Summary
우리는 크게 악영향 지방산과 독소를 가용화 및 세포 생존 분석에서 그들을 사용하여 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다 개의 지방산 (올레산 리놀레산과 리놀렌산)과 콜레라 독소의 허용 농도를 결정하기 위해 밖으로 설정합니다.
Abstract
예방 및 비 - 인간과 인간의 질병의 완화 지방산의 긍정적 인 역할을하고 광범위하게 문서화되는 것을 계속했다. 이러한 역할은 염증의 예방뿐만 아니라 전염성 질병에 점막 면역 등의 전염성 및 비 전염성 질환에 영향을 이용하실 수 있습니다. 콜레라 박테리아 비브리오 콜레라에 의한 급성 장 질환이다. 그것은 개발 도상국에서 발생하고 방치하면 사망을 초래할 수 있습니다. 콜레라 백신은 존재하지만, 그들은 항상 효과적이지 다른 예방 방법이 필요합니다. 우리는 각각 마우스 BALB / C 대식 세포와 인간의 창자 상피 세포를 사용하여 허용 세 가지 지방산의 농도 (올레산, 리놀레산과 리놀렌산)과 콜레라 독소를 결정하기 위해 밖으로 설정합니다. 우리는 농도 범위와 NO 지방산의 특정 농도를 결정하기 위 지방산과 사용 세포 증식 분석을 용해인간의 장 상피 세포의 생존에 해로운 t. 우리는 콜레라 독소를 용해와 농도 범위와 통계적으로 BALB / C 대식 세포의 세포 생존 능력을 감소하지 않는 콜레라 독소의 특정 농도를 결정하기 위해 분석에 사용됩니다.
우리는 최적의 지방산 농도 사이에 1-5 μL / NG, 그 처리 기준 <30 ng를 할 수 콜레라 독소합니다.이 발견 이 데이터는 예방이나 콜레라 감염의 완화 지방산에 대한 보호 점막 역할을 발견하는 것을 목표로 미래의 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
같은 올레산, 리놀레산과 리놀렌산 등의 지방산의 건강 혜택은되고 문서화되는 것을 계속했다. 예를 들어, 올레인산은 몸 1,2 지용성 약물의 침투를 용이하게하는 데 도움이 포화 지방산 3를 대체 할 때 24 %가 관상 동맥 심장 질환을 감소시키고, X-연결되어 같은 Adrenoleukodystrophy 4와 같은 신진 대사 질환을 치료하는 데 사용됩니다 지방산 대사의 유전 질환. . 포유류의 아라키돈 산, 리놀산 (올레인산과는 달리)에 대한 필요한 전구체가 신체에 의해 합성되지 않는 등 아마씨 소비와 같은 외부 소스를 통해 얻을 수 있어야하지만 5 연구에서는 다음과 같은 리놀레산 여러 유익한 건강 효과를 보여 피부를위한 안티 에이징 속성, 6 항 염증, 대장 암과 전립선 암 세포의 7 감소 확산, 8 및 비만을 싸우는 능력 증진 오F 심장 혈관 건강. 9 리놀렌산 치주 염증, 10, 변조 트롬 복산과 프로 스타 사이클린의 생합성을 감소하는 역할을한다. 11
Arpita 12 V.에 담즙 지방산의 영향과 콜레스테롤을 공부 독성 요인과 운동의 콜레라의 식입니다. 야마자키 13 빨강 칠리 페 퍼, 기타 자연적으로 추출 된 화합물의 메탄올 추출물이 잠재적 인 콜레라 독소의 생산을 줄일 수 있다고 지적했다. 그것은 점막 면역을 제공을 통해 콜레라와 같은 전염성 질병의 예방과 퇴치를 위의 지방산 (예 : 아마 씨앗 등)이 풍부한 식품의 사용을 고려하는 것이 생각할 수있다. 우리는 세포 증식 분석, 인간 장 상피 세포가 세륨에 해로운 영향없이 견딜 수있는 지방산의 최대 농도를 사용하여 지방산을 용해하고 결정하기 위해 조사를 실시LL 생존. 우리는 올레산, 리놀레산과 리놀렌산은 낮은 농도에서 세포 생존에 유익한 효과를 제공하는 가설을하지만, 높은 농도에서 그들은 세포에 독성이 될 것입니다. 우리는 또한 콜레라 독소를 용해하고 BALB / C 마우스 대 식세포는 세포 생존에 큰 감소없이 견딜 수있는 콜레라 독소의 최대 농도를 결정 하였다. 우리는 심지어 매우 낮은 수준에서 세포 생존에 콜레라 독소의 독성 효과를 가설. 콜레라 독소를 가용화 및 세포 생존에 큰 감소없이 견딜 수있는 독소의 최대 크기를 결정하기 위해 그것을 사용하는 방법은 미래 연구에 대한 이점을 제공합니다. 예를 들어, 위의 방법의 조합은 지방산 콜레라 감염에 대한 점막 면역과 세포를 제공하는지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 아는 한,이 합리적이고 방법론은 탐구되지 않았습니다.
