Fastställande av tolerabla fettsyror och kolera Koncentrationer Toxin Använda Human tarmepitelceller och BALB / c Macrophages Mouse

Summary

Vi bestämde oss för att bestämma acceptabla koncentrationer av tre fettsyror (oljesyra, linolsyra och linolensyra) och kolera toxin som inte signifikant och negativt påverkar cellens överlevnad genom att lösa de fettsyror och toxinet och använda dem i analyser cell överlevnad.

Abstract

Den positiva roll fettsyror vid förebyggande och lindring av icke-mänskliga och mänskliga sjukdomar har varit och fortsätter att vara väldokumenterade. Dessa roller inkluderar påverkan på smittsamma och icke-smittsamma sjukdomar inklusive förebyggande av inflammation samt slemhinneimmunitet till infektionssjukdomar. Kolera är en akut intestinal sjukdom som orsakas av bakterien Vibrio cholerae. Den förekommer i utvecklingsländer och om den lämnas obehandlad kan leda till döden. Medan vaccin för kolera existerar, de är inte alltid effektiva och andra förebyggande metoder behövs. Vi bestämde oss för att bestämma acceptabla koncentrationer av tre fettsyror (oljesyra, linolsyra och linolensyra) och kolera toxin med hjälp av mus BALB / C makrofager och humana tarmepitelceller, respektive. Vi solubiliserade ovanstående fettsyror och används cellanalyser spridning för att fastställa koncentrationsskillnaderna intervall och specifika koncentrationer av de fettsyror som är ingent skadliga för människors intestinala epitelceller livskraft. Vi löses kolera toxin och använt det i en analys för att fastställa koncentrationsintervallen och specifika koncentrationer av kolera toxin som inte statistiskt minskar cellviabiliteten i BALB / C makrofager.

Vi fann de optimala fettsyrekoncentrationer att vara mellan 1-5 ng / ul, och den för koleratoxin att vara <30 ng per behandling. Dessa data kan hjälpa framtida studier som syftar till att hitta en skyddande slemhinna roll för fettsyror i förebyggande eller lindring av kolera-infektioner.

Introduction

De positiva hälsoeffekterna av fettsyror, såsom oljesyra, linolsyra och linolensyra har varit och fortsätter att dokumenteras. Till exempel hjälper oljesyra underlätta penetrering av lipofila läkemedel i kroppen ^1,2, minskar kranskärlssjukdom med 24% när den är substituerad för mättade fettsyror ^3, och används för att behandla metabola sjukdomar såsom adrenoleukodystrophy ⁴ vilken är en X-länkade genetisk störning i fettsyra metabolismen. . Medan en nödvändig förelöpare för arakidonsyra i däggdjur, linolsyra (till skillnad oljesyra) inte syntetiseras av kroppen och måste erhållas genom externa källor såsom av linfrön konsumtion ⁵ Studier visar flera positiva hälsoeffekter av linolsyra, såsom: anti-åldrande egenskaper för huden; ⁶ anti-inflammatoriska egenskaper, ⁷ minskad spridning av kolorektal-och prostatacancer celler, ⁸ och förmågan att bekämpa fetma och främjande of kardiovaskulär hälsa. ⁹ Linolensyra spelar en roll för att minska parodontal inflammation, ¹⁰ och modulerande tromboxan och prostacyklin biosyntes. ¹¹

