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Immunology and Infection

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

Abstract

연쇄상 구균 폐렴에 의한 비인두 식민지는 폐 또는 혈류량1에침입하는 전제 조건이다. 이 유기체는 비소하린의 점막 표면을 식민지화 할 수 있으며, 여기서 호스트 방어를 극복하고 호스트의 다른 조직에 침입할 수 있습니다. 일반적으로 낮은 호흡기에 감염의 설립은 폐렴귀착됩니다. 대안적으로, 박테리아는 높은 사망률2와연관되는 박테혈증을 일으키는 혈류로 전파할 수 있고, 또는 그렇지 않으면 폐렴구균 수막염의 발달로 직접 이끌어 낼 수 있다. 비인두 식민지의 운동 및 면역 반응을 이해하는 것은 S. 폐렴 감염 모델의 중요한 측면입니다.

비강 내 식민지화의 마우스 모델은 인간모델3로부터 적응하고 비소하린4-7의 숙주 병원체 반응 연구에서 여러 연구군에 의해 사용되어 왔다. 모델의 첫 번째 부분에서, 우리는 인간 성인의 운송 이벤트와 유사한 자기 제한 세균 성 식민지를 확립하기 위해 S. 폐렴의 임상 분리를 사용합니다. 본명 상세절차는 세균성 접종의 준비를 포함하고, 그 다음에는 행정의 비강 내 경로를 통해 접종의 전달을 통해 식민지화 사건의 수립을 포함한다. 상주 대식세포는 정상 상태 동안 비소하린의 주요 세포 유형이다. 전형적으로, 감염되지 않은 마우스에 존재하는 몇몇 림프구가8,그러나 점막 식민지는 면역 반응 및 호스트 면역 세포의 후속 모집귀착될 낮은- 고급 염증 (세균성 종 및 긴장의 독성에 따라 다름)으로 이끌어 낼 것입니다. 이러한 세포는 나레를 통해 기관 내용물의 용암에 의해 격리될 수 있으며, 감염의 운동학을 더 잘 이해하기 위해 식민지 박테리아의 밀도와 상관관계가 있다.

Protocol

시작하기 전에: 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 생물 적 위험 수준 2 (BSL2) 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행됩니다. 실험 개시 전에 기관 지침에 따라 전염성 세균 병원균의 사용에 대한 적절한 생체 위험 승인을 획득했습니다. 또한 사전에 준비된 절차를 수행하는 데 필요한 모든 재료와 시약이 있는지 확인하십시오. 이 실험에 사용된 마우스는 잭슨 연구소, 찰스 강 또는 타코닉에서 여성 C57BL/6 마우스를 포함하고 나이의 10-14 주 (비록 우리는 비강 식민지 정리 또는 감염의 운동에서 어떤 성별 의존 유의 차름을 발견하지 않았지만). 이러한 실험에 사용된 모든 마우스는 특정 병원체 없는 조건하에서 사육 및 유지되었으며, 일반적인 바이러스(LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV 및 기타)박테리아(예: H. 파일로리)및 기생충(예: 핀웜, 자궁내기생충)이 배설물 샘플 검사뿐만 아니라 빈번한 원자성 평가에서 빈번한 원자성 평가에 의해 사육되고 유지되었다. 이 실험을 실시할 때, 우리는 10-12 주 이하의 통제 마우스를 사용하고 나이의 6 달 이하를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이 나이 범위 보다는 더 젊거나 더 오래된 마우스는 더 긴 비인두 운송 기간 및 감염을 전파의 증가한 가능성에 더 영향을 받기 쉽습니다. 마우스 배경은 여러 그룹이 다른 유전 적 배경의 마우스가 S. 폐렴 D39 (혈청형 2) 균주에 다른 감수성을 가지고 있음을 입증했기 때문에 식민지 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 또 다른 중요한 고려 사항입니다9,10. S. 폐렴은 자연적으로 발생하는 뮤린 병원체가 아니며 유일한 천연 저수지는 인간 비소하린입니다. 전염은 호흡기 물방울을 통해 발생하며, 마우스가 호흡기 분비를 일으키지 않기 때문에 개별 마우스는 박테리아를 다른 마우스로 전송할 수 없으므로 마우스 대 마우스전송(11)에대한 우려는 없다. 이 원고에 설명된 절차에 대한 시각적 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. S. 폐렴 문화의 준비

