对刺激（包括处理）的反应能力下降。在这个阶段，疾病通常表明败血症和/或肺炎，并有可能是绝症，虽然小鼠可以每天用1毫升皮下盐水治疗，以改善结果。幸存的小鼠在殖民化后的第7天之后应该会开始出现好转，体重稳定后体重增加就证明了这一点，尽管不同株的S.肺炎可能会更快地诱发疾病，并导致临床症状沿着不同的时间线发展。有关在与 P1547 菌株殖民的小鼠中跟踪的体重的代表性结果，请参阅图 5。

3. 鼻腔拉瓦奇样品收集

开始前： 使用1毫升注射器准备罐装针头，盖有26个3/8G斜针。切开2.5厘米的PE20聚乙烯管，内径0.38毫米，确保每端有一个斜尖。使用钳子，将一块2.5厘米长的PE20聚乙烯管（内径0.38毫米）滑到针尖上，避免刺穿管子侧。罐头可以保存在70%乙醇，直到需要。

  1. 安乐死实验鼠。由于颈椎脱位可能会损坏气管，因此必须避免这种安乐死方法。我们首选的方法是异氟乙烯麻醉，然后是脱盐，但是，在选择安乐死模式时，确保您遵循机构指南。
  2. 使用70%的水乙醇，消毒动物的超安特里奥皮毛，特别是颈部，小心防止乙醇进入鼻孔。
  3. 沿着动物颈部的中线进行单次纵向切割，在两端进行两次水平切口，从而创建一个开口来设想气管。
  4. 小心地剥回皮肤到两侧，露出下面的颈部组织。
  5. 气管应该可见，两侧的纵向肌肉包围。小心地剪下这些，以提供气管本身的清晰视图，注意不要切断周围的血管。
  6. 如果血管被切断，血液存在，在进行之前，允许出血停止，然后通过分配无菌PBS和使用无菌纱布轻轻地吸收该地区多余的水分来清洁该地区几次。
  7. 气管适当暴露后，在气管中半乳形切口约半向上（图6）。
  8. 将 1，000μl 的消毒 PBS 绘制到先前准备的罐头中。
  9. 将管插入气管朝向鼻子，保持斜边向下指向，以方便插入（图 7）。针头到位后，旋转180°，轻轻向上探针，直到感觉有光阻力。
  10. 将埃彭多夫指定用于采集样本，就在鼠标鼻子下方。
  11. 通过分配最少（+20微l）的PBS熔岩液来测试针头的正确位置 - 应在小鼠的鼻孔周围形成液滴;如果是这样的话，继续步骤3.13）。
  12. 如果测试PBS直接从动物的嘴里出现，拉回管子，然后通过再次轻轻地向前探测，直到感觉非常轻微的阻力重新定位 - 小心不要推动坎努拉过这个阻力太远，因为你会移动它过去的鼻腔，并通过口腔。
  13. 迅速分配针头的内容，以帮助取代和收集最大数量的细胞 - 内含物应流出通过鼠标的鼻孔和收集管。立即将样品放在冰上。
  14. 要收集用于RNA分析的样本，使用包含同一小鼠上 500 μl RNA 裂解缓冲器的罐装针头重复步骤 3.8-3.13）。这将允许从剩余细胞群中收集利萨酸盐样本，这些样本主要由鼻咽粘膜上皮组成，因为非附属细胞应在初始 PBS 厕所后被移除。请注意，RNA裂解缓冲器会破坏上皮并破坏周围的组织，因此，如果需要保留这些组织，必须小心避免与肺等器官接触。收集后，将样品直接放在干冰上的RNA裂解缓冲器中，以捕捉冻结。一旦进入裂解缓冲区，样品可以按照制造商的说明存储，并且通常稳定在 -70 °C 几个月。

4. 纳索芬克斯细菌负荷的确定

  1. 通过为每个粘膜鼻腔样本准备一个系列稀释系列来量化细菌。一般来说，细菌负荷可预期在0-104 CFU之间，因此进行三次10倍的连续稀释。将 10 μl 的整洁鼻腔熔岩样本 （100 CFU/ml） 添加到第一根管中，浓度为 10-1 CFU/ml。
  2. 将细菌板分成象限，并分别用稀释系列（10 0 -10-3 CFU/ml）的成员标记象限。盘出3滴10μl样品的3稀释和整洁的样品试用大豆糖板补充5%羊的血液，如图2。
  3. 允许干燥15-30分钟，然后覆盖板，倒置在细菌孵化器中，具有最佳的细菌生长条件（通常为37°C和5%CO2）。
  4. 在盘子里长出细菌菌落18-24小时。
  5. 通过平均每个稀释板上形成的菌落来确定殖民细菌的数量（图3）。图8显示，在不同时间点，由鼻熔岩培养决定的细菌密度，在3种不同菌株的S.肺炎中殖民，最长可达21天。