Arpita ¹² studerat påverkan av galla fettsyror och kolesterol på V. cholerae 's uttryck av virulensfaktorer och motilitet. Yamasaki ¹³ visade att metanol extrakt från röd chilipeppar, och andra naturligt extraherade föreningar, potentiellt kan minska kolera toxin produktion. Det är tänkbart att överväga användningen av livsmedel som är rika på dessa fettsyror (t.ex. linfrön) i förebyggande och lindring av infektiösa sjukdomar såsom kolera genom att ge slemhinneimmunitet. Vi genomförde undersökningar för att lösa fettsyror och att bestämma, med hjälp cellproliferationsanalyser, den högsta koncentrationen av fettsyror som mänskliga tarmepitelceller kan tolerera utan skadliga effekter på cell livskraft. Vi antog att oljesyra, linolsyra och linolensyra ger en gynnsam effekt på cellviabilitet vid lägre koncentrationer, men att vid högre koncentrationer de kommer att vara toxiska för cellerna. Vi solubiliserade också koleratoxinet och bestäms den maximala koncentrationen av koleratoxin att BALB / C-musmakrofager kan tolerera utan en signifikant minskning i cellviabilitet. Vår hypotes är en toxisk effekt av kolera toxin på cellviabilitet även vid mycket låg nivå. Metoden att solubilisera en kolera toxin och använda den för att bestämma den maximala mängden av toxin som cellerna tål utan en signifikant minskning av överlevnadsförmåga ger en fördel för framtida studier. Till exempel kan en kombination av ovanstående metoder kan användas för att avgöra om fettsyror ger celler med slemhinneimmunitet mot kolera infektioner. Så vitt vi känner till har denna rationella och metodik inte undersökts.

Vi discuss hur våra preliminära data kan användas i senare undersökningar för att avgöra om oljesyra, linolsyra och linolensyra ger celler med slemhinneimmunitet mot kolera infektion.

Protocol

Ett. Tissue Culture

1. Använd Mus musculus makrofager (BALB / c-möss) för koleratoxin bestämningar. Initialt kultur hela M. musculus celler efter leverantörens anvisningar.
2. Propagera BALB / c-möss celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium med L-glutamin kompletterat med 10% fetalt bovint serum, och 1% antibiotika / antimykotisk eller RPMI 1640 basmedium kompletterat med 10% fetalt bovinserum, 5% L-glutamin, och 1 % antibiotika / antimykotika reagens.
3. Odla celler i 75 cm ² corning kolvar med ventilerade lock vid 37 ° C, 95% luft och 5% _CO2.
4. Ta upp mänskliga tarmepitelceller inom 24 tim leverans enligt tillverkarens anvisningar för bestämning av fettsyror bestämningar.
5. Propagera de humana intestinala epitel-celler i 75 cm ² corning kolvar med ventilerade lock i HybriCare medier avslutade med 10% FBS och 30 ng / ml humant EGF vid 37 ° C. Använd inte antibiotika/ Antimykotika reagens enligt tillverkarens anvisningar.
6. Split alla celler (01:03) till cirka 70% sammanflöde.
7. Frysa och ta upp alla celler genom hela studien med vanliga frysning protokoll.
8. Obs: För större skala koncentrationsbestämning av fettsyror, använder de snabbare växande, lättare att underhålla, makrofager mus initialt. För fina skala fettsyra koncentrationsbestämning, använda mänskliga epitelceller. Använd musen makrofager för alla koleratoxin behandlingar (se diskussion).