  1. 연쇄상 구균 폐렴의현탁액 성장을위한 트립틱 콩 통 5 ml을 접종하십시오.
  2. 세균성 접종이 600nm로 설정된 주행계에 의해 결정된108 CFU/ml의 해당 액체 밀도로 로그 상 성장에 도달할때까지 37°C에서 정전기 조건하에서 배양. 이 CFU에 대응하는 정확한 판독값은 특정 선택된 세균균균에 따라 다릅니다. S. 폐렴의 대부분의 변종에 대 한이 0.45-0.55의 OD600 범위에 해당 합니다. 일반적으로, 액체 배양에 있는 S. 폐렴 긴장은 분과에 대한 필요없이, 권장조건하에서 1.5-2.5 시간 안에 이 조밀도로 증가할 것입니다. 배양은 박테리아가 더 이상 로그 상 성장에 있지 않고 광범위한 자동 분해를 겪고있는 지점을 나타내기 때문에 (0.75의 OD 판독을 넘어) 과잉 성장해서는 안됩니다.
  3. 각 마우스는 약 107개의 박테리아로 접종됩니다. 따라서, 9개의 마우스마다, 에펜도르프 튜브에 접종 1ml를 하고 1분 동안 15,000 x g에서 회전한다. 희미한 펠릿을 보아야 합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고 인산완충식염수(PBS)의 100μl에서 박테리아를 재보페치하여 농도를109 CFU/ml로 증가시킨다. 이 단계에서 박테리아는 실행 가능한 남아 있어야 하지만 쉽게 복제 하지 않습니다.
  4. 여러 aliquots를 사용하는 경우 박테리아 밀도의 약간의 샘플 간 변이를 제어하기 위해 하나의 튜브로 결합하십시오.
  5. 예방 접종이 준비될 때까지 박테리아를 얼음 위에 두십시오.
  6. 정확한 세균 성 수를 얻으려면 깔끔한 세균 성 무접종으로 시작하여 로그 현명한 직렬 희석 시리즈를 수행하십시오. 멸균 PBS의 90 μl에 10 μl을 추가, 연속적으로 10 배 희석.
  7. 희석 10 μl 샘플 10방울-5 -10 -9,PBS 전용 오염 조절, 5%의 양혈액으로 보충된 트립스틱 대두 한천(TSA) 플레이트의 별도로 표지된 섹션에 플레이트아웃(그림2). 파이펫 팁이 더 높은 CFU 농도에서 낮은 CFU 농도로 희석하여 과도한 박테리아를 운반하고 결과의 가변성을 증가시키는 것을 피하기 위해 각 단계에 대해 변경되었는지 확인합니다. 인간의 혈액 통 (HBA) 플레이트는 또한 TSA 대신에 사용될 수있다. S. 폐렴의 많은 변종은 네오마이신 (5-20 μg/ml에서)에 내성이 있기 때문에, 이 항생제는 또한 플레이트 준비 단계 도중 선택의 한천 매체에 추가될 수 있습니다. 이것은 저항하지 않는 박테리아를 제거하기 때문에 열거를 용이하게합니다. 각 균주의 항생제 감수성은 각 세균성 균주에 대해 사용하는 항생제의 최적의 농도를 결정하기 위해 사전에 테스트되어야합니다.
  8. 15-30분 동안 건조한 다음 플레이트를 덮고 세균 인큐베이터에 37°C 및 5% CO2로설정하여 거꾸로 놓습니다. 24 시간 동안 접시에 세균성 식민지를 성장.
  9. 식민지 형성 단위의 수와 해당 농도를 결정합니다. OD600 값의 결정에 기초하여, 농도는 1-4 x 109 CFU/ml. S. 폐렴 식민지의 범위 내에 있어야 하며, 중앙에 작은 우울증이 있는 작은 황색 베이지색으로 나타나야 하며, 중심에 작은 우울증이 있어 도넛모양(그림3).

2. 뮤린 내트라비슬 식민지화

  1. 마우스 제지 장치(팁이 잘린 50ml 팔콘 튜브)에 마우스를 고정하여 마우스를 엄지손가락으로 몸의 바닥에 고정하여 코가 테이퍼 장치의 테이퍼 끝에서 나올 수있도록(도 4). 이 장치를 사용하면 마우스의 머리를 고정하고 나레의 분리를 움직임을 최소화하고 동물의 피펫 팁을 마스티로 삼는 시도를 방해하여 접종을 완벽하게 전달할 수 있습니다. 대안적으로, 마우스는 목과 수동 구속을 스커핑하여 고정될 수 있다. 우리는 비강 내 접종 전에 동물의 마취를 권장하지 않습니다. 마취 하에 동물에게 접종을 하면 폐로 확산되는 일부 접종이12,13개됩니다.
  2. P10 또는 P20 파이펫을 사용하여, 준비된 문화의 10 μl을 증착하여 각 마우스를 접종하고, 두 나레스 사이에 균등하게 분배합니다(접종을 서서히 맥동시켜 코에 침을 물고, 마우스가 접종을 흡입하는 데 시간이 걸리도록 하십시오). 무분비의 완전한 전달을 달성하기 위해 마우스가 코를 과도하게 움직이기 시작하는 시점에서 일시 중지 관리. 마우스가 호기 하는 동안 코를 통해 일부를 추방 수 있습니다 전체 접종 nares에 주입 되지 않을 수 있습니다.; 그러나, 추방된 양은 극소수인 경향이 있고, 접종은 매우 많은 양의 박테리아를 함유하고 있기 때문에, 이것은 식민지 세균 부하에 크게 영향을 미치지 않습니다. 추가적으로, 비인두 점막에서 식민지화에 사용할 수 있는 표면적은 제한적이며, 결과적으로 우리 와 그 외는 권장된107 용량이 모든 마우스에서 일관된 수준의 박테리아를 얻기에 충분하다는 것을 발견하여 초기 식민지 세균의 초기 양에서 최소한의 변동성을 초래한다14,15.
  3. 최종 점 모니터링의 일환으로 중량 지표를 활용하는 경우 마우스의 무게를 측정합니다. 혼수, 주름 모피 및 체중 감소를 포함하여 임상 증상에 대한 매 12-24 시간 마다 마우스를 모니터링하십시오. 마우스는 전형적으로 3-5 일 식민지 후에 질병의 현상을 보여주지 않을 것이고, 이들은 총 체중의 약 5%를 평균할 수 있는 체중 감소에 선행될 것입니다. 마우스가 점점 아프게 됨에 따라 그들은 구부러진 자세를 가정하고 감소 된 활동과 핸들링을 포함하여 자극에 대한 반응성을 감소시다. 이 단계에서, 질병은 전형적으로 패혈증 및/또는 폐염의 표시이고 마우스가 결과를 향상하기 위하여 매일 피하 식염수의 1 ml로 취급될 수 있더라도, 말단일 것입니다. 살아남은 마우스는 하루 7 식민지 후 개선을 보여주는 시작 한다, 체중 증가 다음 체중의 안정화에 의해 입증, 비록 S. 폐렴의 다른 긴장 더 신속 하 게 질병을 유도 하 고 다른 타임 라인을 따라 임상 증상의 진행 귀착 될 수 있습니다. P1547 균주와 함께 식민지화된 마우스에서 추적된 체중의 대표적인 결과에 대해서는 도 5를 참조하십시오.