우리는 디우리의 예비 데이터는 올레산, 리놀레산과 리놀렌산은 콜레라 감염에 대한 점막 면역과 세포를 제공하는지 확인하기 위해 나중에 조사에서 사용할 수있는 방법을 scuss.
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Protocol
1. 조직 문화
- 콜레라 독소 결정에 대한 뮤스 musculus 대 식세포 (BALB / C 마우스)를 사용합니다. 처음에는 문화 M.의 공급 업체의 지침에 따라 musculus 세포.
- 10 % 태아 소 혈청 완료 L-글루타민과 Dulbecco의 수정 이글의 중간에 BALB / C 마우스 세포를 전파하고, 1 % 항진균 / 항생제 또는 RPMI 1640 기본 매체는 10 % 태아 소 혈청, 5 %의 L-글루타민, 1로 완료 % 항진균 / 항생제 시약.
- 37 환기 캡 75cm 2 코닝 플라스크에 세포를 성장 ° C, 95 % 공기와 5 % CO 2.
- 지방산 결정의 결정을위한 기준, 제조업체의 지침으로 배달 24 시간 이내에 인체 장 상피 세포를 가져온다.
- 37 10 % FBS 및 30 NG / ML 인간의 EGF와 함께 완료 HybriCare 미디어에서 배출 캡 ° C.와 75cm 2 코닝 플라스크에 인간의 장내 상피 세포를 전파 항생제를 사용하지 마십시오제조 업체의 지침에 따라 / 항진균 시약.
- 자랄 때 약 70 %로 모든 셀 (1:3) 분할합니다.
- 동결 표준 냉동 프로토콜을 사용하여 연구를 통하여 모든 셀을 가져옵니다.
- 참고 : 지방산의 큰 규모의 농도 측정의 경우, 초기에 빠른 성장, 유지하게 쉬운 마우스 대 식세포를 사용합니다. 미세 규모의 지방산 농도 측정을 위해, 인간의 상피 세포를 사용합니다. 모든 콜레라 독소 치료 (설명 참조) 마우스 대 식세포를 사용합니다.
2. 지방산과 콜레라 독소 치료
- 에서, 올레산 리놀레산과 리놀렌산을 전송 회사에서 제공하는 멸균 유리 병에 유리 앰플.
- 별도의 멸균 에펜 도르프 튜브에 각각의 지방산을 전송 및 1:6 희석에 100 % 에탄올에 먼저 녹여 다음 10 ㎍ / μL의 최종 농도에 대한 RPMI 1640 완전 미디어합니다.
- 와동 각 솔루션 및 TRANSF어 그것을 냉장고에 보관 유리 병 (-20 ° C)합니다.
- 2,500 세포에서 / 잘 96 잘 조직 배양 플레이트에 플레이트 세포.
- MTT 분석을위한 준비 지방산 세포 치료에 200 μL에 총 잘 볼륨을 가지고 적절한 전체 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 24 시간 증식 기간이 지난 후에 용지를 제거하고 새로운 용지로 교체합니다.
- (참조 결과) 우물 테스트 할 각 지방산의 적절한 농도를 추가합니다. 200 μL에 총 잘 볼륨을 가지고 전체 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- MTT 분석을 시작하기 전에 24 시간 동안 처리 한 번호판을 품어.
- cryovials 1 MG / ML 및 나누어지는 솔루션의 농도로 PBS에서 콜레라 독소를 녹이고 2-8 cryovials를 저장 ° C.
- 세포 치료의 경우, 1 NG / μL의 최종 작업 농도도 멸균 PBS (산도 7.4) 또는 불완전한 DMEM에 독소 1:100 희석.
