Summary
Vi satte os for at bestemme acceptable koncentrationer af tre fedtsyrer (oliesyre, linolsyre og linolensyre), og kolera toksin, der ikke væsentligt negativ indflydelse celleoverlevelse ved at opløse fedtsyrerne og toksin og bruge dem i celle overlevelse assays.
Abstract
Den positive rolle fedtsyrer i forebyggelse og lindring af ikke-humane og menneskelige sygdomme har været og fortsat være grundigt dokumenteret. Disse roller indflydelse på smitsomme og ikke-smitsomme sygdomme, herunder forebyggelse af inflammation samt slimhindeimmunitet til infektionssygdomme. Kolera er en akut tarm sygdom forårsaget af bakterien Vibrio cholerae. Det sker i udviklingslande, og hvis venstre ubehandlet, kan resultere i dødsfald. Mens vacciner til kolera findes, er ikke altid effektive og andre præventive metoder er nødvendige. Vi satte sig for at bestemme acceptable koncentrationer af tre fedtsyrer (olein, linol og linolensyre) og koleratoksin anvendelse af muse BALB / C makrofager og humane tarm epitelceller, hhv. Vi solubiliseret ovennævnte fedtsyrer og brugte celleproliferationsassays at bestemme koncentrationsområderne og specifikke koncentrationer af fedtsyrerne, der ikket skadelige for menneskers intestinal epitelcelle levedygtighed. Vi opløst choleratoksin og brugte det i en analyse at bestemme koncentrationsintervaller og specifikke koncentrationer af kolera toksin, der ikke statistisk nedsætte cellernes levedygtighed i BALB / C makrofager.
Vi fandt de optimale fedtsyrer koncentration skal være mellem 1-5 ng / ul, og at der for koleratoksin at være <30 ng per behandling. Disse data kan hjælpe fremtidige undersøgelser, der har til formål at finde en beskyttende slimhinde rolle fedtsyrer i forebyggelse eller lindring af kolera infektioner.
Introduction
De sundhedsmæssige fordele af fedtsyrer, såsom oliesyre, linolsyre og linolensyre har været og fortsætter med at blive dokumenteret. For eksempel hjælper oliesyre lette penetration af lipofile lægemidler i kroppen 1,2, reducerer hjertekarsygdom med 24%, når stedet for mættede fedtsyrer 3, og anvendes til behandling af metaboliske sygdomme såsom adrenoleukodystrophy 4, som er en X-forbundet genetisk lidelse af fedtsyre stofskiftet. . Mens en nødvendig forløber for arachidonsyre i pattedyr, linolsyre (i modsætning oliesyre) ikke syntetiseres af kroppen og skal indhentes gennem eksterne kilder såsom ved hørfrø forbrug 5 Undersøgelser viser flere gavnlige sundhedsmæssige virkninger af linolsyre, såsom: anti-aging egenskaber til huden; 6 anti-inflammatoriske egenskaber, 7 reduceret spredning af kolorektal-og prostatakræft carcinomceller, 8 og evnen til at bekæmpe fedme og fremme of hjerte-kar-sundhed. 9. linolensyre spiller en rolle i at reducere parodontal inflammation, 10 og modulerende tromboxan og prostacyclin biosyntese. 11.
Arpita 12 undersøgte indflydelsen af galde fedtsyrer og kolesterol på V. cholerae 's ekspression af virulensfaktorer og motilitet. Yamasaki 13 viste, at methanolekstrakt fra rød chili peber og andre naturligt udvundne forbindelser, potentielt kan nedsætte koleratoxin produktion. Det er tænkeligt at overveje brugen af fødevarer, der er rige i ovenstående fedtsyrer (såsom hør frø) i forebyggelse og lindring af smittefarlige sygdomme såsom kolera gennem levere slimhindeimmunitet. Vi har udført undersøgelser til at opløse fedtsyrer og bestemme, ved hjælp celleproliferationsassays den maksimale koncentration af fedtsyrer, humane tarmepitelceller kan tolerere uden skadelige virkninger på cell levedygtighed. Vi antager, at oliesyre, linolsyre og linolensyre giver en gavnlig virkning på cellelevedygtighed ved lavere koncentrationer, men at ved højere koncentrationer vil de være toksisk for cellerne. Vi har også solubiliseret koleratoksinet og bestemmes den maksimale koncentration af kolera toksin, BALB / C mus makrofager kan tåle uden et signifikant fald i cellelevedygtighed. Vi hypotesen en toksisk virkning af kolera-toksin på cellelevedygtighed, selv ved meget lavt niveau. Metoden til at opløse en kolera-toksin og bruger det til at bestemme den maksimale toksin, at cellerne kan tåle uden et signifikant fald i overlevelsesevne giver en fordel for fremtidige undersøgelser. For eksempel kan en kombination af de ovennævnte metoder anvendes til at bestemme, om fedtsyrer giver celler med slimhindeimmunitet mod kolera infektioner. Til de bedste af vores viden, er denne rationelle og metode ikke er blevet udforsket.