3. 비강 용암 샘플 수집

시작하기 전에: 26 3/8 G 베벨 바늘로 덮인 1ml 주사기를 사용하여 캔누울린 바늘을 준비하십시오. 2.5cm의 PE20 폴리에틸렌 튜빙을 0.38mm의 안쪽 직경으로 자르고 각 끝에 는 경작팁을 갖습니다. 집게를 사용하여 2.5cm 길이의 PE20 폴리에틸렌 튜브(내부 직경 0.38mm)를 바늘 끝에 밀어 튜브 측면을 뚫지 않도록 합니다. 캔누울린 바늘은 필요할 때까지 70% 에탄올에 보관할 수 있습니다.

  1. 실험마우스를 안락사시합니다. 자궁 경부 탈구는 잠재적으로 기관을 손상시킬 수 있기 때문에, 안락사의 이 방법은 피해야 합니다. 우리의 바람직한 방법은 이소플루란 마취 다음에 흥분, 그러나, 안락사의 모드를 선택할 때 제도적 지침을 따르도록 합니다.
  2. 70% 수성 에탄올을 사용하여 동물의 수퍼오엔테리어 모피, 특히 목을 살균하여 에탄올이 나레에 접근하는 것을 방지합니다.
  3. 동물의 목 의 중간선을 따라 하나의 세로 컷을 하고 양쪽 끝에 두 개의 수평 컷을 만들어 기관지 구상을 위한 개방을 만듭니다.
  4. 양쪽으로 피부를 조심스럽게 벗겨 내고 목 조직을 드러냅니다.
  5. 기관체는 양쪽에 세로 근육에 둘러싸여, 볼 수 있어야합니다. 조심스럽게 기관 자체의 명확한 보기를 제공하기 위해 이들을 잘라, 주변 혈관을 끊지 않도록주의.
  6. 혈관이 절단되고 혈액이 존재하는 경우, 진행하기 전에 출혈을 멈추고 멸균 PBS를 분배하고 멸균 거즈를 사용하여 부위를 여러 번 정화하여 부위에 여분의 수분을 부드럽게 흡수하십시오.
  7. 기관체가 제대로 노출되면, 반쯤 올라가면 기관에서 횡반, 반달 컷을한다(그림 6).
  8. 이전에 준비된 캔누클 바늘에 멸균 된 PBS의 1,000 μl을 그립니다.
  9. 캐뉼라를 코쪽으로 기관으로 삽입하여 삽입용으로 아래쪽을 가리키는 베브 엣지를 유지합니다(그림7). 바늘이 제자리에 있으면 180 °를 회전시키고 빛 저항을 느낄 때까지 부드럽게 위쪽으로 조사하십시오.
  10. 마우스코 바로 아래에 샘플 수집을 위해 지정된 Eppendorf를 배치합니다.
  11. PBS 용암 유체의 최소 (~20 μl) 양을 분배하여 바늘의 올바른 배치를 테스트하십시오 - 액체 방울은 마우스의 암골 주위에 형성되어야합니다. 이 경우 3.13 단계로 진행하십시오.
  12. 테스트 PBS가 동물의 입밖으로 직접 나타난다면, 캐뉼라를 뒤로 당기고, 매우 약간의 저항이 느껴질 때까지 다시 부드럽게 앞으로 재조사하여 재배치하십시오 - 비강 구개 과거를 그리고 구강을 통해 캐뉼러를 너무 멀리 밀어 내지 않도록주의하십시오.
  13. 바늘의 내용을 신속하게 분배하여 최대 양의 세포를 대체하고 수집합니다 - 내용은 마우스의 나레를 통해 수집 튜브로 흘러 나가야합니다. 샘플을 얼음 위에 즉시 놓습니다.
  14. RNA 분석을 위한 샘플을 수집하기 위해 동일한 마우스에 RNA 용해 버퍼 500 μl을 포함하는 캔누클 바늘을 사용하여 3.8-3.13단계를 반복한다. 이것은 비부착 세포가 초기 PBS lavage 다음 제거되어야 하기 때문에, 비인두 점막 상피로 크게 구성된 나머지 세포 집단에서 lysate 견본의 집합을 허용할 것입니다. RNA 리시스 버퍼는 상피를 비우고 주변 조직을 파괴하므로 이러한 조직의 유지가 원하는 경우 폐와 같은 장기와의 접촉을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 수집되면 RNA 용해 버퍼에 샘플을 드라이 아이스에 직접 배치하여 스냅 동결하십시오. 리시스 버퍼에 들어가면, 샘플은 제조업체의 지침에 따라 저장될 수 있으며 일반적으로 몇 달 동안 -70°C에서 안정적입니다.

4. 나소판스의 세균 부하 결정

  1. 각 뮤린 비강 용암 샘플에 대한 직렬 희석 계열을 준비하여 박테리아를 양수합니다. 일반적으로 세균 부하는 0-104 CFU 사이로 예상될 수 있으므로 3개의 10배 직렬 희석을 수행합니다. 10-1 CFU/ml의 농도에10-1 CFU/ml. 소용돌이의 농도에 깔끔한 비강 용암 샘플 (100 CFU/ml)의 10 μl을 추가합니다.
  2. 박테리아 판을 사분면으로 나누고, 희석 계열의 부재(100-10-3 CFU/ml)의 부재로 각각 사분면라벨을 부착합니다. 도 2에서와 같이 3 희석제의 10 μl 샘플과 트립틱 콩 한천 판의 깔끔한 샘플 3 방울을 접시에 놓습니다.
  3. 15-30 분 동안 건조 한 다음 접시를 덮고 세균 성장을위한 최적의 조건 (일반적으로 37 °C 및 5 % CO2)을사용하여 세균 인큐베이터에 거꾸로 놓습니다.
  4. 18-24 시간 동안 접시에 세균 성 식민지를 성장.
  5. 각 희석에 대해 플레이트에 형성된 콜로니를 평균화하여 식민지화 세균의 수를 결정한다(도3). 도 8은 비강 용암의 배양에 의해 결정된 바와 같이, 최대 21일 동안 S. 폐렴의 3가지 균주로 식민지화된 마우스에서 다른 시간대 동안 세균밀도를 나타낸다.

