Summary
Partimos para determinar as concentrações toleráveis de três ácidos graxos (ácidos oléico, linoléico e linolênico) e toxina da cólera que não significativamente e adversamente afetar a sobrevivência da célula por solubilização dos ácidos graxos e da toxina e usá-los em ensaios de sobrevivência celular.
Abstract
O papel positivo dos ácidos graxos na prevenção e combate de doenças não-humanos e humanos têm sido e continuam a ser amplamente documentado. Essas funções incluem influências sobre doenças infecciosas e não infecciosas, incluindo a prevenção da inflamação, bem como a imunidade da mucosa para doenças infecciosas. A cólera é uma doença intestinal aguda causada pela bactéria Vibrio cholerae. Ela ocorre em países em desenvolvimento e se não tratada, pode resultar em morte. Embora existam vacinas para a cólera, eles nem sempre são eficazes e são necessários outros métodos preventivos. Partimos para determinar as concentrações toleráveis de três ácidos graxos (ácidos oléico, linoléico e linolênico) e toxina da cólera usando o mouse BALB / C macrófagos e células epiteliais intestinais humanas, respectivamente. Nós solubilizado os ácidos gordos superiores e os ensaios de proliferação de células utilizadas para determinar as gamas de concentração e concentrações específicas dos ácidos gordos que não estãot prejudiciais para a viabilidade da célula epitelial intestinal humana. Nós solubilizado a toxina da cólera e utilizado num ensaio para determinar as gamas de concentração e concentrações específicas de que a toxina da cólera não é estatisticamente diminuir a viabilidade celular em ratinhos BALB / C macrófagos.
Encontrámos as concentrações óptimas de ácidos gordos para estar entre 1-5 ng / mL, e que, para a toxina da cólera de ser <30 ng por tratamento. Estes dados podem ajudar estudos futuros que visem encontrar um papel mucosa protetora para os ácidos graxos na prevenção ou alívio de infecções de cólera.
Introduction
Os benefícios de saúde de ácidos graxos, como o oléico, linoléico e linolênico têm sido e continuam a ser documentado. Por exemplo, o ácido oleico ajuda a facilitar a penetração dos fármacos lipofílicos no 1,2 corpo, a doença cardíaca coronária reduz em 24% quando substituídos por ácidos gordos saturados 3, e é utilizada para o tratamento de doenças metabólicas como a adrenoleucodistrofia 4 que é um X-ligados distúrbio genético do metabolismo dos ácidos gordos. . Enquanto um precursor necessário para o ácido araquidónico em mamíferos, o ácido linoleico (ao contrário do ácido oleico) não é sintetizada pelo corpo e devem ser obtidos através de fontes externas, tais como o consumo de semente de linho 5 Estudos mostram vários efeitos benéficos à saúde de ácido linoleico, tais como: propriedades anti-envelhecimento para a pele; seis propriedades anti-inflamatórias; 7 reduziu a proliferação de células de carcinoma colorretal e próstata; 8 ea capacidade para combater a obesidade e promoção o9. linolênico f saúde cardiovascular desempenha um papel na redução da inflamação periodontal, tromboxano 10 e modulando a biossíntese da prostaciclina e 11.
Arpita 12 estudaram a influência dos ácidos graxos biliares e colesterol em V. expressão de fatores de virulência e motilidade cholerae 's. Yamasaki 13 indicaram que o extrato de metanol a partir de pimentas vermelhas, e outros compostos extraídos naturalmente, pode, potencialmente, diminuir a produção de toxina da cólera. É concebível a considerar a utilização de produtos alimentares que são ricos em ácidos gordos superiores (tais como sementes de linho) na prevenção e alívio de doenças infecciosas tais como a cólera através do fornecimento de imunidade da mucosa. Foi realizado investigações para solubilizar os ácidos gordos e para determinar, usando testes de proliferação de células, a concentração máxima de ácidos gordos que as células epiteliais intestinais humanas pode tolerar sem efeitos prejudiciais sobre a ceviabilidade ll. Colocámos a hipótese de que os ácidos oleico, linoleico e linolénico, proporcionar um efeito benéfico sobre a viabilidade das células em concentrações mais baixas, mas que, em concentrações mais elevadas que são tóxicos para as células. Também solubilizado a toxina da cólera e determinada a concentração máxima de toxina da cólera que BALB / C de rato macrófagos pode tolerar sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Nossa hipótese é um efeito tóxico da toxina da cólera na viabilidade celular, mesmo em nível muito baixo. O método de solubilização de uma toxina da cólera e utilizá-la para determinar a quantidade máxima da toxina que as células podem tolerar sem uma diminuição significativa na capacidade de sobrevivência proporciona uma vantagem para estudos futuros. Por exemplo, uma combinação das metodologias acima podem ser utilizadas para determinar se os ácidos gordos de fornecer células com a imunidade da mucosa contra a infecção de cólera. Para o melhor de nosso conhecimento, esta metodologia racional e não foi explorado.
