Summary
거미 실크 섬유는 특별한 기계적 특성을 표시합니다. 설계
Abstract
Araneus diadematus 피브로인 4 (ADF4), 재조합 거미 실크 단백질 eADF4의 자연 순서에 따라 (C16) 설계되었습니다. 이 고도의 반복적 인 단백질은 48kDa의 분자량을 가지고 있으며 (hexafluoroisopropanol (HFIP), 포름산 및 수성 버퍼) 다른 용매에 용해됩니다. eADF4 (C16)은 같은 영화, 캡슐, 입자, 하이드로 젤, 코팅, 섬유 및 부직포의 메쉬로 형태소로 처리 다양한 기술 응용 프로그램에 대한 높은 가능성을 제공합니다. 화학적 안정성과 통제 형태에 의해, 후자는 필터 재료를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 전기 방사 재조합 거미 실크 단백질의 부직포 메쉬의 증착, 다른 공기 정화 장치의 효율을 향상시킬 수있는 절차를 제시한다. 부드러운 섬유에 HFIP 결과에 용해 eADF4 (C16)의 전기 방사. 다른 섬유 직경 (80-1,100 NM)과 단백질 농도의 변화 (5~25% W / V)의 결과부직포 메쉬 따라서 기공 크기.
단백질 갓 회전 섬유에 주로 α-나선 차 구조를 표시하므로 HFIP에서 eADF4 (C16) 전기 방사의 후 처리가 필요하며, 따라서 섬유는 수용성이다. 에탄올 증기와 이후의 치료는 실크 섬유 및 메쉬의 형태를 유지 방수, 안정 β-시트 구조의 형성을 유도합니다. 이차 구조 분석은 푸리에 변환 적외선 분광기 (FTIR)과 이후 푸리에 자기 디컨 볼 루션 (FSD)를 사용하여 수행 하였다.
기본 목표는 정상에 실크 부직포 층을 추가하여 기존 필터 기판의 필터 효율을 향상시킬 수 있었다. 기간을 전기 방사의 영향 및 필터 효율에 따라서 부직포 층의 두께를 평가하기 위해, 우리는 입자 증착 측정과 함께 공기 침투성 시험을 수행 하였다. 실험은 표준에 따라 수행되었다프로토콜을 지원합니다.
Introduction
강도와 확장의 그들의 조합으로 인해, 거미 실크 섬유는 대부분의 다른 천연 또는 합성 섬유 1보다 더 많은 운동 에너지를 흡수 할 수있다. 또한, 대부분의 합성 고분자 물질과는 달리 실크 소재는 독성 및 생체 적합성이며, 2,3를 통합하는 경우에는 알레르기 반응을 일으킬 수 없다. 상상 속 건강 위험은 거미 실크를 사용하여 방지 할 수 있습니다. 이러한 기능은 의료 및 기술 응용 프로그램의 다양한 거미 실크는 매우 매력적. 거미가 자신의 야만적 행위로 인해 양식이 될 수 없기 때문에, 생명 공학 방법은 모두 비용 효율적이고 충분한 양 4, 거미 실크 단백질을 생산하기 위해 개발되었습니다.
재조합 실크 단백질 eADF4 (C16)는 Araneus diadematus 피브로인 4 (ADF4)의 자연 순서에 따라 설계되었습니다. eADF4 (C16)는 48kDa 5의 분자량을 가지고 있으며 (hexafluorois 다양한 용매에 용해opropanol (HFIP) 6, 포름산 7 수성 버퍼) 8. eADF4 (C16)은 같은 영화 9, 캡슐 8, 입자 10, 하이드로 겔 11, 코팅 7, 섬유 12 부직포 메쉬 6와 같은 다른 형태소로 처리 할 수 있습니다. 화학적 안정성으로 인해, 후자는 필터 응용 프로그램에서 높은 잠재력을 제공합니다.