Vi discuss hvordan vores foreløbige data kan bruges i senere undersøgelser at afgøre, om oliesyre, linolsyre og linolensyre giver celler med slimhindeimmunitet mod kolera infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Tissue Culture
- Brug Mus musculus makrofager (BALB / c-mus) for koleratoksin bestemmelser. Oprindeligt kultur hele M. musculus celler efter sælgers anvisninger.
- Propagate BALB / c mus celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium med L-glutamin afsluttet med 10% kalvefosterserum og 1% antibiotika / antimykotika eller RPMI 1640 basismediet suppleret med 10% føtalt bovint serum, 5% L-glutamin og 1 % antibiotikum / antimykotikum reagens.
- Grow celler i 75 cm2 Corning kolber med ventilerede hætter ved 37 ° C, 95% luft og 5% CO2.
- Bring up humane tarmepitelceller inden 24 timer for levering ifølge producentens anvisninger for bestemmelse af fedtsyrer bestemmelser.
- Udbrede de menneskelige tarm epiteler celler i 75 cm 2 Corning kolber med ventilerede hætter i HybriCare medier afsluttede med 10% FBS og 30 ng / ml human EGF ved 37 ° C. Brug ikke antibiotika/ Antimycotiske reagenser som pr fabrikantens anvisninger.
- Split alle celler (1:3) ved ca 70% konfluens.
- Frys og opdrage alle celler i hele undersøgelsen ved hjælp af standard frysning protokoller.
- Bemærk: For større skala koncentrationsbestemmelse af fedtsyrer, jo hurtigere voksende, nemmere at vedligeholde, musemakrofager oprindeligt bruge. For fine skala fedtsyre koncentration beslutsomhed, bruge menneskefostre epitelceller. Brug musen makrofager for alle koleratoksin behandlinger (se diskussionen).
2.. Fedtsyre og koleratoksin Behandlinger
- Overfør oliesyre, linolsyre og linolensyre fra firma-forudsat glasampuller til steriliserede hætteglas.
- Overfør hver fedtsyre til en separat steriliseret Eppendorf-rør og opløse det først i 100% ethanol ved en fortynding på 1:06, og derefter i RPMI 1640 ufuldstændige medier til en slutkoncentration på 10 ug / ul.
- Vortex hver løsning og transfis det til hætteglas til opbevaring i fryseren (-20 ° C).
- Plate celler ved 2.500 celler / brønd i 96-brønds vævskulturplader.
- Tilføj passende komplette medier til at bringe det totale brøndvolumen til 200 pi til behandling af celler med fedtsyrer i forberedelse til MTT assays.
- Efter en 24 timers spredning periode, fjernes mediet og erstatte det med friske medier.
- Tilsæt de passende koncentrationer af hver fedtsyre, der skal testes til brøndene (se resultater). Tilføj komplette medier til at bringe de samlede såvel mængder til 200 pi.
- Inkuber de behandlede plader til 24 timer, før du begynder MTT assay.
- Opløs kolera toksin i PBS ved en koncentration på 1 mg / ml og alikvot opløsningen i kryoglas og gemme kryohætteglas ved 2-8 ° C.
- For celle behandlinger, fortyndes toksin 1:100 i enten steriliseret PBS (pH 7,4) eller ufuldstændig DMEM til en endelig bearbejdning koncentration på 1 ng / ul.
- At behandle celler med koleratoksin iforberedelse til MTT assays, varmeplader celler som beskrevet ovenfor.