Nós discuss como os nossos dados preliminares podem ser utilizados em investigações posteriores para determinar se o oleico, linoleico e linolénico fornecer células com a imunidade da mucosa contra a infecção de cólera.
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Protocol
1. Cultura de Tecidos
- Use Mus musculus macrófagos (BALB / c) para as determinações da toxina da cólera. Inicialmente cultura todos M. células musculus seguindo as instruções do fornecedor.
- Propaga BALB / c células ratos em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco com L-glutamina completado com 10% de soro fetal bovino, e antibióticos / antimicóticos ou meio RPMI 1640 de base de 1% completado com 10% de soro fetal bovino, 5% de L-glutamina, e 1 % de reagente de antibiótico / antimicótico.
- Cultivar células em 75 cm 2 frascos corning com tampas com respiradouros, a 37 ° C, 95% de ar e 5% de CO 2.
- Levar-se as células epiteliais intestinais humanas no prazo de 24 horas da entrega, conforme instrues do fabricante para a determinação das determinações de ácidos gordos.
- Propagação de células epiteliais intestinais humanas em 75 cm 2 frascos corning com tampas ventiladas em meios HybriCare completados com 10% de FBS e 30 ng / ml de EGF humano a 37 ° C. Não use antibióticosReagentes / antimicóticos conforme instruções do fabricante.
- Dividir todas as células (1:3) a cerca de 70% de confluência.
- Congelar e trazer todas as células ao longo do estudo por meio de protocolos de congelamento padrão.
- Nota: Para a determinação da concentração de escala maior de ácidos gordos, a utilização de crescimento mais rápido e mais fácil de manter, inicialmente, os macrófagos do rato. Para a determinação da concentração de ácido graxo fina escala, usar células epiteliais humanas. Use macrófagos de camundongos para todos os tratamentos toxina da cólera (ver discussão).
2. Ácidos graxos e tratamentos toxina da cólera
- Transferência de ácidos oléico, linoléico e linolênico de empresa, desde ampolas de vidro para frascos de vidro esterilizados.
- Transferência de cada ácido gordo para um tubo Eppendorf esterilizado em separado e dissolvê-lo em primeiro lugar em etanol a 100% a uma diluição de 1:06, e, em seguida, em meio RPMI 1640 incompletos para uma concentração final de 10 ug / ul.
- Vortex cada solução e transfer-o para frascos de vidro para armazenamento no congelador (-20 ° C).
- As células em placas a 2500 células / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido.
- Adicionar os meios completos adequados para levar o volume total a 200 bem ul para o tratamento de células com ácidos gordos na preparação para os ensaios MTT.
- Depois de um período de proliferação 24 horas, remova a mídia e substituí-lo com novas mídias.
- Adicionar as concentrações apropriadas de cada ácido gordo a ser testado para os poços (ver resultados). Adicionar meio completo para assim trazer os volumes totais de 200 ul.
- Incubar as placas tratadas por 24 horas antes de se iniciar o ensaio de MTT.
- Dissolve-se a toxina de cólera em PBS a uma concentração de 1 mg / ml e alíquotas da solução em criotubos e armazenar os criotubos a 2-8 ° C.