- 콜레라 독소와 세포를 치료하려면위에서 설명한대로 MTT 분석, 플레이트 세포를위한 준비.
- 24 시간 증식 기간이 지나면 지방산 응용 프로그램 (위)에 사용되는 절차에 따라 우물을 테스트 할 콜레라 독소의 적절한 농도를 (우리의 농도에 대한 참조 결과)를 추가합니다.
- MTT 분석을 시작하기 전에 24 시간 동안 처리 한 번호판을 품어.
- 양 (양의 용지에 걸쳐 C)와 지방산 및 콜레라 독소 트리트먼트 서비스, 완전 배지 및 70 % 에탄올로 세포를 품어 각각 모두 대조군 (음수 C)와 같은.
- 모든 샘플 및 치료는 양성 대조군에 대한 더 많은 복제 (본 연구에서는 N = 6)와 세 개의 복제 (N = 3)의 최소 사용하십시오.
3. MTT 분석 실험
- 2.5 MG / ML의 농도에 MTT 원액을 만든다.
- 테스트 할 96 잘 플레이트의 각 웰에 용액을 제거하고 신선한 완벽한 미디어 솔루션을 200 μL로 교체합니다.
- 광고각각의 well에 MTT 용액 D 10 μL.
- 37 ° C 3 ~ 4 시간 동안 접시를 품어.
- 미디어 솔루션을 폐기하고 각 well에 이소프로판올 0.04 M의 HCl 100 μL를 추가합니다.
- 5 분 동안 실온에서 접시를 품어.
- 각 우물에서 새로운 원심 분리 관에 대한 해결책을 전송합니다.
- 1 분 또는 펠릿이 형성 될 때까지 상온에서 20,000 XG에 원심 분리기.
- 마이크로 플레이트 리더를 각 샘플의 20-40 μL간에 데이터를 전송합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
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Representative Results
지방산의 최적 농도의 결정
지방산의 최적 농도는 세포의 성장에 필적하거나 결과 상대적으로 낮은 변동성 제어 세포의를 초과하는 최대 농도로 정의됩니다. 올레의 최적 농도를 결정하기 위해, 리놀레산과 리놀렌산 세포가 처음 큰 단위로 각 지방산의 농도를 변화하고 나중에 작은 단위로 처리 하였다. 그림 1은 세포의 생존을 사용하여 치료에 대한 긍정적 인 제어 기능으로 묘사 보여줍니다 지방산의 농도 증가. 그것은 세포가 지방산의 100 NG / μL 이상 농도를 용납하지 않는 것이 분명하다. 한 가지 방법은 ANOVA는 치료의 각각을위한 수단의 하나 이상의 다른 (p <0.001)에서 다른 것으로 나타났다. 사후 검사 (Tukey의)는 보여 주었다 제외 올레산 모든 처리를위한1 NG / μL는 긍정적 인 컨트롤에서 달랐다. 흥미롭게도, 높은 변동성으로 인해,이 치료는 소폭 음성 대조군에서 유의 한 차이가 있었다. 리놀레산과 리놀렌산 모두 산을위한 하나의 방법으로 ANOVA는 적어도 하나의 의미가 다른 (p <0.001)보다는 다른 것을 보여 주었다. Tukey의 사후 테스트는 지방산의 10 μL / NG 치료의 평균이 양성 대조군에서 유의 한 차이가 있습니다 만, 대조군 (p <0.05)에 있다고 밝혔다.
이 실험은보다 낮았다 농도 반복 된 100 μL / NG, 10 μL / NG 증가 (인간 상피 세포를 사용하여 최대 70 NG / μL)합니다. 세포의 생존은 그림 2의 각 농도에 대해 제공됩니다. 올레산 (그림 2A)를위한 한 가지 방법은 ANOVA는 수단 중 하나 이상이 (p <0.001), 다른 것으로 나타났다. 그러나 높은 농도에서만 처리합니다 (40 및 50렌더링이) μL / NG는 양성 대조군의 통계적 다른 것을 의미한다. 흥미롭게 관찰 된 차이가 세포 생존 능력의 증가 (더 많은 다양성, 그림 2a와 함께)로 인해했다. 한 가지 방법은 ANOVA는 리놀레산과 리놀렌산에 대해 비슷한 결과를 굴복. 특히, 치료 방법의 아무도는 양성 대조군의 평균과 다를 없었다. 다시 한번, 변동성 높은 농도 (그림 2B 및 2C)의 일부 증가 할 것으로 보인다.