5. 为流测定量的样品准备

开始之前： 准备抗体组合。为了量化白细胞种群，我们建议在指定稀释时进行以下组合：PE-Ly6G（克隆 1A8， 1 μg/ml）、FITC-Ly6C（克隆 AL-21，1 μg/ml）、eFluor 450-CD45（克隆 30-F11， 2.67 微克/毫升），APC-F4/80（克隆 PM8 RUO，0.67 微克/毫升），PerCP-Cy5.5-CD11c（克隆 N418 RUO， 0.5 微克/毫升）、PE-Cy7-CD11b（克隆 M1/70、0.33 μg/ml）、亚历克萨氟 700-CD3（克隆 1782、4 μg/ml）、eFluor 605NC-CD4（克隆 GK1.5、6.67 微克/毫升）。请注意，此组合的浓度为 2 倍（参见步骤 5.5）。所有抗体应稀释在FACs洗缓冲器（0.5%胎儿小腿血清，2mM EDTA，0.1%钠阿齐德在PBS），这也应事先准备。在等型匹配对照抗体的混合物中，最好是来自与标记抗体相同的供应商，并且与特定抗体的浓度相同。用同型控制抗体处理的样品将起到负对照作用。在用同型控制抗体治疗的样本中观察到的任何荧光应被视为背景。

  1. 预切离心机，可旋转 1.5 毫升埃彭多夫管到 4 °C。
  2. 离心鼻拉瓦奇样品在 2，000 x g 10 分钟在 4 °C。 小心地移出超自然和储备。注意：由于鼻咽内细胞量小，除非有不受欢迎的红血球污染，否则细胞颗粒将看不见，而红血球会呈鲜红色。如果看到此问题，应丢弃样品。
  3. 在50μl的Fc中重新补充样品？RIIb/CD16-2 （2.4G2） 抗体 （结合 Fc 受体并减少非特异性抗体结合） 在 FAC 洗涤缓冲区中，浓度为 4μg/ml。
  4. 在冰上孵化样品30分钟。
  5. 加入50微升预先准备的2倍浓缩荧光抗体混合物到样品中。从每个实验组中留出一个具有代表性的样本，作为等型控制。将同型抗体混合物添加到此样品中，以代替污渍混合。
  6. 在冰上孵化样品1小时。
  7. 离心机样品在2，000 x g 10分钟在4°C。 丢弃超自然物，并在 200μl 的 PBS 中重新使用。
  8. 重复步骤5.7。
  9. 第二次洗涤后，离心机样品在 4 °C 下 10 分钟内再次以 2，000 x g 的速度进行。
  10. 在PBS（如果立即运行样品）或2%的甲醛（如果在染色后1-3天运行样品）中再吸收。
  11. 进行流细胞测量时，收集每个样本的最大事件量，或直到整个样本被吸气。在未受感染、健康、幼鼠中，这一事件总数将少至1 000至2 000只：在细菌殖民化事件期间，这个数字可能会增加2到5倍以上，这取决于动物的疾病状况以及年龄和遗传背景等因素。 图9 显示了从3激光贝克顿·迪肯森LSRII流细胞仪中收集的代表性流量细胞测量结果，该测速仪使用450的向前散射和300的侧散射，尽管我们建议在样品收集之前优化您打算使用的特定流细胞仪的参数。注意：如果样本中甚至含有微量的血液污染，则收集的总事件将明显高于预期，并且样本应从分析中打折扣。