여기, 우리는 전기 방사 재조합 거미 실크 단백질의 부직포 메쉬를 포함하여 공기 필터 장치를 조작하는 프로토콜을 제시한다. 전기 방사 또는 정전기 방사는 일반적으로 이미 필터 응용 프로그램을 14로 조사 된 10 나노 -10 μm의 13 일 및 부직포 메쉬의 범위의 직경을 가진 고분자 섬유를 생산 고용하는 기술입니다. 과거에는 전기 방사가 성공적으로뿐만 아니라 재조합 생산 16 거미 실크로 재생 15 처리를 위해 적용되었습니다단백질. 일반적으로 높은 전기 전압 (5-30 kV의)는 주사기와 8~20센티미터의 거리에 배치 상대 전극 (0-20 kV의)에 적용됩니다. 강한 정전기 필드는 충전 솔루션 내에서 반발력을 유도합니다. 표면 장력을 초과하면, 테일러 콘을 형성하고, 얇은 제트 팁 17,18에서 폭발합니다. 형성 한 후, 굽힘 불안정성은 더욱 용매 증발 스트레칭 일으키는 제트에서 발생하고 단단한 섬유 형성된다. 마지막으로, 섬유는 무작위 부직포 메쉬 19로 상대 전극에 입금됩니다. 직경 표면 토폴로지 (다공성, 부드러운)와 같은 섬유 속성은 농도, 점도, 표면 자유 에너지와 용매의 고유 전기 전도도와 투과도 20 개의 솔루션 매개 변수에 주로 의존한다. 솔루션의 단백질 농도에 따라 80-1,100 nm의에서 직경 부드러운 섬유에 HFIP 결과에 용해 eADF4 (C16)의 전기 방사.HFIP에서 eADF4 (C16) 전기 방사는 주로 α-나선 차 구조를 표시하고 섬유는 물에 6 수용성이다. 실크 섬유를 안정화하기 위해, β-시트 구조는 에탄올 후속 처리에 의해 유도해야합니다. 이전에 설정된 후 처리 방법 21 대조적으로, 본 연구 eADF4 (C16) 부직포에 실크 섬유의 형태를 유지하기 위해 에탄올 증기로 처리하고 있습니다. 이차 구조 분석은 문헌 22에 설명 된대로 푸리에 변환 적외선 분광기 (FTIR)과 이후 푸리에 자기 디컨 볼 루션 (FSD)를 사용하여 수행 하였다. FSD는 FTIR 스펙트럼의 해상도가 몇 가지 중복 대역으로 구성 할 수있는 신호 처리 도구입니다. 따라서, I 지역 가운데 넓은의 불명료 한 밴드는 향상된 최대 해상도 deconvoluted 스펙트럼을받을 수 하이 패스 필터를 사용하여 축소 할 수 있습니다.
EFF을 평가하기 위하여실크 부직포 메쉬를 보완 필터 기판의 iciency는 공기 투과성 시험은 표준 프로토콜에 따라 Akustron 장치를 사용하여 수행 하였다. 증착 속도는 팔라스 보편적 인 입자 선별기를 사용하여 측정 하였다.
Protocol
1. 마약 준비를 회전
- eADF4 (C16) 단백질을 동결 건조 가라.
- 높은 정밀도 스케일을 사용하여 1 ML 반응 용기에 eADF4 (C16)의 20 밀리그램 무게.
- hexafluoroisopropanol (HFIP) 200 μl를 추가하고 파라 필름과 용기를 밀봉하십시오.
참고 : HFIP 매우 휘발성 해로운 것입니다. 그것은 신중하게 안전 후드, 피펫 아래의 호흡 트랙 작업에 해를 입힐하고, 튜브 캡 수. - 소용돌이는 1 분간 정지 및 추가 솔루션을 취소 흔들어. 확인하려면, 단백질의 전체 양이 완전히 용해되어, 이상 밤 기다립니다.
2. 전기 방사
- 장소 카운터 전극과 전극 (-22.5 kV의)과 상대 전극 (+2.5 kV의) 두 가지 사전 설정 전압의 상단에있는 필터 재료 : 전기 방사 장치 (그림 1)를 준비합니다. 315 μL / 시간에 부피 유량을 설정합니다.
참고 : W하일 전기 방사 독성 HFIP이 증발됩니다. 당신의 전기 방사 장치 흄 후드에 연결되어 있는지 확인합니다. - 상업적으로 이용 가능한 20 G 바늘을 30 mm의 잔여 길이 손 분쇄기 날카로운 끝을 갈기. 1 ML의 주사기에 바늘을 연결합니다.