- Efter en 24 timers spredning periode, tilsæt passende koncentrationer af kolera toksin (for vores koncentration, se resultater), der skal testes til brøndene efter de procedurer, der anvendes i fedtsyrer applikationer (ovenfor).
- Inkuber de behandlede plader til 24 timer, før du begynder MTT assay.
- Som en positiv (positiv c hele papir) og en negativ kontrol (negativ c), for både fedtsyren og koleratoksin behandlinger, inkuberes celler med komplet medium og 70% ethanol, henholdsvis.
- For alle prøver og behandlinger brug mindst tre gentagelser (n = 3), med flere gentagelser for positive kontroller (n = 6 i denne undersøgelse).
3.. MTT Assay
- Foretag en MTT stamopløsning til en koncentration på 2,5 mg / ml.
- Fjern opløsning i hver brønd af 96-brønds plade, der skal testes, og erstatte det med 200 pi frisk komplet medier løsning.
- Add 10 ul af MTT-opløsning til hver brønd.
- Inkubér pladen ved 37 ° C i 3-4 timer.
- Kassér medierne og der tilsættes 100 ul 0,04 M HCI i isopropanol til hver brønd.
- Inkubér pladen ved stuetemperatur i fem minutter.
- Opløsningen overføres fra hver brønd til en ny centrifugerør.
- Centrifugeres ved 20.000 xg ved stuetemperatur, i 1 min, eller indtil en pellet blev dannet.
- Overførsel mellem 20-40 ul af hver prøve til en mikropladelæser.
- Læs absorbans ved 570 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemmelse af optimale koncentration af fedtsyrer
Den optimale koncentration for fedtsyrer er defineret som den maksimale koncentration, ved hvilken cellevækst er sammenlignelig med eller overstiger værdien af kontrolceller, med relativt lav variation i resultaterne. At bestemme den optimale koncentration af oliesyre blev linolsyre og linolensyre celler indledningsvis behandles med varierende koncentrationer af hver fedtsyre i store intervaller og senere med små intervaller. Figur 1 viser overlevelsen af celler afbildet som en funktion af den positive kontrol for behandlinger ved hjælp stigende koncentrationer af fedtsyrerne. Det er klart, at cellerne ikke kan tåle koncentrationer over 100 ng / gl for nogen af de fedtsyrer. Et ANOVA viste, at for hver af behandlingerne, en eller flere af de midler er forskellige fra de andre (p <0,001). En post-hoc test (Tukey s) viste, at oliesyre alle behandlinger undtagenden 1 ng / pi var forskellig fra den positive kontrol. Interessant, på grund af høj variabilitet, denne behandling var marginalt ikke signifikant forskellig fra den negative kontrol enten. For både linolsyre og linolensyre, viste én vejs ANOVA at mindst én middelværdi er anderledes end de andre (p <0,001). En Tukey post-hoc test afslørede, at middelværdien af 10 ng / ul behandling til enten fedtsyre ikke er signifikant forskellig fra den positive kontrol, men er fra den negative kontrol (p <0,05).
Dette eksperiment blev gentaget for koncentrationer, der var lavere end 100 ng / gl, i 10 ng / ul gangen (op til 70 ng / ul, under anvendelse af humane epitelceller). Celleoverlevelse er tilvejebragt for hver koncentration i fig. 2. For oliesyre (figur 2a), ANOVA én måde viste, at en eller flere af de midler var forskellige (p <0,001). Men det er kun de behandlinger ved højere koncentrationer (40 og 50ng / ul), der gengives betyder statistisk forskellig fra den positive kontrol. Interessant, De konstaterede forskelle skyldtes en stigning i cellelevedygtighed (med mere variation, figur 2a). En måde ANOVA gav lignende resultater for linolsyre og linolensyre. Specifikt ingen af behandlingen midler var forskellig fra gennemsnittet af den positive kontrol. Igen, variabilitet synes at øge for nogle af de højere koncentrationer (figur 2b og 2c).