2. Fatty Acid och kolera Behandlingar Toxin

1. Överför oljesyra, linolsyra och linolensyra från företaget som glasampuller till steriliserade glasflaskor.
2. Överför varje fettsyra till en separat steriliserad Eppendorf-rör och lösa upp det först i 100% etanol vid en utspädning av 1:06, och sedan i RPMI 1640 ofullständiga media för en slutlig koncentration av 10 ug / ul.
3. Vortex varje lösning och transfer det till glasflaskor för förvaring i frysen (-20 ° C).
4. Tavla celler vid 2500 celler / brunn i 96 brunnars vävnadsodlingsplattor.
5. Lägg lämpliga komplett medium för att bringa den totala väl volymen till 200 | il för behandling av celler med fettsyror i förberedelse för MTT-analyser.
6. Efter en 24 hr spridning period, ta bort materialet och ersätta det med färskt medium.
7. Lägg lämpliga koncentrationer av varje fettsyra som ska testas till brunnarna (se resultat). Lägg komplett media för att den totala brunnsvolymer till 200 pl.
8. Inkubera behandlade plattorna för 24 tim innan den MTT-analysen.
9. Upplös den koleratoxin i PBS vid en koncentration av 1 mg / ml och alikvot lösningen i kryokärl och lagra cryovials vid 2-8 ° C.
10. För cell-behandlingar, späd toxinet 1:100 i antingen steriliserad PBS (pH 7,4) eller ofullständiga DMEM under en slutlig arbetskoncentration av 1 ng / ul.
11. Att behandla celler med koleratoxin iförberedelse för MTT-analyser, celler plattan enligt beskrivningen ovan.
12. Efter en 24 hr spridning period, lägga till lämpliga koncentrationer av kolera toxin (för våra koncentrationer, se resultat) som ska testas till brunnarna efter de metoder som används i fettsyra-applikationer (ovan).
13. Inkubera behandlade plattorna för 24 tim innan den MTT-analysen.
14. Som en positiv (positiva c hela papper) och negativ kontroll (negativ c), för både fettsyra och kolera behandlingar toxin, inkubera celler med komplett medium och 70% etanol resp.
15. För alla prover och behandlingar använder minst tre replikat (n = 3), med mer replikationer för positiva kontroller (n = 6 i denna studie).

Tre. MTT-analys

1. Gör en MTT stamlösning till en koncentration av 2,5 mg / ml.
2. Avlägsna lösningen i varje brunn på 96 brunnar som ska testas och ersätta det med 200 pl färsk kompletta medielösningar.
3. Add 10 | il av MTT-lösning till varje brunn.
4. Inkubera plattan vid 37 ° C under 3-4 timmar.
5. Kassera media lösning och tillsätt 100 pl av 0,04 M HCl i isopropanol till varje brunn.
6. Inkubera plattan vid rumstemperatur under fem minuter.
7. Överför lösningen från varje brunn till ett nytt centrifugrör.
8. Centrifugera vid 20.000 x g, vid rumstemperatur, under 1 min, eller tills en pellet bildades.
9. Förskjutning mellan 20-40 pl av varje prov till en mikroplattläsare.
10. Läs absorbansen vid 570 nm med en spektrofotometer.

Representative Results

Bestämning av den optimala koncentrationen av fettsyror

Den optimala koncentrationen för fettsyror definieras som den maximala koncentration vid vilken celltillväxten är jämförbar med eller överstiger den för kontrollceller, med relativt låg variabilitet i resultat. För att bestämma den optimala koncentrationen av oljesyra, var linolsyra och linolensyra cellerna initialt behandlade med varierande koncentrationer av varje fettsyra i stora inkrement och senare med mindre steg. Figur 1 visar överlevnaden av celler som avbildas som en funktion av den positiva kontrollen för behandlingar med ökande koncentrationer av fettsyrorna. Det är uppenbart att cellerna inte tolerera koncentrationer av över 100 ng / l för någon av fettsyrorna. En envägs-ANOVA visade att för var och en av behandlingarna, en eller flera av de sätt skiljer sig från de andra (p <0,001). En post-hoc test (Tukey s) visade att för oljesyra alla behandlingar utomden 1 ng / ul skilde sig från den positiva kontrollen. Intressant, på grund av hög variabilitet var denna behandling marginellt inte signifikant från den negativa kontrollen heller. För både linolsyra och linolensyra, visade en envägs ANOVA att åtminstone ett medelvärde är annorlunda än de andra (p <0,001). En Tukeys post-hoc-test avslöjade att medelvärdet av 10 ng / | il behandling för antingen fettsyra är inte signifikant från den positiva kontrollen, men är från den negativa kontrollen (p <0,05).