참고 : 평면 바늘 끝은 잘 정의 된 테일러 콘을 생성하기 위해 필요합니다. - 주사기로 전체 방사 도프 (200 μL)을로드합니다. 완벽한 솔루션이 회전하는 과정에서 돌출 될 수 있도록하기 위해, 공기의 100 μL와 함께 마약을 오버레이.
참고 : 바늘의 막힘 방지하기 위해 회전 마약에는 입자 (집계 또는 불순물)이 없는지 확인하십시오. 흄 후드에서 작동! - 전기 방사 장치의 주사기 펌프에 채워진 주사기를 연결하고 물방울 바늘의 끝에 나타날 때까지 조심스럽게 주사기로 피스톤을 누르십시오. 피스톤을 잠급니다.
- 거리를 설정바늘의 끝과 8~20센티미터에 상대 전극 사이.
- 주사기 펌프를 시작하고 바늘의 개통에서 (일반적으로 밖으로 건조) 액을 제거하십시오. 즉시 전기 방사 장치의 안전 설치를 활성화하고 즉시 새로운 물방울이 나타나는 높은 전압 소스를 시작합니다. 방사 도프의 전기 방사하여 연속적으로 시작됩니다. 회전 기간을 제어하는 스톱워치를 사용합니다.
참고 : 솔루션의 건조 방지하고 따라서 바늘 막힘하기 위해, 즉시 건조 액을 제거한 후 회전하는 프로세스를 시작해야합니다. - 재조합 거미 실크 단백질의 전기 방사하기 때문에 습도와 온도에 따라 각각의 실험 조건으로 공정 변수의 적응 (그림 2)이 필요할 수 있습니다.
참고 : 충분한 유량을 사용한다 (그림 2B) 건조 물방울을 방지 할 수 있습니다. 낮은 가습기가있는 경우TY는 주변 분위기, 상대 습도를 조정하거나 흐름 속도를 높입니다. 적절한 테일러 콘이 발생할 때까지 전압을 낮 춥니 다 (그림 2A). 팁 (그림 2C) 전혀 해결책이 없을 때, 유량을 높이고 물방울이 발생할 때까지 전압을 낮 춥니 다. 그런 다음 안정되어있는 테일러 콘 (그림 2A)을 설정하기 위해 전압을 조정합니다. - 30 주사기 펌프 오프 스위치를 전기 방사의 초 / 60 초 / 90 초 후. 떨어지는 물방울을 방지하기 위해, 주사기에 잔류 압력을 해제하는 높은 전압 소스를 켜기 전에 10 초를 기다립니다.
- 단계 6 ~ 8은 이러한 비교를위한 폴리 아미드, 폴리 프로필렌과 폴리 에스테르 부직포 메쉬뿐만 아니라 검은 종이로 필터 재료의 다양한 유형을 수행 할 수 있습니다.
- 이후 안정성 실험 부직포 메쉬를 생성하기 위해 필터 재료 대신에 검은 종이를 사용하고 5 단계에서 7 단계를 수행합니다. 전기 방사의 5 분 후에 중지과정은 8 단계에서 설명했다.
3. 실크 부직포 메쉬의 후 처리
- 60 미리 가열 오븐 ° C.
- eADF4 (C16) 부직포 메쉬 수직으로하고 잠금 유리 용기 2 cm의 최소 거리로 필터 기판을 놓습니다. 컨테이너는 이후 에탄올과 물을 소개하는 데 사용되는 두 개의 구멍이 있어야합니다.
참고 : 필터 재료를 고정 할 때, 투수 실험에 필요한 영역은 클램프에 의해 손상되지 않았는지 확인합니다. - 후 처리 용기의 내부 바닥 (그림 3)에 가리키는 실리콘 튜브 두 60 ML의 주사기, 에탄올로 가득 하나 물이 가득 하나를 연결합니다.
주 : 치료 후 컨테이너에서 액체를 제거 할 수하기 위해, 가능한 한 근접하게 아래로 파이프의 구멍을 배치합니다. - 오븐에서 치료 후 컨테이너를 배치EN과 주사기를 돌출시켜 에탄올 60 mL를 추가합니다. 치료 기간을 제어하는 스톱워치를 사용합니다.