콜레라 독소의 최적 농도의 결정
콜레라 독소에 대한 최적 농도는 세포 생존에 영향을하거나 치료 세포에 비해 감소하기 시작하지되는 농도로 정의됩니다. 최소한의 세포 생존율을 감소 콜레라 독소의 최소 농도를 평가하기 위해, 세포는 처음에 큰 incremen에서 콜레라 독소의 농도 변화로 치료했다TS 나중에 더 작은 단위로 그림 3A는 비교적 큰 단위 (NG, R 2 100-1,000 사이; = 0.5436)에서 독소 수준 콜레라 독소 치료의 결과로 세포의 생존을위한 감소 생존 추세를 보여줍니다.. 예상대로, 세포 생존 능력은 각각의 치료 (그림 3A)에 대해 크게 변화. 생존에 큰 관측 변동성 치료의 (단방향 ANOVA)과의 양성 대조군의 평균 사이에 유의 한 차이가있었습니다. 이러한 결과를 바탕으로, 우리는 결정하는 독소 수준 <100 NG가 더 테스트해야합니다. 그림 3b는 작은 독소 수준의 치료를위한 세포 생존 능력을 보여줍니다. 세포 생존율은 약간의 증가가 치료의 결과로 생존에서 관찰되었다 불구하고, 거의 모든 독소 농도가 매우 변수입니다. 이러한 증가 (그림 3B)은 양성 대조군의 평균에 비해 치료의 통계적으로 유의하지 않은 (편도 ANOVA, Tukey의).
그림 1. 지방산의 가능한 농도 측정 :. 올레산, 리놀레산과 리놀렌산을위한 비교적 큰 단위 (μL / 100-1,000 NG)에서 지방산의 농도를 변화의 효과는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 미세 규모의 지방산 농도 결정 : 인간의 장 상피에서 작은 단위 (μL / 10 NG)에서 지방산의 농도 변화에 미치는 영향세포의 생존. 장 상피 세포는 올레의 다양한 농도 (), 리놀레산 (B)과 리놀렌산 (C)로 처리 하였다. 긍정적 인 컨트롤은 전체 미디어 및 70 % 에탄올 대조군으로 치료 세포이다. 각 시험의 경우, N = 3 양성 대조군 (n = 6)을 제외한 모든 처리를위한. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 마우스 대식 세포의 생존에 콜레라 독소의 농도를 변화의 응용 프로그램의 평가에 따라 사용할 콜레라 독소 농도의 결정 : 마우스 대식 세포는 더 큰 단위로 콜레라 독소의 농도 변화로 치료했다 ()그 작은 것 (B). 양성 컨트롤은 전체 미디어 및 70 % 에탄올 대조군으로 치료 세포입니다. 각 시험의 경우, N = 3 양성 대조군 (n = 6)을 제외한 모든 처리를위한. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 적절한 지방산과 미래 연구에 사용되는 독소 농도의 실험 설계 결정 : 세포 용 해물은 질적 및 양적 immunoblotting을하고 ELISA 감염을위한 마커와 같은 특정 사이토 카인에 대한 항체를 사용하여 assayed 수 있습니다 대식 세포 및 사이토 카인 역학을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
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Discussion
지방산의 농도와 콜레라 독소의 제안
지방산 점막 면역을 강화하는 방법의 정확한 메커니즘은 알 수 있지만, 몇몇 연구들은 유익한 효과를 조사하기 위해 시도했습니다. 우리의 연구는 세포가 세포가 세포의 생존에 큰 영향없이 견딜 수있는뿐만 아니라 콜레라 독소의 최대 농도가 견딜 수있는 지방산의 최대 농도를 결정하는 방법을 제공하는 것을 목표로하고있다.