- Para os tratamentos de células, dilui-se a toxina de 1:100 em PBS esterilizado (pH 7,4) ou DMEM incompleto para uma concentração de trabalho final de 1 ng / ul.
- Para o tratamento de células com a toxina da cólera nopreparação para ensaios de MTT, as células da placa, tal como descrito acima.
- Depois de um período de proliferação de 24 h, adicionar as concentrações apropriadas de toxina da cólera (por nossos concentrações, ver resultados) a serem ensaiadas às cavidades seguindo os procedimentos utilizados em aplicações de ácidos gordos (de cima).
- Incubar as placas tratadas por 24 horas antes de se iniciar o ensaio de MTT.
- Como (c positivo ao longo do papel) positivo e de controlo negativo (negativo c), para ambos os tratamentos ácido gordo e a toxina da cólera, as células a incubar com meio completo e etanol a 70%, respectivamente.
- Para todas as amostras e tratamentos utilizar um mínimo de três repetições (n = 3), com mais repetições de controlos positivos (n = 6 neste estudo).
3. MTT Assay
- Adicione uma solução de MTT a uma concentração de 2,5 mg / ml.
- Remover a solução em cada poço da placa de 96 poços a serem testados e substituí-la com 200 ml de solução de meio completo fresco.
- Anúnciod 10 uL da solução de MTT a cada poço.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 3-4 horas.
- Descartar a solução meios e adicionar 100 ul de 0,04 M de HCl em isopropanol a cada poço.
- Incubar a placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.
- Transferir a solução de cada poço para um novo tubo de centrífuga.
- Centrifugar a 20.000 x g, à temperatura ambiente, durante 1 min, ou até que um precipitado foi formado.
- Transferência entre 20-40 mL de cada amostra de um leitor de microplacas.
- Ler a absorvância a 570 nm utilizando um espectrofotómetro.
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Representative Results
Determinação da concentração ótima de Ácidos Graxos
A concentração óptima de ácidos gordos é definida como a concentração máxima em que o crescimento celular é comparável ou superior à das células de controlo, com relativamente baixa variabilidade nos resultados. Para determinar a concentração óptima de oleico, células de ácidos linoleico e linolénico, foram inicialmente tratadas com várias concentrações de cada ácido gordo em grandes incrementos e depois com pequenos incrementos. Figura 1 mostra a sobrevivência de células descrito como uma função do controlo positivo para os tratamentos que utilizam concentrações crescentes dos ácidos gordos. É evidente que as células não toleram concentrações acima de 100 ng / mL para qualquer um dos ácidos gordos. Uma ANOVA one-way mostraram que, para cada um dos tratamentos, um ou mais dos meios são diferentes das outras (p <0,001). Um teste post-hoc (Tukey) mostrou que o ácido oleico para todos os tratamentos exceptoa 1 ng / mL eram diferentes das do controlo positivo. Curiosamente, devido à elevada variabilidade, este tratamento foi marginalmente não significativamente diferente do controlo negativo ou. Para ambos os ácidos linoléico e linolênico, one way ANOVA mostrou que pelo menos uma média é diferente do que os outros (p <0,001). Teste post-hoc de Tukey revelaram que a média do tratamento de 10 ng / mL tanto para o ácido gordo não é significativamente diferente do controlo positivo, mas estão no controlo negativo (p <0,05).
Esta experiência foi repetida para as concentrações que eram inferiores a 100 ng / mL, em incrementos de 10 ng / mL (cerca de 70 ng / mL, utilizando células epiteliais humanas). A sobrevivência celular é fornecida para cada uma das concentrações na Figura 2. Para o ácido oleico (Figura 2a), ANOVA one-way mostrou que um ou mais dos meios foram diferentes (p <0,001). No entanto, é apenas os tratamentos com concentrações mais elevadas (40 e 50ng / mL), que rendeu significa estatisticamente diferente do que a do controlo positivo. Curiosamente, as diferenças observadas eram devidas a um aumento na viabilidade das células (com uma maior variabilidade, Figura 2a). Uma maneira ANOVA produziram resultados semelhantes para os ácidos linoléico e linolênico. Especificamente, nenhum dos meios de tratamento eram diferente da média do controlo positivo. Mais uma vez, a variabilidade parece aumentar para algumas das concentrações mais elevadas (Figuras 2b e 2c).