- 에탄올 증기 치료 90 분 후, 유리 주사기 에탄올을 제거하고, 두 번째 주사기에 물 60 mL를 추가합니다.
- 또 다른 90 분 동안 기다린 후 물을 제거하고 오븐을 끄십시오. 완전히 식을 때까지 응축하여 물방울을 방지하기 위해, 오븐에 컨테이너를 둡니다.
4. 거미 실크 부직포 메쉬 분석
- 검은 종이 또는 기타 이동식 지원에 대한 안정성 테스트를위한 실크 부직포 메쉬를 준비합니다. 골판지 밖으로 두 프레임을 잘라 두 번 끈끈한 접착 테이프를 조정합니다. 실크 부직포 메쉬 위에 하나의 프레임은 검은 종이에 입금 누르고 실크 섬유 (SEM 이미징 이후의 과잉 섬유를 유지)의 과잉을 차단하기 위해 메스를 사용합니다. 조심스럽게 종이에서 부직포를 분리하기 위해 프레임을 제거합니다. 두 번째 프레임이 단계를 반복(그림 4).
- 실제 딥 시험 : 각 조각 (1cm 2), 사후 처리 및 비 처리 된 실크 부직포 메쉬를 잘라 탈 물에 담근다. 처리 된 부직포 메쉬 (그림 5) 안정 될 동안 처리하지 않은 실크 부직포 메쉬 즉시 용해됩니다. 침지 후, 담근 샘플을 건조 SEM 이미지 준비를합니다.
- 푸리에 변환 적외선 분광기 (FTIR) 측정 및 연속 푸리에 자기 디컨 볼 루션 (FSD) 부직포 메쉬의 후 처리에 따라 실크 단백질의 구조적 변화에 대한 정보를 얻기 위해, FTIR이 매개 변수를 사용하여 적용 할 수 있습니다 투과율 800 4,000센티미터 -1 모드, 스캔, 60 축적을 측정하고 각각의 스펙트럼 평균을 하나의 참조 스펙트럼에 따라 측정된다. 데이터의 정량 분석을 위해, FSD (그림 6, 그림 7) 고용 할 수 있습니다. 따라서, 곡선 데이터를 AR로 감소1,590 및 1,705cm -1 기준 개정과 EA가 수행됩니다. 지역 최소 자승법은 22 (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1,698cm -1) 이전의 연구에서 가져온 최고 위치에 따라 계산됩니다.
- SEM 이미지 : SEM은 섬유 직경과 다른 필터 기판에 실크 섬유의 형태를 조사하고 섬유의 형태 (그림 8)의 후 처리의 영향을 분석하기 위해 적용 할 수 있습니다. 충분히 상세한 이미지를 얻기 위해 25,000 X 5,000 X의 배율을 사용합니다.
5. 공기 침투성의 결정
- Akustron 공기 투과성 장치의 측정 영역에 필터 재료의 적절한 피팅 부품을 배치. 참고 :: 당신은 공기 침투성 장치의 다른 유형을 사용하는 경우, DIN의 요구 53 887, DIN 53 120, ISO를 충족하는지 확인 9237 및 ASTM D 737-96 표준.
- Akustron 공기 침투성 장치 (또는 다른로 5.1에 묘사 된) 사용합니다. 필요가 NORMED 데이터를 계산하면 [L / (m 2 개 초)].
- 샘플의 다른 부분과 1 단계와 2 단계를 적어도 10 번 반복 연산 중간 (그림 9)을 계산합니다.
참고 : 측정 공기 침투성이 장치의 연락처 및 부직포 메쉬가 필요합니다. 따라서, 샘플의 취급에주의가 섬세한 실크 부직포 메쉬의 파열을 방지하기 위해 필수적이다.
6. 필터 효율의 결정
- 압력 제어와 같은 범용 입자 선별기 (팔라스 GmbH를, 카를 스루에, GER)와 같은 입자 계수기와 적절한 기계를 사용합니다.