Detta experiment upprepades för koncentrationer som var lägre än 100 ng / pl, i 10 ng / | il steg (upp till 70 ng / ul, med användning av humana epitelceller). Cellöverlevnad är anordnad för varje koncentration i figur 2. För oljesyra (figur 2a), en envägs ANOVA visade att ett eller flera av medlen var olika (p <0,001). Det är emellertid endast de bearbetningsmetoder vid högre koncentrationer (40 och 50ng / ul) som återges betyder statistiskt skild från den hos den positiva kontrollen. Intressant nog var de observerade skillnaderna beroende på en ökning i cell viabilitet (med större variabilitet, figur 2a). Ett sätt ANOVA gav liknande resultat för linolsyra och linolensyra. Specifikt var ingen av behandlingen medel skiljer sig från medelvärdet för den positiva kontrollen. Återigen verkar variabilitet att öka för vissa av de högre koncentrationer (fig. 2b och 2c).

Bestämning av den optimala koncentrationen av koleratoxin

Den optimala koncentrationen för koleratoxin definieras som den koncentration vid vilken cellviabilitet inte påverkas eller bara börjar minska jämfört med obehandlade celler. För att bedöma den minimala koncentrationen av koleratoxin som minimalt minskar cellviabiliteten fick cellerna behandlades initialt med varierande koncentrationer av koleratoxin i stora increments och senare med mindre steg Figur 3a visar en minskande lönsamhet trend för cellernas överlevnad som en följd av kolera toxin behandlingar för toxinhalten vid relativt stora ökningar (mellan 100-1000 ng, R ^2, = 0,5436).. Som väntat cellviabilitet varierade kraftigt för varje behandling (figur 3a). Den stora iakttagna variabiliteten av lönsamheten resulterade inte i någon betydelse skillnaden mellan det medelvärde av vår positiv kontroll med någon av behandlingarna (en-vägs ANOVA). Utifrån dessa resultat har vi bestämt att toxinnivåer <100 ng bör testas ytterligare. Figur 3b visar cellviabilitet för de mindre behandlingar toxin nivå. Cellviabilitet är mycket varierande för nästan alla toxin koncentrationer, om än små ökningar observerades i lönsamheten som en följd av behandlingarna. Dessa ökar (figur 3b) är inte statistiskt signifikanta för någon av behandlingarna jämfört med medelvärdet av den positiva kontrollen (en envägs ANOVA, Tukey s).

Figur 1. Fastställande av användbara koncentrationer av fettsyror:. Effekten av varierande koncentrationer av fettsyror i relativt stora steg (100-1000 ng / l) för oljesyra, linolsyra och linolensyra Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Finskalig fettsyra koncentrationsbestämning: Effekter av varierande koncentrationer av fettsyror i mindre steg (10 ng / | il) på människors intestinal epithelialcellöverlevnad. intestinala epiteliala celler behandlades med varierande koncentrationer av oljesyra (a), linolsyra (B) och linolensyra (C). Den positiva kontrollen är celler som behandlats med komplett media bara, och den negativa kontrollen med 70% etanol. För varje försök, n = 3 för alla behandlingar utom positiv kontroll (n = 6). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Fastställande av användbara koleratoxin koncentrationer baserade på utvärdering av tillämpningen av varierande koncentrationer av kolera toxin på mus makrofag överlevnad: musmakrofager behandlades med varierande koncentrationer av kolera toxin i större steg (a)då mindre (b). Den positiva kontrollen är celler som behandlats med komplett media bara, och den negativa kontrollen med 70% etanol. För varje försök, n = 3 för alla behandlingar utom positiv kontroll (n = 6). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Experimentell design-bestämning av lämpliga fettsyra och koncentrationer toxin för användning i framtida studier: Cellysater kan användas för att behandla makrofager och dynamik cytokin kan kvalitativt och kvantitativt analyseras genom immunoblotting och ELISA med antikroppar mot specifika cytokiner såsom markörer för infektion.