5. 유동 세포계에 대한 샘플 준비

시작하기 전: 항체의 혼합을 준비합니다. 백혈구 집단의 정량화를 위해, 지정된 희석제에서 다음 혼합을 권장합니다: PE-Ly6G (클론 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (클론 AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (클론 30-F11, 2.67 μg/ml), APC-F4/80 (클론 PM8 RUO, 0.67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD14 (C5.5-CD14 0.5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (클론 M1/70, 0.33 μg/ml), 알렉사 플루오르 700-CD3 (클론 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (클론 GK1.5, 6.67 μg/ml). 이 믹스는 2배 농도(5.5단계 참조)입니다. 모든 항체는 FACs 워시 버퍼(0.5% 태아 종아리 혈청, 2mM EDTA, PBS의 0.1% 나트륨 아지드)에서 희석되어야 하며, 사전에 제조해야 한다. 상류형 대조항체의 혼합물에서, 이상적으로는 표지된 항체와 동일한 공급업체로부터 특정 항체와 동일한 농도로, 제조되어야 한다. 등류형 대조군 항체로 처리된 견본은 음성 대조군으로 작동합니다. 동위원소 조절 항체로 처리된 견본에서 관찰된 임의의 형광은 배경으로 간주되어야 합니다.

  1. 1.5ml 에펜도르프 튜브를 4°C로 회전할 수 있는 원심분리기를 미리 식힙니다.
  2. 원심분리기 비강 용암 샘플은 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 샘플링합니다. 신중하게 상체를 피펫하고 예약합니다. 참고: 비소하린스 내의 소량의 세포로 인해 원치 않는 적혈구 오염이 없는 한 세포 펠릿이 보이지 않을 것이며, 이는 밝은 빨간색입니다. 이 경우 샘플을 삭제해야 합니다.
  3. Fc의 50 μl에서 샘플을 재중단? RIIb/CD16-2 (2.4G2) 항체(Fc 수용체를 결합하고 비특이적 항체 결합을 감소시키는) FACs 워시 버퍼의 농도4 μg/ml.
  4. 30 분 동안 얼음에 샘플을 배양.
  5. 미리 준비된 2x 농축 형광 항체 혼합물의 50 μl을 샘플에 추가합니다. 각 실험 군에서 대표 샘플을 따로 떼어 내어 등류형 대조군역할을 한다. 얼룩 혼합 대신이 샘플에 등형 항체 믹스를 추가합니다.
  6. 얼음에 샘플을 1 시간 동안 배양하십시오.
  7. 원심분리기 샘플은 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 샘플링합니다. PBS의 200 μl에서 상체를 폐기하고 다시 중단하십시오.
  8. 5.7 단계를 반복합니다.
  9. 두 번째 세척 후 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 2,000 x g로 다시 샘플을 채취한다.
  10. PBS (즉시 샘플을 실행하는 경우) 또는 2 % 파라 포름 알데히드 (샘플을 실행하는 경우 1-3 일 후 염색)에서 다시 중단합니다.
  11. 유동 세포측정을 수행할 때 샘플당 최대 이벤트 량을 수집하거나 전체 샘플이 흡입될 때까지 수집합니다. 감염되지 않은, 건강한, 젊은 마우스에서, 이것은 1,000-2,000 총 이벤트만큼 적게 될 것입니다; 세균성 식민지 화 이벤트 동안,이 수는 동물및 나이 및 유전 배경과 같은 요인에 있는 질병 상태에 의존하는 2-5 배 이상 증가할 수 있습니다. 도 9는 샘플 수집 전에 사용하려는 특정 유동 사이토미터에 대한 매개 변수를 최적화하는 것이 좋습니다하지만, 3 레이저 벡톤 디킨슨 LSRII 흐름 세포계에서 수집된 대표적인 유동 세포측정 결과를 보여 주며, 450의 전방 분산 및 300의 사이드 스란시를 사용하여 세포계를 최적화하는 것이 좋습니다. 참고: 샘플에 미량의 혈액 오염이 포함되어 있는 경우 수집된 총 이벤트가 예상보다 훨씬 높으며 샘플은 분석에서 할인되어야 합니다.