- 장치와 측정 입자 보존 (그림 10)에서 필터 샘플을 놓습니다. 에어로졸 : 디 에틸 헥실 sebacat (DEHS) 입자 크기 : 0.3-3 μm의, 지속 시간 : 30 초, 액체 속도 : 2,350센티미터 / 초, 공기 흐름 : 3천4백m 3 / 시간.
참고 :주의 샘플을 처리하고 부직포 메쉬의 파괴를 방지하고 오염을 방지하기 위해 표면을 만지지 마십시오. 성능 측정을 위해 동일한 품질의 충분한 샘플을 만들어야합니다.
Representative Results
10 %의 농도로 재조합 거미 실크 솔루션의 전기 방사 HFIP에서 W / V는 부직포 메쉬의 형성을 허용, 80 ~ 120 nm의 직경 범위 부드러운 섬유로 만들었습니다. 에탄올 증기와 사후 처리는 실크 부직포 후 처리의 적절한 방법 (그림 8)로 설립, 따라서이었다 눈에 띄는 형태 변화로 이어질하지 않았다. 구조적 변화는 FT-IR과 I 밴드가 하나의 공헌 피크 (그림 6)을 분석하기 위해 수행 된 가운데 후속 FSD를 사용하여 검출 하였다. 그것은 α-나선 싶게 임의의 코일 구조의 내용 (그림 7) 감소하면서 사후 처리, β-시트 구조의 증가로 연결되는 표시 할 수 있습니다. 이 결과는 사실상 물 (그림 5)에 부직포 사후 처리를 찍기로 입증 할 수 있습니다. 하나라도 주 후에, 부직포 메쉬의 더 용해가 발생하지 않습니다.
회전 뒤배급은 전기 방사 섬유의 증가 밀도에 따라 압력 강하에 의한 필터 소재의 실크 부직포의 적용에 관한 가장 중요한 매개 변수입니다. 따라서 확장 된 회전 기간 운트 공기 침투성의 지수 감소 섬유층 결과의 높은 숫자. 이 효과는 치료 후 이전과 이후의 모든 다른 필터 기판 재료 (그림 9)에 대한 감지 할 수있다. 마찬가지로, 서브 마이크로 미터의 입자 증가 실크 함유 필터 재료 (그림 10)의 여과 효율. 짧은 회전 기간 (30 초) 낮은 필터 효율, 높은 회전 기간 (90 초)보다 높은 효율로 리드를 얻을 수 있지만.
그림 1. 높은 전기 전압 (0 ~ 30 kV의) I 의는 실크 용액을 가득 주사기에 적용하고, 상대 전극 (0-20 kV의)는 8~20cm의 거리에 배치됩니다. 이 설정은 충전 솔루션 내에서 반발력을 유도, 강한 정전기 장을 발생합니다. 표면 장력을 초과하면, 테일러 콘을 형성하고, 얇은 제트 끝에서 폭발합니다. 형성 한 후, 굽힘 불안정성은 더욱 용매 증발 스트레칭 일으키는 제트에서 발생하고 단단한 섬유 형성된다. 마지막으로, 섬유는 무작위 부직포 메쉬의 형태로 상대 전극에 입금됩니다.
일반 테일러 콘 (A), 건조 물방울 (B), 그리고 물방울 (C)없이 설치의 그림 2. 사진.
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기상 후 치료 기간 동안 그림 3. 도식 절차. 첫 번째 단계에서, 챔버는 에탄올로 가득하고, 샘플은 90 분 동안 60 ° C에서 찐 있습니다. 후속 처리를 위해 부직포 메쉬를 완화하기 위해, 60 90 분 동안 에탄올을 제거하고 섬유를 수증기로 찐 ° C.는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 후 처리에 사용되는 첨부 실크 부직포 메쉬와 함께 골 판지 프레임의 사진.
그림 5. Electrosp유엔과 이후 사후 처리 된 건조 상태 (A)에 물 (B)에 따라 부직포.