Bestemmelse af den optimale koncentration af koleratoksin
Den optimale koncentration for kolera toksin defineres som den koncentration, ved hvilken cellelevedygtigheden ikke påvirkes eller bare begynder at falde i forhold til ubehandlede celler. At vurdere den minimale koncentration af kolera toksin, minimalt nedsætter cellelevedygtigheden blev celler først behandlet med varierende koncentrationer af kolera toksin i store increments og senere med mindre trin 3a viser en faldende rentabilitet trend for celleoverlevelse som et resultat af koleratoksin behandlinger for toksinindholdet ved relativt store stigninger (mellem 100-1.000 ng, R2, = 0,5436).. Som forventet, cellelevedygtighed varierede meget for hver behandling (figur 3a). Den store observerede variabilitet i levedygtighed resulterede ikke i nogen betydning Forskellen mellem middelværdien af vores positive kontrol med nogen af behandlingerne (én-vejs ANOVA). Baseret på disse resultater, bestemmes vi at toksinindholdet <100 ng bør testes yderligere. 3b viser cellelevedygtighed for de mindre toksin niveau behandlinger. Cellelevedygtighed er meget variabel for næsten alle toksin koncentrationer, omend små stigninger i levedygtighed som følge af behandlingerne. Disse stigninger (figur 3b) er ikke statistisk signifikante for nogen af behandlingerne i forhold til gennemsnittet af den positive kontrol (en ANOVA, Tukey s).
Figur 1. Bestemmelse af brugbare koncentrationer af fedtsyrer:. Effekt af varierende koncentrationer af fedtsyrer i relativt store stigninger (100-1.000 ng / ul) for oliesyre, linolsyre og linolensyre Klik her for at se større figur .
Figur 2. Fin skala fedtsyre koncentration bestemmelse: Effekter af varierende koncentrationer af fedtsyrer i små intervaller (10 ng / ul) på menneskers tarm epitelcelleoverlevelse. tarmepitelceller blev behandlet med varierende koncentrationer af oliesyre (a), linolsyre (b), og linolensyre (c). Den positive kontrol er celler behandlet med komplette medier kun, og den negative kontrol med 70% ethanol. For hvert forsøg, n = 3 for alle behandlinger undtagen positiv kontrol (n = 6). Klik her for at se større figur .
Figur 3. Bestemmelse af anvendelige koleratoksin koncentrationer baseret på vurdering af anvendelse af varierende koncentrationer af kolera-toksin på mus makrofag overlevelse: Mouse makrofager blev behandlet med varierende koncentrationer af kolera toksin i større trin (a)så mindre (B). Den positive kontrol er celler behandlet med komplette medier kun, og den negative kontrol med 70% ethanol. For hvert forsøg, n = 3 for alle behandlinger undtagen positiv kontrol (n = 6). Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Eksperimentelle design-bestemmelse af passende fedtsyre og toksin koncentrationer til anvendelse i fremtidige undersøgelser: Cellelysater kan bruges til at behandle makrofager og cytokin dynamik kan kvalitativt og kvantitativt analyseret ved immunoblotting og ELISA under anvendelse af antistoffer mod specifikke cytokiner som markører for infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antydning af koncentration af fedtsyrer og koleratoxin
Mens den nøjagtige mekanisme for, hvordan fedtsyrer forbedre slimhindeimmunitet er ukendt, har flere undersøgelser forsøgt at undersøge deres gavnlige virkninger. Vores undersøgelse har til formål at give metode til at bestemme den maksimale koncentration af fedtsyrer, at celler kan tåle såvel som den maksimale koncentration af kolera toksin, at celler kan tolerere uden en betydelig indflydelse på celle overlevelse.
At bestemme koncentrationen af tre fedtsyrer (oliesyre, linolsyre og linolensyre), såvel som af kolera toksin til behandling af celler uden meget betydelig negativ virkning på cellelevedygtighed vi solubiliseret fedtsyrerne og koleratoksin og behandlede væv dyrkede celler til forskellige koncentrationer efterfulgt af en MTT-assay til at vurdere levedygtigheden. Baseret på vores metoder og resultater, vi leverer serier af fedtsyrer og kolera toksin nyttigtfor fremtidige undersøgelser har til formål at anvende disse fedtsyrer eller koleratoksin (se nedenfor). Vi anbefaler koncentrationer på 1, 5-10 og 5-10 (ng / ul) til oliesyre, linolsyre og linolensyre, henholdsvis for anvendelse af humane tarmepitelceller. Vi anbefaler også brugen af <30 ng (per 200 ul, metoder se) af kolera toksin hjælp BALB / C musemakrofager. Vi anerkender, at i det mindste for koleratoksin, var der ingen signifikant forskel observeres mellem cellelevedygtighed for den positive kontrol i forhold til de behandlinger. Men vores anbefaling er baseret på den relativt høje variabilitet i celle levedygtighed, der blev observeret som følge af højere toksin niveau engagementer.