Discussion

Förslag på koncentration av fettsyror och koleratoxin

Även om den exakta mekanismen för hur fettsyror ökar slemhinneimmunitet är okänd, har flera studier försökt att undersöka de positiva effekterna. Vår studie syftar till att ge metoder för att bestämma den maximala koncentrationen av fettsyror som cellerna tål såväl som den högsta koncentration av kolera toxin som celler kan tolerera utan ett betydande inflytande på cellens överlevnad.

För att bestämma koncentrationen av tre fettsyror (olje-, linol-och linolensyra) samt den för koleratoxin för behandling av celler utan att mycket betydande negativ effekt på cellviabiliteten vi solubiliserade fettsyrorna och koleratoxin och behandlade vävnaden odlade celler till olika koncentrationer följt av en MTT-analys för att bedöma lönsamheten. Baserat på vår metodik och resultat vi tillhandahåller sortiment av fettsyror och kolera toxin användbarför framtida undersökningar som syftar till att använda dessa fettsyror eller koleratoxin (se nedan). Vi rekommenderar koncentrationer av 1, 5-10, och 5-10 (ng / l) för oljesyra, linolsyra och linolensyra, respektive, för användning av humana tarmepitelceller. Vi rekommenderar användning av <30 ng (per 200 ^, se metoder) av kolera toxin med BALB / C musmakrofager. Vi inser att, åtminstone för koleratoxin, sågs ingen signifikant skillnad observerades mellan cellviabilitet för den positiva kontrollen jämfört med behandlingarna. Dock är vår rekommendation baseras på relativt hög variabilitet i cell livsduglighet som sågs som ett resultat av högre exponeringar toxin nivå.

Framtidsstudier

De uppgifter som lämnats i denna studie för fettsyror och kolera nivåer toxin kan användas i framtida studier. Vi ger ett exempel på en sådan undersökning här.

Kolera är en sjukdom associerad med developing länder som inte har ordentlig avlopps-och reningsverk och säkert dricksvatten. Under 2009 gjordes en dödssiffran på över 3.000 rapporteras för fem månader på grund av kolera symtom i Zimbabwe ensam. ¹⁴ Som av 2011, är kolera en epidemi i olika delar av världen, inklusive ett utbrott i Haiti (CDC, 2010) . En molekylär genetik studie under 2010 visade tecken på att bakterien i detta utbrott var på nepalesiska ursprung. ¹⁵ Sjukdomen orsakas av intag av fekal-förorenad mat eller dricksvatten och kolonisering av tarmen av V. cholerae, följt av utsättning av en enterotoxin. Medan kolera vaccinationer existerar, de är inte alltid effektiva i att förhindra infektion under utbrott. Effektiva och billiga insatser behövs för populationer där kolerautbrott inträffar. Ett sätt är att studera om mat källor som är rika på derivat såsom oljesyra, linolsyra och linolensyratillhandahålla eller förbättra mukosal immunitet mot kolera infektion. Slemhinneimmunitet funktioner genom användning av protein receptorer som finns på ytan av celler, såsom Toll-like receptors ¹⁶ (TLRs) och nukleotid-domäner (NLRs). Genom förändringar i membranet sammansättning och frisläppandet av ligander som interagerar med TLRs och NLRs, kan tillägg av fettsyror till tarmepitelet öka receptor funktion i att upptäcka farliga mikrober och rekrytera lämpliga immunsvar. För att bestämma fettsyror effekter på kolera infektion, dynamik cytokin, såsom cellens frisättningen av TNF-α, IL-6, måste IL-10 och IL-12, studeras mer så i humana tarmepitelceller än i musmakrofager (Figur 4). Sådan kunskap från framtida studier kommer att hjälpa oss att bättre förstå den mekanism genom vilken fettsyror kan arbeta för att förhindra infektion, för att i slutändan ge effektiva insatser för att hämma cholerett utbrott. Det är möjligt att behandling av celler med fettsyror före koleratoxin infektion kommer att hjälpa inducera och / eller förstärka den mukosala immunsvar i intestinalt epitelium, i slutändan ökar cellviabiliteten under mikrobiell kolera infektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101