6. 鼻熔岩的定量PCR（qPCR）分析

  1. 从步骤 3.14 室温解冻细胞。
  2. 按照推荐的协议，选择首选的RNA提取。
  3. 按照指示完成RNA提取程序后，使用光谱仪或基于电泳的方法（图10）量化RNA的量。我们通常以 260/280 nm 的比例获得每个样本 975 至 3，250 ng 的总 RNA，>1.7 或 RNA 完整性编号 （RIN） 左右，约为 8.1±0.13。
  4. 根据制造商的协议，使用 M-MULV 反向转录酶使用 1，000 ng RNA（最大 13 μl）转录 cDNA。
  5. 稀释生成的 cDNA 样品 8 倍，并同样引用到 4 个单独的管中，在 -20 或 -80 °C 的长期存储中。
  6. 要通过 qPCR 测量基因表达，请在冰块或冷块上的三脚架中准备 25 个 μl 样本反应，其中包含： 您选择的 qPCR 套件中的 2 倍 qPCR 主组合中的 12.5 μl， 0.25 μl 参考染料，2 μl 稀释的 cDNA（步骤 7.5），1 μl 的混合前进和反向引物（400 nM 最终），9.25 μl 的 RNAse-DNAS 无水。该协议是以前公布的方法16的改编。
  7. 一般来说，我们发现两步 qPCR 放大（95 °C 10 分钟，然后最多 40 个周期 x [95 °C x 15 秒，60 °C x 1 分钟]） 是有效的 （图 11a）;但是，必须优化每个引号对。放大后必须执行分离（熔化）曲线，以确保不会发生非特定放大。放大 （图 11b）
  8. 我们通常运行每个分析的基因的标准曲线，以及每个96井板分析的标准校准器（源自肺或脾脏同质性）。通过参考染料首先使原始周期阈值 （Ct） 值正常化并通过相应的标准曲线转换结果值来获得相对成绩单量。这些相对量随后根据适用情况标准化为标准校准器和家政基因。

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Representative Results

图 1 表示概述示意图，总结了协议的主要步骤。 图2-3 提供了本文所述协议所固有的微生物方法的可视化。 图4 表示小鼠进行鼻内殖民化的正确定位，而 图5 则描绘了与 S.肺炎 菌株P1547结肠的小鼠体重的典型变化。 图6-7 表示过程鼻腔熔洗部分的特定阶段，用于辅助可视化这两种技术。 图8-11 包括对从鼻腔清洗后从小鼠鼻咽采集的样本进行的具有代表性的分析结果。具体来说， 图8 是鼻咽细菌负荷的代表性结果，通过培养从与 S.肺炎 菌株P1121、P1547或P1542殖民的小鼠身上获得的鼻熔岩来确定。 图9 表示使用流动细胞测量技术分离的鼻咽免疫细胞的细胞表型。 图10-11 显示与通过定量PCR对鼻咽mRNA的表达分析相关的代表性结果。

Figure 1
图1。使用鼠标模型进行鼻腔内接种和鼻腔熔岩细胞隔离程序的流程图。 首先，细菌准备接种，然后给穆林受试者在纳纳内。经过所需的时间长度后，小鼠通过末期出血被安乐死，其鼻咽细胞通过两个鼻腔熔洗步骤分离：PBS洗涤步骤，然后在RNA裂解缓冲中进行二次洗涤。使用流动细胞测量技术分离和分析初步PBS洗涤的细胞，而从第二个样本中分离出的RNA可用于研究转录水平上感兴趣分子的相对丰度。

Figure 2
图2。为了确定细菌浓度，10 μl滴被镀在三份板上，分为表示不同序列稀释的部分。然后，这些滴子可以干燥，板在37°C，5%CO2的夜间孵育。

Figure 3
图3。从具有代表性的动物鼻咽中分离出的 链球菌肺炎 浓度。 每个离散的殖民地代表一个殖民地形成单元，每个殖民地集合代表一个 10 μl 下降（镀在三方形中），每个象限在板上表示一个单独的序列稀释。细菌浓度在CFU/ml中通过平均合格象限内和合格象限之间的可计数、完全形成的菌落数量来确定。

Figure 4
图4。必须尽量减少任何要接种疫苗的老鼠的运动，特别是在颈部，以便适当地输送细菌。为此，受试鼠标被限制在由50毫升猎鹰管组成的修改后的限制装置中，其锥形末端有一个光圈。然后，小鼠被定位，使其鼻子从孔径中浮现出来，研究人员可以访问它，从而进行鼻内接种。