6. 양적 PCR (qPCR) 비강 용암 분석

  1. 해동 셀은 3.14 단계 실온에서 lysates.
  2. 선호하는 RNA 추출과 함께 제공되는 권장 프로토콜을 따르십시오.
  3. 지시에 따라 RNA 추출 절차를 완료한 후, 분광광계 또는 전기포고계 를 사용하여 RNA의 양을 정량화한다(도10). 우리는 정기적으로 260/280 nm 비>1.7 또는 RNA 무결성 수 (RIN) 주위에, 8.1±0.13와 샘플 당 975 그리고 3,250 ng 총 RNA 사이에서 취득합니다.
  4. 1,000 ng의 RNA (최대 13 μl)를 가진 제조자의 프로토콜에 따라 M-MULV 역 전사를 사용하여 cDNA를 전사한다.
  5. 생성된 cDNA 샘플을 8배, 알리쿼트는 -20 또는 -80°C에서 장기 저장을 위해 4개의 개별 튜브로 동등하게 희석합니다.
  6. qPCR에 의한 유전자 발현을 측정하기 위해, 얼음 또는 차가운 블록에 삼중비로 25 μl 샘플 반응을 준비: 2x qPCR 마스터 믹스의 12.5 μl qPCR 마스터 믹스 의 qPCR 키트의 qPCR 키트, 0.25 μl 참조 염료, 희석 된 cDNA의 2 μl (단계 7.5), 혼합 된 전방 및 역 프라이머의 1 μl (400 nM 최종), 9.25 μL 의 자유 Rna. 이 프로토콜은 이전에 게시된메서드(16)의적응입니다.
  7. 일반적으로 우리는 2 단계 qPCR 증폭 (95 °C 10 분 동안 95 °C)이 최대 40 사이클 x [95 °C x 15 초, 60 °C x 1 분]) 효과가 있음을 발견합니다(도 11a); 그러나 각 프라이머 쌍을 최적화해야 합니다. 비특이적 증폭이 발생하지 않도록 증폭 후 해리(용융) 곡선을 수행해야 합니다. 증폭(도 11b)
  8. 우리는 분석된 각 유전자에 대한 표준 곡선뿐만 아니라 분석된 각 96웰 플레이트에 대한 표준 교정기(폐 또는 비장 균주에서 파생됨)를 정기적으로 실행합니다. 상대적 성적증명서 양은 먼저 기준 염료에 의해 원시 주기 임계값(Ct) 값을 정상화하고 각 표준 곡선을 통해 결과값을 변환하여 얻어진다. 이러한 상대적 양은 이후에 표준 교정기 및 가사 유전자로 정규화됩니다.

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Representative Results

그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약한 개요 회로도를 나타냅니다. 도 2-3은 본 원에 기재된 프로토콜에 내재된 미생물 방법론의 시각화를 제공한다. 도 4는 내비강폐를 수행하기 위해 마우스의 적절한 위치를 나타내고, 도 5는 S. 폐렴 균주 P1547로 식민지화된 마우스의 무게의 전형적 변화를 묘사한다. 도 6-7은 이러한 두 기술의 보조 시각화를 위해 공정의 비강 용암 부분의 특정 단계를 나타낸다. 도 8-11은 비강 용암 다음 마우스의 비소하린으로부터 수집된 샘플에 대한 분석의 대표적인 결과로 구성된다. 구체적으로, 도 8은 비소하린의 세균부하의 대표적인 결과이며, S. 폐렴균제 P1121, P1547 또는 P1542로 식민지화된 마우스로부터 얻어진 비강 용암의 배양을 통해 결정된다. 도 9는 유동 세포측정 기술을 사용하여 분리된 비인두 면역 세포의 세포 피노티핑을 나타낸다. 도 10-11은 양적 PCR을 통해 비인두 mRNA의 발현 분석에 관련된 대표적인 결과를 나타내는 수치이다.

Figure 1
그림 1. 마우스 모델을 이용한 비강 내 접종 및 비강 용암 세포 격리 절차의 흐름 차트. 첫째, 박테리아는 접종을 위해 준비되고, 그 후 무두피에게 내트라나시로 주어집니다. 원하는 시간 경과 후, 마우스는 말단 출혈을 통해 안락사되고, 그들의 비인두 세포는 두 개의 비강 용암 단계를 통해 격리됩니다: PBS 세척 단계는 RNA 용해 완충제에서 이차 세척에 선행됩니다. 예비 PBS 세척에서 세포는 유동 세포측정기 기술을 사용하여 격리및 분석되고, 제2 샘플로부터 분리된 RNA는 전사 수준에서 관심 있는 분자의 상대적 풍부를 조사하는 데 사용될 수 있다.

Figure 2
그림 2. 세균 농도를 결정하기 위해, 10 μl 방울은 다른 직렬 희석을 나타내는 섹션으로 나누어 플레이트에 삼중판으로 도금된다. 이러한 방울은 건조할 수 있으며 플레이트는 37°C, 5% CO2에서하룻밤 사이에 배양됩니다.

Figure 3
그림 3. 대표적인 동물의 비소하린으로부터 분리된 연쇄상 구균 폐렴의 농도. 각 이산 식민지는 하나의 식민지 형성 유닛을 나타내며, 각 콜로니 컬렉션은 10 μl 낙하(삼중로도금)를 나타내며 플레이트의 각 사분면은 별도의 직렬 희석을 나타낸다. 세균 성 농도는 CFU / ml에서 계산 가능한 수의 수를 평균하여 결정됩니다, 완전히 형성 된 식민지 내에서, 그리고 그 사이에, 자격 사분면.

Figure 4
그림 4. 접종할 마우스의 움직임을 최소화해야 하며, 특히 목에서 세균성 접종을 적절히 전달할 수 있도록 해야 합니다. 이를 위해 피험자 마우스는 테이퍼 엔드에 조리개가 있는 50ml 팔콘 튜브로 구성된 수정된 제한 장치에서 제지됩니다. 마우스는 그 코가 개구에서 나올 수 있도록 위치, 그것은 연구원에 의해 액세스 할 수 있습니다, 내 비강 접종을 수행 할 수 있도록.

Figure 5
그림 5. 스트레인 P1547로 식민지화된 마우스의 무게는 비인두 식민지화 후 예상되는 체중의 전형적인 변화를 묘사하기 위해 초기 접종(n=6)에 따라 매일 추적되는 최소 2개의 대표적인 실험에서. 무게는 초기 무게의 백분율 변경으로 표시됩니다. 3-5일 사이에 예상되는 급격한 초기 체중 감소, 안정화 및 생존 마우스의 중량이 점진적으로 증가하는 점에 유의하십시오.

Figure 6
그림 6. 기관 노출시, 측면 경도 근육은 주변 혈관을 심각하지 않는 방식으로 기관 절개 전에 신중하게 제거됩니다. 작은 반달 절개는 다음 좋은 수술 가위를 사용하여 기관 의 중간까지 이루어집니다. 기관지의 직경을 부분적으로만 잘라 서 후방으로 그대로 두는 것이 중요합니다.