세 개의 지방산 (올레산 리놀레산과 리놀렌산)의 농도뿐만 아니라 세포 생존에 매우 중요한 부작용없이 세포 치료 콜레라 독소의 우리가 다른에 지방산과 콜레라 독소 및 치료 조직 배양 세포를 용해를 확인하려면 농도는 가능성을 평가하기 위해 MTT 분석에 의해 따랐다. 우리의 방법론과 결과를 바탕으로 우리는 지방산의 범위와 유용한 콜레라 독소를 제공합니다이러한 지방산이나 콜레라 독소 (아래 참조)를 사용하는 것을 목표로 미래를 조사합니다. 우리는 인간의 창자 상피 세포를 사용하기위한 각각 올레인산, 리놀레산과 리놀렌산을위한 (μL / NG) 5-10, 5-10 1 농도를 권장합니다. 우리는 또한 BALB / C 마우스 대 식세포를 사용하여 콜레라 독소의 <30 NG의 사용 (200 μL 당 방법을 참조)를 추천합니다. 우리는 콜레라 독소에 대한 최소한 유의 한 차이가 치료에 비해 양성 대조군에 대한 세포 생존 능력 사이에 관찰되지 않았다, 인식. 그러나 우리의 권고가 높은 독소 수준의 노출의 결과로 관찰되었다 세포 생존 능력의 상대적으로 높은 변동성을 기반으로합니다.
미래 연구
지방산과 콜레라 독소 수준이 연구에서 제공된 데이터는 미래 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기서 하나의 연구의 예를 제공합니다.
콜레라 dev에와 관련된 질병입니다적절한 하수 처리장 및 안전한 식수가없는 국가 도피. 2009 년, 3000 이상의 사망자 짐바브웨 혼자 콜레라 관련 증상으로 인해 5 개월 기간 동안보고되었다. 14 일 현재, 콜레라는 아이티에서 발생 (CDC, 2010) 등 세계의 다른 지역에서 전염병 남아있다 . 2010 년에 분자 유전학 연구는이 발발에있는 박테리아가 네팔 출신이었다 증거를 보여 주었다. 15 질병 V.에 의해 소장의 배설물에 오염 된 음식이나 식수와 식민지의 섭취에 의해 발생합니다 enterotoxin의 릴리스에서 다음의 cholerae. 콜레라 예방 접종이 존재하지만, 그들은 항상 발생하는 동안 감염을 예방하는 효과가 없습니다. 효과적이고 저렴한 개입 콜레라 발병이 발생 인구 필요합니다. 한 가지 방법은 공부 여부 등 올레산, 리놀레산과 리놀렌산 등의 파생 풍부한 음식 소스콜레라 감염에 대한 점막 면역을 제공하거나 향상시킬 수 있습니다. 이러한 수신자 같은 수용체 16 (TLR은)와 염기 결합 도메인 (NLRs)와 같은 세포의 표면에서 발견 단백질 수용체의 사용을 통해 점막 면역 기능을합니다. 막 조성과 TLR들과 NLRs와 상호 작용하는 리간드의 릴리스의 변화를 통해, 장 상피 세포에 지방산뿐만 아니라 유해 미생물을 인식하고 적절한 면역 반응을 모집에있는 수용체 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 TNF-α의 세포의 릴리스, IL-6 등의 지방 콜레라 감염에 산 효과, 사이토 카인 역학을 결정, IL-10, IL-12, (그림 마우스 대 식세포에서보다 인간의 장 상피 세포에서 더 그렇게 공부를해야합니다 4). 미래의 연구에서 이러한 지식은 우리가 더 나은 지방산은 궁극적 choler을 억제하는 효과적인 중재를 제공하기 위해, 감염을 방지하기 위해 작동 할 수있는 메커니즘을 이해하는 데 도움이됩니다발생. 그것은 콜레라 독소 감염 이전에 지방산 세포의 치료 유도 및 / 또는 궁극적으로 미생물 콜레라 감염시 세포 생존을 증가, 장 상피 점막 면역 반응을 향상시키는 데 도움 않을 수 있습니다.
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Disclosures
이 연구의 저자는 본 연구의 결과로부터 재정 관심이 없다. 본 연구를위한 기금은 킨 대학 FT에 제공되었지만, FT는 현재 Kingsborough 커뮤니티 칼리지에서 직원입니다.
Acknowledgments
우리는 폴라 Cobos 및 실험실 지원 박사 브로스 Vassiliou을 감사하고 각각 마우스 대 식세포을 제공한다. 우리는 또한 지침 연구실 매니저 리처드 Criasia을 감사하고 재료를 도와줍니다. 마지막으로, 저자는 비디오 제작에 도움을 Ramanpreet의 우르 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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