Figure 5
图5。在初始接种（n=6）之后，每天跟踪至少2个具有代表性的实验，对与P1547菌株结肠的小鼠的体重进行跟踪，以描绘鼻咽殖民化后预期体重的典型变化。重量显示为初始体重的百分比变化。请注意，预计在3-5天之间会明显减少初始体重，随后存活小鼠的体重将稳定并逐渐增加。

Figure 6
图6。气管暴露后，在气管切口之前小心切除侧翼纵向肌肉，不会严重周围的血管。 然后用细细的手术剪刀在气管上做一个小的半乳管切口。重要的是只部分切开气管的直径，使其在后部完好无损。

Figure 7
图7。将罐头插入气管孔径向上朝向鼻子。 一旦管子到位，轻轻探针，直到遇到阻力，然后冲洗内容通过鼻孔。

Figure 8
图8。使用 C57BL/6 小鼠（三角形）结肠后描述的鼻腔清洗程序从鼻咽中分离出具有代表性的一系列细菌负荷，其中含有 S. 肺炎菌株 P1547 （A）、P1542 （B） 或 P1121 （C）。P1121殖民化后BALB/C小鼠（圆）的比较殖民化也显示在（C）中。在整个殖民化过程中显示不同的时间点，包括第 3 天、第 7 天、第 14 天和第 21 天。一般来说，预计第3天初始负荷较高，第7天不会减少。清除通常由第 14 天开始，在大多数菌株殖民化后的第 21 天，完全或接近完全清除。单击此处查看较大的图。

Figure 9
图9。通过流动细胞学分析从穆林鼻熔岩中分离出的总细胞的代表直方图 （A） 和点图 （B） 。标记物在细胞群中的差异表达允许通过使用针对这些蛋白质的荧光抗体来识别白细胞亚集。如图所示，白细胞种群是通过先使用前向散射（区域）与前散射（宽度）门（A）对单细胞进行门控来选择的，然后在该子集（B）内丰富CD45+细胞。通过对CD11b和Ly6G双阳性嗜中性粒细胞（C）进行门控，可以进一步细分为特定的细胞类型。对CD11b人群的分析可以揭示F4/80+，CD11b巨噬细胞（D）或CD11b-，CD3和CD4双正CD4T细胞（E）。细胞种群只要表达一种，或者多种独特的表面受体的组合，就可以被表型化，这些受体可以用来区分它们与其他细胞类型。单击此处查看较大的图。

Figure 10
图10。电泳后的代表电图自动测序从穆林鼻熔岩分离的样品。由此产生的电球图显示了来自鼻咽区域的高质量总RNA样本的量子数据和特征特征。在分析RNA总量时，使用两个主要核糖核素RNA（18S和28S）的RNA峰值下区域来计算其相应比率。归因于 18S 和 28S 的峰值比率发生重大变化通常表示 RNA 退化。退化程度可以通过RNA完整性编号（RIN） 来概括：此代表性样本的RIN为8.1。高度退化RNA的示例显示在（B）和（C）中，随后的 RIN 分别为 1.9 和 4.6。单击此处查看较大的图。

Figure 11
图11。从鼻洗细胞溶解的 qPCR 分析中放大图 （A） 和分离 （熔化） 曲线 （B），提供这两个读数通常应遵循从穆林鼻咽分离出的有效和正确检测放大 mRNA 产品后的外观示例。表示是家政基因 18S 的标准曲线。在（A） 中显示的结果显示，使用引物对 GAPDH 进行放大后，所需的 PCR 产品。该行表示周期阈值 （Ct）。与不同样本相对应的放大图跨越此阈值的点允许跨样本进行比较，其中包含的较低值与较高感兴趣的RNA量相对应。（B ）中的绘图显示 qPCR 产品的最大熔化温度为 85 °C，此反应中不存在污染物产品，该峰值将显示为与所需产品峰值分开的额外峰值。单击此处查看较大的图。

应变名称 血清型 毒性 老鼠死亡率 预期殖民化持续时间
P1121 23F 无症状 0% 21-28天
P1542 4 低 0-20% 21-28天
P1547 6A 中 20-50% 14-21 天
D39 2 高 70-100% 14-21 天