Figure 7
그림 7. 코쪽으로 위쪽으로 기관 조리개에 캐누우바늘을 삽입합니다. 캐뉼라가 제자리에 있으면 저항이 충족될 때까지 부드럽게 프로브한 다음, 나레를 통해 내용물들을 플러시합니다.

Figure 8
그림 8. S. 폐렴 균주 P1547 (A), P1542 (B) 또는 P1121 (C)를 가진 C57BL/6 마우스 (삼각형)의 식민지화에 따라 기술된 비강 용암 절차를 사용하여 비강 용암 절차로부터 분리된 대표적인 세균 부하 시리즈. P1121 식민지화 에 따른 BALB/C 마우스(원)의 비교 식민지화도(C)에표시된다. 3일, 7일, 14일, 21일을 포함하여 식민지 화 의 과정 전반에 걸쳐 다른 시간점이 표시됩니다. 일반적으로 3일째에는 초기 하중이 높을 것으로 예상되며 7일째에는 감소가 거의 없습니다. 클리어런스는 일반적으로 14일째에 시작되며, 대부분의 균주와 식민지화 후 21일까지 전체 또는 거의 완전한 클리어런스가 입증됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9. 유동 세포측정에 의해 분석된 바와 같이, 뮤린 비강 용암으로부터 분리된 총 세포의 대표적인 히스토그램(A) 및 도트 플롯(B). 세포 집단에 마커의 차동 발현은 이러한 단백질에 대한 형광 항체의 사용을 통해 백혈구 하위 집합의 식별을 허용한다. 여기서 나타낸 바와 같이, 백혈구 집단은 전방 분산(area)과 전방 분산(폭)게이트(A)를사용하여 단일 세포에서 먼저 게이팅한 다음 해당 하위집합(B)내의 CD45+ 셀에 대해 보강함으로써 선택된다. 이 인구는 CD11b 및 Ly6G 이중 양성 호중구(C)에 대해게이팅하여 특정 세포 유형으로 더 세분화될 수 있다. CD11b-모집단의 분석은 F4/80+, CD11b-대식세포(D)또는 CD11b-, CD3 및 CD4 이중 양성 CD4 T세포(E)를공개하기 위해 실시될 수 있다. 세포 인구는 하나, 또는 다른 세포 유형과 구별하는 데 사용할 수있는 여러 고유 표면 수용체의 조합을 표현하는 한 표현형일 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
그림 10. 황두반 비강 용암으로부터 분리된 시료의 전기포레시스 자동 시퀀싱을 따르는 대표적인 전기페로그램. 생성된 전기페로그램은 비인두 부위로부터 유래된 고품질 총 RNA 샘플의 수량 데이터와 특징적인 시그니처를 나타낸다. 총 RNA의 분석을 수행할 때, 2개의 중요한 리보소말 RNA, 18S 및 28S를 위한 RNA 피크의 밑에 있는 지역은, 그들의 상응하는 비율을 계산하기 위하여 이용됩니다. 18S 및 28S에 기인하는 봉우리비율에 있는 중요한 변경은 전형적으로 저하된 RNA의 표시입니다. 저하 정도는 RNA 무결성 수(RIN)에 의해 요약될 수 있습니다. 이 대표적인 샘플에 대한 RIN은 8.1입니다. 고도로 저하된 RNA의 예는(B)및(C)에나타내며, 후속 RIN은 각각 1.9 및 4.6이다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 11
그림 11. 증폭 플롯(A) 및 비강 세척 세포 용액의 qPCR 분석에서 해리(융) 곡선(B)은, 이 두 판독이 일반적으로 뮤린 비소하린으로부터 분리된 mRNA 제품의 효율적이고 정확하게 검출된 증폭을 따라 어떻게 봐야 하는지에 대한 예를 제공한다. 대표되는 가사 유전자(18S)에 대한 표준 곡선이다. (A)에표시된 결과는 GAPDH에 대한 프라이머를 사용하여 증폭후 원하는 PCR 제품을 표시한다. 선은 주기 임계값(Ct)을 나타냅니다. 상이한 샘플에 대응하는 증폭 플롯이 이 임계값을 교차하는 지점은 샘플 간에 비교할 수 있으며, 그 안에 포함된 더 높은 양의 RNA에 해당하는 값이 낮습니다. 플롯(B)은qPCR 제품의 최대 용융 온도가 85 °C이며 이 반응에 오염 물질이 존재하지 않는다는 것을 나타내며, 이는 원하는 제품 피크와 는 별개로 추가 피크로 나타날 것이다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

스트레인 이름 세로타입 독성 마우스의 사망률 예상 식민지 화 지속 시간
P1121 23F 무증상 0% 21-28일
P1542 4 낮다 0-20% 21-28일
P1547 6A 중간 20-50% 14-21일
D39 2 높다 70-100% 14-21일

표 1. 일반적으로 사용되는 4개의 표형 개요는 일반적으로 사용되는 S. 폐렴 임상 분리 균주, 해당 혈청형 수, 관련 된 독성 정도, 마우스의 식민지화 된 하위 집합 내의 침략성 및 비인두 식민지의 전형적인 기간 내에서 침략의 예상 비율.