그림 6. 아미드 (A) 치료 및 사후 처리 (B) 거미 실크 부직포 메쉬의 I 밴드의 푸리에 자기 deconvoluted 흡수 스펙트럼. 실선은 디컨 볼 루션 후 유도로 단일 공헌 피크 (점선)으로 인한 흡수 밴드를 표시합니다. 각각의 곡선의 할당이 문헌 22에서 이전에 발행 된 값을 기반으로하고 있었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 7. 비 처리 및 eADF4 (C16) 사후 처리 부직포 메쉬의 이차 구조의 콘텐츠입니다.
. 전기 방사 eADF4의 그림 8 SEM 이미지 (C16) 섬유 다른 필터 기판 : 폴리 아미드 (PA), 전 (S1) 후 폴리 에스테르 (PE), 폴리 프로필렌 (PP) 순수 eADF4 (C16) 섬유 (S2) 후 에탄올 증기 치료. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 9. 공기 침투성 검사, 전 (A)과 후 처리 후 (B) 에탄올 증기와 실크 부직포 메쉬의 증가 회전 시간 이후에 공기 투과성을 낮추고 더 많은 짠것이 아닌 레이어로 이어집니다.
그림 10. 에탄올 후 처리 후, 실크 레이어 수량에 영향을 미치는 다른 회전 기간의 폴리 아미드 필터 물질에 전기 방사 거미 실크 부직포 메쉬에 디 에틸 헥실 sebacat 에어로졸 필터 효율.
Discussion
새 필터 장치는 일정 이상의 필터 효율의 공기 여과의 전반적인 에너지 소비를 절감 할 수 있어야합니다. 여기에, 이러한 장치는 거미줄로 만든 부직포를 사용하여 만들어졌습니다. 낮은 표면 장력과 높은 변동성으로 인해, HFIP는 전기 방사에 적합한 용매로 선정되었습니다. 또한, 수성 실크 솔루션은 이전의 실험에서 테스트되었습니다, 그러나 섬유가 생성 될 수 있습니다. 여기에, 그것은 표면 장력을 낮추고함으로써 솔루션의 회전 특성을 개선하기 위해 첨가제를 사용하는 것이 중요 할 것이다. 가장 중요한 단계는 높이, 전압, 압출 속도를 회전시키는 조건과 사용되는 재료의 농도와 방사 용액의 용매를 조정하는 것입니다. 연주 중에, 팁의 막힘 예를 들어 수증기 형태의 습기로 바늘 끝을 제공하여 방지 할 수 있지만, 전기 방사 설정에서 추가의 어떤 종류 연속적으로 방해 할 수민감한 프로세스와 전기장. 중요한 공정 변수 (농도, 전압, 거리, 습도) 개별적으로 별도의 실험 시리즈 (데이터가 표시되지 않음)을 수행하고 측정 하였다. 고려 사항으로 모든 매개 변수를 복용하면이 연속 테일러 콘 균일 한 섬유를 만드는 회전하는 프로세스를 돌봐 매우 중요합니다.
필터 효율은 필터 재료의 가장 중요한 변수 중 하나입니다. 이 매개 변수는 주로 필터 재료의 구조에 의해 영향을 받는다. 부직포는 균일 한 기공 크기 및 이후 일관 공기 침투성을 상속합니다. 그것은 모공을 채울하고 무결점 필터를 생성하기 위해 이러한 템플릿 자료에 균일 한 부직포 메쉬를 생성 할 중요하다. 우리의 필터에서 필터 효율은 부직포 메쉬 층의 수에 따라서, 회전 기간 (실크 단백질)에 직접적인 의존성을 표시합니다. 단일 섬유 사이의 간격이 지속적으로 유지 (을)를 가능하게 채워F 작은 입자.
이 작품에서 우리는 높은 필터 효율을 보여주는 거미 실크 짠것이 아닌 메시를 가진 새로운 필터 재료를 생산하는 방법을 소개했다. 따라서 이러한 필터는 공기 여과 시스템의 미래 사용을위한 유망한 후보입니다.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 안자 라우터 바흐 (Lehrstuhl Biomaterialien), 로렌츠 SUMMA (샌들러 AG)와 민 Boeck의 (B / S / H / G)의 기술 및 과학 지원을 인정합니다. SEM 이미징은 요하네스 디엘 (Lehrstuhl Biomaterialien)에 의해 수행되었다. 자금 BMBF (01RB0710)에서 파생되었다.
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