表1。4种常用 的S.肺炎 临床分离菌株的表格概述，它们相应的血清型数，相关的毒性程度，小鼠的殖民子集内入侵的预期比例和鼻咽殖民化的典型持续时间。

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Discussion

在这项研究中，我们提出了使用 肺炎链球菌 临床分离菌株的小鼠的鼻内结肠的详细方法，以及随后针对细菌招募到鼻咽的免疫细胞的隔离和特征。我们演示了如何在营养丰富的介质中培养细菌，并用于在小鼠中建立殖民活动，最初仅限于鼻咽。然后，我们展示了如何通过使用罐装针头，在气管暴露、切口和鼻腔熔洗后分离出招募到鼻咽的免疫细胞类型。鼻腔熔岩样本可在PBS中采集，以分离完整、轻粘附的细胞：通过应用由RNA裂解缓冲器组成的二次洗涤，可以分离来自更紧密粘附细胞和周围上皮粘膜层的RNA。然后，这些样本中的前者可用于通过流动细胞测量技术对殖民化环境中招募的特定细胞进行表型，而后者则应用于Q-PCR分析，通过观察免疫调节器的兴趣转录表达来确定这些被招募细胞的效应器功能。鼻腔熔岩样本还可用于确定细菌殖民化事件清除的动力学，比较不同的实验组以解决特定的研究问题。

利用这种鼻内殖民化方法，可以建立一个殖民化事件，最初仅限于动物的鼻咽。因此，细菌随后在血液或器官上的任何传播都比鼻咽粘膜内局部免疫防御的破坏次要发生。通过这个模型实现的逐步进展更准确地反映了肺气管入侵人类的过程，使人们能够研究殖民细菌和宿主鼻粘膜之间的动态，也许更好地了解细菌致病性和/或宿主免疫力的变化，从而能够发展传播疾病。这与放弃建立初始殖民化事件并选择通过通过细胞内灌输直接向肺部输送细菌接种、通过血管注射向血液或通过腹膜注射向腹膜注射来孤立地研究侵入性疾病的模型形成鲜明对比。

在殖民化事件后进行PBS鼻腔清洗，可以隔离招募到鼻咽的非或轻度粘附细胞，以及任何与粘膜相关的细菌。然而，应该指出的是，这种技术是有限的，因为它不会释放在上皮之间或下方旅行的细胞或细菌，也不会允许收获细胞或细菌，已经本地化到鼻相关淋巴组织（NALT），一个淋巴器官，据报道，是一个潜在的感染地点后，肺炎球菌结肠17，18。如果需要进一步研究NALT，我们建议对这种组织进行微分解剖和去除，以供PSS鼻腔清洗后的研究：由于这两种技术不是相互排斥的，它们可以在同一种动物身上进行。但是，由于RNA收获步骤（使用RNA裂解缓冲器的次生熔岩）具有裂解和破坏性，如果打算收获 NALT，则应省略此步骤。虽然鼻腔清洗是一个技术上挑战较小的程序，对于希望获得更全面的细菌负荷评估，不仅包括粘膜相关细菌，但也包括那些已经侵入鼻咽组织，我们建议收获鼻咽组织后，去除殖民小鼠的上头骨骨和解剖鼻孔内的组织，如其他人19描述。

引起免疫反应的性质取决于宿主和病原体之间的相互作用。迄今已有90多种S.肺炎血清型特征，其致病性和毒性因子表达水平不同，导致20-23岁人群的患病率差异。同样，在小鼠中，据报道，与鼻咽殖民反应相关的免疫反应的程度和动力学取决于殖民菌株本身24。因此，选择适当的菌株用于建立鼻咽殖民化不是一件小事，选择小鼠遗传背景也不是一件小事。图8提供了样本数据，描绘了在C57BL/6背景的雌性小鼠进行鼻腔殖民化后，从3种不同的S.肺炎菌株中清除鼻咽殖民的动力学。表1概述了预期的毒害程度和殖民化时间长度（当在C57BL/6背景中使用时），其中4个S.肺炎临床分离菌株在文献中描述，已知能够建立鼻咽结肠化25：avirulent P 1121 （血清型 23F）26，27低毒性 P1542 （血清型4） 28，中毒 P1547 （血清型 6A）29-31，和广泛使用， 特点良好，高度毒性D39（血清型2）32-36。如果实验目标是严格研究无症状的鼻腔结肠事件，而没有伴随细菌传播到其他组织，我们建议使用avirulent P1121菌株，它的特点是作为一个强大的殖民者，因为更长的殖民事件（在观察清除前28天）是该菌株的标志。通常，与P1121殖民的小鼠将没有侵入性疾病的风险，也不会显示任何临床疾病指标（临时减肥除外）。其余的菌株应根据所需的毒性程度和相关死亡率来使用，毒性不意味着单个小鼠体内的感染程度，而是显示临床疾病迹象的小鼠的比例。还应当指出，通常而言，毒性程度与殖民化持续时间长短成反比，而更毒株的殖民时间较短。所有3种描述的毒株导致小鼠死亡，最常见的是败血症，与全发性肺炎，或并发肺炎和败血症发展在小鼠的子集。入侵细菌本地化的差异可能是菌株特异性的，因为之前有报道说，某些菌株显示特定器官的三分法。在一小部分动物中，自发性脑膜炎也可能在殖民化后发展。通过从动物的末端采集相关组织（肺、脾脏和/或大脑），可以确定死因以及侵入程度。这些组织的同质化和随后的电镀可以指示存在侵入性细菌和相应的滴定。