A determinação da concentração óptima da toxina da cólera
A concentração óptima para a toxina da cólera é definido como a concentração para a qual a viabilidade celular não é afectada ou apenas começa a diminuir em comparação com células não tratadas. Para avaliar a concentração mínima de toxina da cólera que minimamente diminui a viabilidade das células, as células foram tratadas inicialmente com concentrações variáveis de toxina da cólera em grandes incrementalts e depois com pequenos incrementos Figura 3a mostra uma tendência para a diminuição da viabilidade a sobrevivência celular, como resultado de tratamentos de toxina da cólera de toxina em níveis relativamente grandes incrementos (entre 100-1.000 ng, R2, = 0,5436).. Como esperado, a viabilidade das células variou grandemente para cada tratamento (Figura 3A). A grande variabilidade observada na viabilidade não resultou em diferença significativa entre a média do nosso controle positivo com qualquer um dos tratamentos (one-way ANOVA). Com base nestes resultados, determinou-se que os níveis de toxina <100 ng deve ser testado ainda mais. Figura 3b mostra a viabilidade celular para os tratamentos com menores níveis de toxina. A viabilidade das células é altamente variável para quase todas as concentrações de toxina, embora ligeiros aumentos foram observados para a viabilidade, como resultado dos tratamentos. Estes aumentos (Figura 3B) não são estatisticamente significativa para qualquer um dos tratamentos em comparação com a média do controlo positivo (one way ANOVA, Tukey).
Figura 1. Determinação da concentração de ácidos graxos utilizáveis:. Efeito de diferentes concentrações de ácidos graxos em relativamente grandes incrementos (100-1.000 ng / mL) de ácido oleico, ácido linoleico e linolênico Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Belas escala determinação da concentração de ácido graxo: Efeitos de diferentes concentrações de ácidos graxos em intervalos menores (10 ng / mL) no epitélio intestinal humanasobrevivência celular. células epiteliais intestinais foram tratados com concentrações variáveis de ácido oleico (um), ácido linoléico (b) e ácido linolénico (c). O controle positivo é células tratadas apenas com meio completo, eo controle negativo com etanol 70%. Para cada ensaio, n = 3 para todos os tratamentos, exceto o controle positivo (n = 6). Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 3. Determinação da concentração de toxina da cólera utilizáveis com base na avaliação da aplicação de várias concentrações de toxina da cólera no rato macrófagos sobrevivência: macrófagos do rato foram tratadas com várias concentrações de toxina da cólera em incrementos maiores (um)em seguida, os menores (b). O controle positivo é células tratadas apenas com meio completo, eo controle negativo com etanol 70%. Para cada ensaio, n = 3 para todos os tratamentos, exceto o controle positivo (n = 6). Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 4. Experimental cartão-determinação de ácido gordo e as concentrações de toxina apropriado para utilização em estudos futuros: os lisados celulares podem ser usados para tratar os macrófagos e dinâmicas de citocinas pode ser ensaiada quantitativamente e qualitativamente por immunoblotting e ELISA usando anticorpos específicos contra citocinas como marcadores para infecção.
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Discussion
Sugestão de concentração de ácidos graxos e toxina da cólera
Embora o mecanismo exato de como ácidos graxos aumentar a imunidade da mucosa é desconhecida, vários estudos têm tentado investigar os seus efeitos benéficos. Este estudo tem como objectivo proporcionar o método para determinar a concentração máxima de ácidos gordos que as células podem tolerar bem como a concentração máxima de toxina da cólera que as células podem tolerar sem uma influência significativa sobre a sobrevivência da célula.