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Discussion

이 연구에서는 연쇄상 구균 폐렴의 임상 분리 균주와 박테리아에 대한 응답으로 nasopharynx에 모집 된 면역 세포의 후속 격리 및 특성화를 사용하여 마우스의 비강 내 식민지화를위한 자세한 방법을 제시했습니다. 우리는 어떻게 세균성 접종이 영양이 풍부한 매체에서 배양되고 처음에 비소하린으로 제한되는 마우스에 있는 식민지 사건을 설치하는 데 사용될 수 있는지 보여주었습니다. 그런 다음 비소하린에 모집되는 면역 세포 유형에 어떻게 반응하는지 기관 노출, 절개 및 칸침바늘을 사용하여 비강 용암을 분리할 수 있는지 를 보여주었습니다. 비강 용암 샘플은 PBS에서 수집되어 그대로 가볍게 부착된 세포를 분리할 수 있습니다. RNA는 보다 단단히 부착된 세포및 주변 상피 점막 층으로부터 RNA 용해 완충제로 구성된 이차 세척을 적용하여 분리될 수 있다. 이들 샘플의 전자는 유동 세포측정 기술을 통해 식민지화의 맥락에서 모집된 특정 세포를 표현하는 데 사용될 수 있으며, 후자는 Q-PCR 분석에 적용될 수 있으며, 이러한 모집된 세포의 이펙터 기능을 파악하여 관심 있는 면역 조절자의 전사적 발현을 확인한다. 비강 용암 샘플은 또한 특정 연구 질문을 해결하기 위해 다른 실험 그룹을 비교하는 세균 식민지 이벤트의 간격의 역학을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비강 식민지의 활용은 처음에 동물의 비소하린으로 제한되는 식민지 이벤트의 설립을 허용한다. 따라서 혈액 이나 장기에 박테리아의 후속 보급 따라서 비인두 점 막 내에서 국소화 된 면역 방어위반에 이차 발생. 이 모형을 통해 달성된 단계적 진행은 인간에 있는 폐렴구균 침략의 과정을 더 정확하게 반영합니다, 하나는 식민지 박테리아와 호스트 비강 점막 사이 역학을 연구하는 것을 허용합니다 - 그리고 아마도 더 나은 세균성 병원성 및/또는 전파 질병의 발달을 허용하는 호스트 면역에 있는 교대를 이해할 수 있습니다. 이는 초기 식민지화 사건의 확립을 포기하고 내트라샤엘 주입을 통해 폐에 세균 성 접종을 직접 전달하여 침습적 질병을 연구하기로 선택한 모델과는 대조적으로, 혈관 주사를 통해 혈액또는 복막 주사를 통해 복막으로.

식민지 화 사건 다음 PBS 비강 용암을 수행하면 비 또는 약간 부착 된 세포의 격리를 허용비 소폐인에 모집, 뿐만 아니라 점막 관련 박테리아. 그러나 이 기술은 상피 사이 또는 그 아래를 여행한 세포 나 박테리아를 방출하지 않기 때문에 제한되며, 비강 관련 림프구 조직 (NALT)에 국소화 된 세포 또는 박테리아의 수확을 허용하지 않으며, 폐렴 구균 결장17,18에따른 감염의 잠재적 인 사이트로 보고된 림프구 기관임을 주목해야한다. NALT의 추가 연구가 바람직한 경우에, 우리는 PBS 비강 용암 다음 연구를 위한 이 조직 도매의 미세 절제 및 제거를 추천합니다; 이 두 가지 기술은 상호 배타적이지 않기 때문에 동일한 동물에서 수행 될 수 있습니다. 그러나 RNA 수확 단계(RNA 용해 완충제를 이용한 이차 용암)의 용사 및 파괴성으로 인해 이 단계는 NALT를 수확하려는 경우 생략되어야 한다. 비강 용암은 덜 기술적으로 도전적인 절차이지만, 점막 관련 박테리아뿐만 아니라 비인두 조직을 침범 한 박테리아를 포함하는 세균 부하의 보다 포괄적 인 평가를 얻고자하는 그룹에 대해, 우리는 식민지 마우스의 상부 두개골 뼈를 제거하고 비강 내 의 두개골 뼈를 제거 한 다음 비인두 조직을 수확하는 것이좋습니다.

유도된 면역 반응의 본질은 호스트와 병원체 사이 상호 작용에 달려 있습니다. S. 폐렴의 90 개 이상의 혈청형은 현재까지 특징이되어 왔으며, 모두 병원성 및 독성 인자 발현의 다른 수준으로, 인간인구20-23의차동 유병률을 초래한다. 유사하게, 마우스에서는, 비인두 식민지에 반응하여 유도된 면역 반응의 정도 및 운동학의 정도가 식민지균 자체에 의존하는 것으로보고되었다(24). 따라서, 비인두 식민지의 확립을 위해 활용하는 적절한 균주의 선택은 사소한 문제가 아니며 마우스 유전 적 배경의 선택도 아니다. 도 8은 C57BL/6 배경에서 여성 마우스의 비강 내 식민지화에 이어 3가지 다른 S. 폐렴균주에서 비인두 식민지화의 비인두 식민지화의 틈새의 운동을 묘사하는 샘플 데이터를 제공한다. 표 1은 4S로 예상되는 식민지 시간의 독성 정도 및 길이(C57BL/6 배경에서 활용될 경우)에 대한 개요를 제공한다. 문헌에 기재된 폐렴 임상 분리균은 비인두 식민지화를 확립할 수 있는 것으로 알려져 있다25:avirulent P1121 (혈청형 23F)26,27 낮은 독성 P1542 (세로형 4)28,중간 형골 P1547 (혈청형4)28, 중간 형골 P1547 (3형) 널리 사용된다. 잘 특징, 매우 악성 D39 (혈청형 2)32-36. 실험목표가 다른 조직에 동반되는 세균성 보급없이 무증상 비강 식민지화 사건을 엄격하게 연구하는 경우, 대장내외 의 연장 이벤트(관찰된 클리어런스 28일 전까지)가 이 균주의 특징이기 때문에 강력한 식민지로 특징지어지는 avirulent P1121 균주를 사용하는 것이 좋습니다. P1121로 식민지화된 마우스는 침습성 질환의 위험을 실행하지 않으며 질병의 임상 지표를 표시하지 않습니다 (일시적인 체중 감소를 제외하고). 균주의 나머지는 개별 마우스 내에서 발생하는 감염의 정도가 아니라 질병의 임상 징후를 표시하는 마우스의 비율을 의미하는 독성과 함께, 독성의 원하는 정도에 따라 고용되어야한다. 그것은 또한 주목 해야 한다 일반적으로, 독성의 정도 식민지 기간의 길이 반대로 상관 관계, 시간의 짧은 기간 동안 식민지 더 악성 긴장. 기술된 악성 균주의 모든 3은 마우스의 하위 집합에서 발생하는 충미성 폐렴, 또는 동시 폐렴 및 패혈증으로 인해 마우스에서 사망률로 이어집니다. 침습적 박테리아의 국소화의 차이는 변형 특정 수 있습니다., 그것은 이전에 특정 균주는 특정 장기에 대 한 트로피즘을 보여 보고되었습니다.37. 동물의 작은 비율에서, 자발적인 뇌막염은 또한 식민지 다음 발전할 수 있습니다. 죽음의 원인의 결정, 뿐만 아니라 침략의 정도, 관련 된 조직의 수집을 통해 달성 될 수 있다 (폐, 비장 및 뇌) 끝점에서 동물에서. 이러한 조직 및 후속 도금의 균질화는 침략적인 박테리아와 대응 된 titres의 존재를 나타낼 수 있습니다.