图3显示了细菌培养密度定量的例子。如果文化过于集中，殖民地生长过于密集，无法单独计数，但如果镀上日志稀释系列，则可以区分来自单个细胞的殖民地。每次稀释电镀三个技术复制品可最大限度地减少变异性。请注意，当量化从鼻腔结肠事件中检索的细菌时，可能会遇到共生污染物，代表从尿素鼻咽中同时分离的其他细菌物种。如果细菌菌株具有任何已知的抗生素耐药性（例如，许多肺炎菌株对根霉素或新霉素的耐药性高达5微克/毫升），则可以通过在适当浓度下用抗生素补充生长介质来尽量减少污染物的发生，从而限制污染物的生长。

流动细胞学可用于分析鼻腔样本上的细胞表面标记。例如，对于在感染环境中招募的细胞类型进行分析，可用于白细胞毛分化的抗体组合，包括巨噬细胞（F4/80+）、嗜中性粒细胞（CD11b+ 和 Ly6G+）和 T 细胞（CD3+ CD4+ 或 CD8+），可像以前发布的那样使用。此外，这些分析可以与对不同组织或血液进行的流动细胞学分析相结合，以更好地了解感染过程中的免疫细胞贩运。由于可以从鼻咽中分离出的细胞数量有限（通常数量为数千个），识别稀有子集通常具有挑战性，尽管希望完成这一任务的研究人员应考虑从多个小鼠中采集样本，以达到所需的细胞计数。此外，由于可以从此区域提取有限的细胞数量，我们建议分析有关总细胞数的数据。

虽然鼻咽中的蛋白质表达水平通常较低，限制了攻击蛋白质生产的可能性，但可以分析宿主分子的产生，以应对RNA水平上的殖民细菌。为此，鼻熔岩可以使用RNA裂解缓冲区代替PBS进行，从而可以分析基因表达。对于 qPCR 放大检测，必须运行相应的分离曲线（图 11），以确保检测到正确和所需的产品。这是因为检测将检测任何双搁浅的DNA，包括引物调光器、污染物DNA和来自误食引物的PCR产品。

我们希望此处描述的方法将鼓励您应用鼻内殖民化模型，以研究宿主对在这个研究不足的区域中重要的病原体的反应。对于某些人类病原体，如 肺炎，先前的鼻咽结肠事件是随后细菌传播的重要前兆，以及随之而来的致命后遗症，包括传播到肺部，这可能导致肺炎，或血液，并导致细菌血症和败血症休克。因此，通过研究该地区的细菌殖民化，我们可以更好地理解如何控制它，防止更严重的病理学完全发生。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢宾夕法尼亚大学的杰弗瑞·韦瑟博士赠送肺炎 链球菌临床菌株。这项工作由加拿大卫生研究所资助。简历由M.G.德格罗特奖学金和加拿大胸科学会的奖学金资助。这项工作由安大略肺脏协会和加拿大卫生研究所（CIHR）资助。鲍迪什实验室的工作部分得到了迈克尔·德格罗特传染病研究中心和麦克马斯特免疫学研究中心的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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免疫学，第83期， 肺炎链球菌，鼻腔，鼻咽，穆林，流细胞学，RNA，定量PCR，招募巨噬细胞，嗜中性粒细胞，T细胞，效应细胞，鼻内结肠
<em>肺炎链球菌</em>在鼻内殖民期间炎症反应的特征
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Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

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