Fremtidige studier
De data, i dette studie for fedtsyrer og kolera toksin niveauer kan bruges i fremtidige studier. Vi giver et eksempel på en sådan undersøgelse her.
Kolera er en sygdom forbundet med developing lande, der ikke har ordentlig kloakering og vandbehandlingsanlæg og sikkert drikkevand. I 2009 blev en dødstal på over 3.000 rapporteret for en periode på fem måneder på grund af kolera relaterede symptomer i Zimbabwe alene. 14. Fra 2011, kolera stadig en epidemi i forskellige regioner i verden, herunder et udbrud i Haiti (CDC, 2010) . En molekylær genetik undersøgelse i 2010 viste, bevis for, at bakterien i dette udbrud var nepalesisk oprindelse. 15. Sygdommen er forårsaget af indtagelse af fækal-forurenet mad eller drikkevand og kolonisering af tarmen ved V. cholerae, efterfulgt af frigivelsen af et enterotoksin. Mens kolera vaccinationer eksisterer, er de ikke altid er effektive i forebyggelsen af infektion under udbrud. Effektive og billige interventioner er nødvendige for befolkningsgrupper, hvor kolera udbrud. En fremgangsmåde er at undersøge, om fødekilder, der er rige i derivater såsom oliesyre, linolsyre og linolensyretilvejebringe eller forbedre mucosal immunitet mod kolera infektion. Slimhindeimmunitet funktioner gennem anvendelse af proteiner, receptorer findes på overfladen af celler, såsom Toll-lignende receptorer 16 (TLRs) og nukleotid-bindende domæner (NLRs). Gennem ændringer i membranens sammensætning og frigivelsen af ligander, der interagerer med TLRs og NLRs kan tilsætning af fedtsyrer til tarmepitelet øge receptor funktion i at anerkende farlige mikrober og rekruttere de relevante immunrespons. At bestemme fedtsyrer effekter på kolerainfektion cytokin dynamik, såsom cellens frigivelse af TNF-α, IL-6, skal IL-10 og IL-12, undersøges mere i humane tarmepitelceller end i muse makrofager (figur 4). En sådan viden fra fremtidige undersøgelser vil hjælpe os til bedre at forstå den mekanisme, hvormed fedtsyrer kan arbejde for at forebygge infektion, med henblik på i sidste ende give effektive indgreb til at hæmme cholera udbrud. Det er muligt, at behandling af celler med fedtsyrer før kolera toksin infektion vil hjælpe fremkalde og / eller forøge mucosal immunrespons i tarmepitelet, i sidste ende øge cellernes levedygtighed under mikrobiel kolerainfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne af denne undersøgelse ikke har nogen økonomisk interesse ud fra resultaterne af denne undersøgelse. Finansieringen af denne undersøgelse blev givet til FT Kean University, men FT er i øjeblikket ansat på Kingsborough Community College.
Acknowledgments
Vi takker Paula Cobos og Dr. Evros Vassiliou for lab bistand og levere de musemakrofager hhv. Vi takker også vores laboratorium chef Richard Criasia for vejledning og hjælp med materialer. Endelig forfatterne takker Ramanpreet Kaur hjælp til videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
- Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery. Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).
- Tandon, P., et al. X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate. Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).
- Kris-Etherton, P. M. The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health. Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).
- Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels. Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).
- Bozan, B., Temelli, F. Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil. Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).
- Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology. J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30 (2009).
- Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).
- Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).
- Granda, M., Sinclair, A. J. Fatty acids and obesity. Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).
- Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).
- Ferretti, A., Flanagan, V. Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).
- Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera. Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).
- Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).
- WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/ (2010).
- Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2 (4), 1-6 (2011).
- Schaeffler, A., Gross, P., et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity. Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).