Para determinar a concentração de três ácidos gordos (ácido oleico, linoleico e linolénico), bem como a toxina da cólera para o tratamento de células, sem efeito adverso significativo sobre a viabilidade das células que solubilizado dos ácidos gordos e da toxina da cólera e células de cultura de tecidos tratados, diferindo concentrações seguido por um ensaio de MTT para avaliar a viabilidade. Com base na nossa metodologia e resultados que fornecem as gamas de ácidos gordos e toxina da cólera útilpara futuras investigações que visam utilizar esses ácidos graxos ou toxina da cólera (veja abaixo). Sugerimos que as concentrações de 1, 5-10, e 5-10 (ng / mL) para o ácido oleico, ácido linoleico e linolénico, respectivamente, para a utilização de células epiteliais intestinais humanas. Também recomendamos o uso de <30 ng (por 200 mL, ver métodos) da toxina da cólera usando BALB / C rato macrófagos. Nós reconhecemos que, pelo menos para a toxina da cólera, foi observada nenhuma diferença significativa entre a viabilidade celular para o controlo positivo em comparação com os tratamentos. No entanto, a nossa recomendação baseia-se na relativamente elevada variabilidade na viabilidade das células que foi observado como um resultado do aumento de nível de exposição a toxina.
Estudos do Futuro
Os dados apresentados neste estudo para os ácidos gordos e os níveis de toxina da cólera pode ser usado em estudos posteriores. Nós fornecemos um exemplo de uma tal investigação aqui.
A cólera é uma doença associada com desenvpaíses que não têm esgoto adequado e estações de tratamento de água e de água potável fugir. Em 2009, a taxa de mortalidade de mais de 3.000 foi relatado por um período de cinco meses, devido à cólera sintomas relacionados Zimbabwe sozinho em. 14 A partir de 2011, a cólera continua a ser uma epidemia em diferentes regiões do mundo, incluindo um surto no Haiti (CDC, 2010) . Um estudo de genética molecular em 2010 mostrou evidências de que a bactéria neste surto era de origem nepalesa. 15 A doença é causada pela ingestão de alimentos ou água contaminados com fezes e colonização do intestino por V. cholerae, seguido pelo lançamento de uma enterotoxina. Enquanto as vacinas de cólera não existem, nem sempre são eficazes na prevenção da infecção durante os surtos. Intervenções eficazes e de baixo custo são necessários para as populações onde ocorrem surtos de cólera. Uma abordagem consiste em estudar se fontes de alimentos que são ricos em derivados, tais como ácido oleico, linoleico e linolénicofornecer ou melhorar a imunidade da mucosa contra a infecção por cólera. Funções de imunidade da mucosa através da utilização de receptores de proteína encontrada na superfície das células, tais como receptores Toll-like (TLR 16) e domínios de ligação de nucleotídeos (NLRs). Através de alterações na composição da membrana e a libertação de ligandos que interagem com TLRs e NLRs, a adição de ácidos gordos para o epitélio intestinal pode aumentar a função do receptor de reconhecimento de micróbios perigosos e recrutar as respostas imunitárias adequadas. Para determinar os efeitos ácidos gordos sobre a infecção de cólera, a dinâmica de citocinas, tais como a libertação da célula do TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12, devem ser estudadas mais em células epiteliais intestinais humanas do que em macrófagos de ratinho (Figura 4). Tal conhecimento de futuros estudos nos ajudará a entender melhor o mecanismo pelo qual os ácidos gordos podem funcionar para prevenir a infecção, a fim de proporcionar, finalmente, intervenções eficazes para inibir a cólerade surtos. É possível que o tratamento de células com ácidos gordos antes da infecção toxina da cólera irá ajudar a induzir e / ou aumentar a resposta imune da mucosa no epitélio intestinal, finalmente, aumentando a viabilidade celular durante a infecção microbiana cólera.
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Disclosures
Os autores deste estudo não têm qualquer interesse financeiro a partir dos resultados deste estudo. O financiamento para este estudo foi fornecido para FT pela Universidade Kean, no entanto, FT é atualmente um funcionário Kingsborough Community College.
Acknowledgments
Agradecemos Paula Cobos e Dr. Evros Vassiliou de assistência laboratório e fornecer os macrófagos de camundongos, respectivamente. Agradecemos também o nosso laboratório gerente Richard Criasia para orientação e ajuda com os materiais. Finalmente, os autores agradecem Ramanpreet Kaur ajuda com produção de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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