세균 배양 밀도 정량화의 예는 도 3에도시된다. 배양이 너무 집중되면 식민지가 너무 조밀하게 자라서 개별적으로 계산되지만, 로그-와이즈 희석 계열이 도금되면 단일 세포에서 파생된 콜로니를 구별할 수 있다. 희석당 세 가지 기술 복제를 도금하여 가변성을 최소화합니다. 비강 식민지 화 이벤트에서 회수된 박테리아를 정량화할 때, 뮤린 비소하린으로부터 동시에 분리된 다른 세균종을 나타내는 공동 배양 된 오염 물질이 발생할 수 있습니다. 세균성 균주가 알려진 항생제 내성을 가지고 있는 경우(예를 들어, S. 폐렴의 많은 변종은 젠타마이신 또는 네오마이신에 최대 5 μg/ml까지 내성이 있음), 적절한 농도로 항생제로 성장 매체를 보충하여 오염물질의 발생률을 최소화할 수 있어 오염물질 성장을 제한한다.

유동 세포측정은 비강 용암 샘플에서 세포 표면 마커를 분석하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 감염의 맥락에서 모집된 세포 유형의 분석을 위해, 대식세포(F4/80+), 호중구(CD11b+ 및Ly6G+),및 T세포(CD3+ 및 CD4+ 또는CD8+)를포함한 백혈구의 총 분화에 특이적인 항체의 혼합이 이전에 발표된 바와 같이 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 분석은 감염의 과정에서 면역 세포 인신 매매를 더 잘 이해하기 위해, 다른 조직 이나 혈액에 실시 하는 흐름 세포 분석과 결합될 수 있다. 비소항에서 분리 될 수있는 세포의 제한 수 (일반적으로 낮은 수천에 번호) 때문에, 희귀 한 하위 세트를 식별하는 것은 일반적으로 도전이다, 이 작업을 수행하고자하는 연구원은 원하는 세포 수를 달성하기 위해 여러 마우스에서 샘플을 풀링 고려해야하지만. 또한, 이 지역에서 유한 수의 세포를 추출할 수 있으므로 총 세포 수와 관련하여 이 데이터를 분석하는 것이 좋습니다.

단백질 발현 수준은 전형적으로 비소하린에서 단백질 생산을 분석할 가능성을 제한하지만, RNA 수준에서 식민지화 균에 반응하여 숙주 분자의 생산을 분석할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 비강 용암은 유전자 발현의 분석을 허용하는 PBS 대신 RNA 용해 완충제를 사용하여 수행될 수 있다. qPCR 증폭 검출의 경우, 정확하고 원하는 제품이 검출되었는지 확인하기 위해 해당 해리곡선(도 11)을실행하는 것이 중요하다. 이것은 분석이 미분 조광기, DNA 오염 및 MISannealed 프라이머에서 PCR 제품을 포함하여 어떤 이중 좌초 DNA든지를 검출할 것이라는 사실 때문입니다.

여기에서 설명한 방법은 이 연구되지 않은 지역의 맥락에서 중요한 병원체에 대한 호스트 응답을 연구하기 위해 비강 내 식민지 모델을 적용하는 것이 좋습니다. S. 폐렴과같은 특정 인체 병원체의 경우, 선행 비인두 식민지화 사건은 폐렴으로 이어질 수 있는 폐로전파를 포함하여 다음에 발생할 수 있는 세균성 보급 및 치명적인 후유증에 대한 중요한 전구체역할을 하며, 이는 폐렴으로 이어질 수 있으며, 그 결과 세균성 쇼크와 그 결과 세균성 충격이 발생한다. 따라서, 이 지역에 있는 세균성 식민지를 공부함으로써, 우리는 그것을 통제하고 전부 일어나는 에서 더 심각한 병리를 방지하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 연쇄상 구균 폐렴의임상 긴장의 그의 선물에 대한 펜실베니아 대학의 박사 제프리 와이저에게 감사드립니다. 이 연구는 건강 연구를 위한 캐나다 학회에 의해 투자되었습니다. 이력서는 M. G. DeGroote 펠로우십과 캐나다 흉부 학회의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 온타리오 폐 협회와 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에 의해 투자되었다. 보우디시 실험실에서 일하는 것은 감염증 연구를 위한 마이클 G. DeGroote 센터 및 맥매스터 면역학 연구 센터에 의해 부분적으로 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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<em>연쇄상 구균 폐렴으로</em> 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화
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