Воздушный фильтр устройства, включая нетканые Петли Electrospun рекомбинантных белков Паутина

Summary

Волокна шелка паука отображать необычные механические свойства. Engineered

Abstract

На основе природной последовательности Araneus Diadematus Фиброин 4 (ADF4), рекомбинантного белка шелка паука eADF4 (C16) был разработан. Это часто повторяющихся белок имеет молекулярную массу 48kDa и растворим в различных растворителях (гексафторизопропанол (ГФИП), муравьиной кислоты и водные буферы). eADF4 (С16) обеспечивает высокий потенциал для различных технических применений при обработке в морфологии, такие как пленки, капсулы, частиц, гидрогели, покрытий, волокон и нетканых сеток. Благодаря своей химической стабильности и контролируемой морфологией, последний может быть использован для улучшения фильтрующих материалов. В этом протоколе, мы представляем процедуры для повышения эффективности различных устройств фильтр воздуха, осаждением из нетканого ячейками электропряденых рекомбинантных белков шелка паука. Электропрядения из eADF4 (С16), растворенный в HFIP результатов в гладких волокон. Изменение концентрации белка (5-25% вес / объем) приводит к различных диаметров волокна (80-1,100 нм)Таким образом, размер пор нетканого сетки.

Доочистка eADF4 (С16) электропряденых от HFIP необходимо, так как белка отображает преимущественно α-спиральные вторичной структуры в только что формованные волокна, и поэтому слои являются водорастворимыми. Последующая обработка паров этанола индуцирует образование водостойкость, стабильность β-складчатых структур с сохранением морфологии волокон шелка и сеток. Вторичный анализ структуры проводили с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии (FTIR) и последующего Фурье самостоятельно деконволюции (FSD).

Основная цель заключается в повышении эффективности фильтра существующих фильтров подложки путем добавления шелка нетканых слоев на вершине. Для оценки влияния электропрядение продолжительность и таким образом нетканый слой толщиной эффективность фильтра, мы провели испытания проницаемости воздуха в сочетании с измерениями осаждения частиц. Эксперименты проводились в соответствии со стандартомпротоколов.

Introduction

Из-за их сочетание прочности и расширяемость, волокна шелка паука может поглощать больше кинетической энергии, чем большинство других натуральных или синтетических волокон ^1. Кроме того, в отличие от большинства синтетических полимерных материалов шелк материалы должны быть нетоксичными и биосовместимыми и не вызывают аллергические реакции при введении ^2,3. Предполагаемые риски для здоровья можно предотвратить с помощью паучьего шелка. Эти особенности делают шелк паука весьма привлекательным для различных медицинских и технических приложений. Так как пауки не может быть обрабатывали из-за их людоедский поведение, биотехнологических методов были разработаны для получения белков шелка паука, и экономически эффективно и в достаточных количествах ^4.

Рекомбинантного белка шелка eADF4 (С16) была разработана на основе природного последовательность Araneus Diadematus Фиброин 4 (ADF4). eADF4 (С16) имеет молекулярную массу от 48kDa ⁵ и растворим в различных растворителях (hexafluoroisopropanol (ГФИП) ^6, муравьиная кислота ⁷ и водные буферы) ^8. eADF4 (С16) могут быть обработаны в различной морфологии, такие как пленки ^9, капсулы ^8, частицы ^10, гидрогели ^11, покрытий ^{7, 12} волокна и нетканые сетки ^6. Благодаря своей химической стабильности, последние обеспечивают высокий потенциал в фильтр приложений.

Здесь мы приводим протокол для изготовления воздушных фильтров устройств, включая нетканые сетки электропряденых рекомбинантных белков шелка паука. Электропрядение или электростатического формования является метод обычно используют для производства полимерных волокон с диаметрами в диапазоне от 10 нм -10 ⁺¹³ мкм и нетканой сетки уже были исследованы на фильтрах ^14. В прошлом электропрядения был успешно применен для обработки регенерированного ^15, а также рекомбинантно ¹⁶ шелка паукабелками. Обычно высокое электрическое напряжение (5-30 кВ) применяется к шприца и противоположный электрод (0-20 кВ), расположенных на расстоянии 8-20 см. Сильное электростатическое поле индуцирует силы отталкивания из загруженной решение. Если поверхностное натяжение превышении конуса Тейлора формируется, и тонкой струей извергается из кончика ^17,18. После образования, гибка неустойчивости происходит в течение струи приводит к дальнейшему растяжения как растворитель испаряется, и твердый волокна сформированы. Наконец, волокно случайно нанесенных на противоположный электрод как нетканый сетки ^19. Свойства волокон, как диаметр и топологии поверхности (гладкие, пористые) в основном зависит от решения таких параметров, как концентрация, вязкость, свободной поверхностной энергией и собственной электропроводностью растворитель и проницаемость ^20. Электропрядения из eADF4 (С16), растворенного в ГФИП приводит к гладкой волокна диаметром от 80-1,100 нм в зависимости от концентрации белка в растворе.eADF4 (С16) электропряденых от HFIP отображает преимущественно α-спиральные структуры и вторичные волокна растворимы в воде ^6. С целью стабилизации волокон шелка, β-складчатых структур должны быть индуцирован с последующей обработкой этанолом. В отличие от ранее установленных после лечения методами ^21, в данном исследовании eADF4 (С16), нетканые материалы были обработаны паров этанола в целях сохранения морфологии волокон шелка. Вторичный анализ структуры проводили с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии (FTIR) и последующего Фурье самостоятельно деконволюции (FSD), как описано в литературе ^22. FSD является обработки сигналов инструмент, который позволяет разрешение ИК-спектр, состоящий из нескольких перекрывающихся полос. Таким образом, нечеткие полосы среди широкой области I могут быть сужены помощью фильтра верхних частот для получения деконволюции спектр с улучшенными пик разрешения.

Для того чтобы оценить эффiciency фильтра подложки дополнена шелк нетканые сетки, тесты воздухопроницаемости проводили с использованием Akustron устройство в соответствии со стандартными протоколами. Скорости осаждения были измерены с помощью частиц Palas универсальный классификатор.

Protocol

1. Подготовка прядильного раствора

1. Возьмите лиофилизированы eADF4 (С16) белка.
2. Взвесить 20 мг eADF4 (С16) в 1 мл реакционного сосуда с помощью высокой степенью точности.
3. Добавить 200 мкл гексафторизопропанол (ГФИП) и запечатать сосуд парафильмом.
   Примечание: HFIP является крайне неустойчивым и вредное. Как он может причинить вред в дыхательные пути, работу по защитным кожухом, пипетка тщательно, и заглушите пробкой.
4. Vortex суспензию в течение 1 мин и дальнейшее поколебать его, чтобы очистить решения. Чтобы обеспечить, что вся сумма белка полностью не растворится, подождите в течение ночи.

2. Электропрядения

1. Подготовьте электропрядения устройство (рис. 1): Место фильтрующего материала сверху противоположного электрода и заданное напряжение обоих электродов (-22,5 кВ) и противоположным электродом (2,5 кВ). Установите громкость потока до 315 мкл / час.
   Примечание: WHile электропрядения, токсичных HFIP будет испаряться. Убедитесь, что ваш электропрядения устройство подключено к вытяжным шкафом.
2. Возьмите коммерчески доступным 20 G игла и измельчить острым наконечником с рукой мясорубки до остаточной длины 30 мм. Подключите иглу шприца емкостью 1 мл.
   Примечание: кончик иглы плоскости требуется для того, чтобы создать четко определенный конус Тейлора.
3. Загрузите весь прядильный раствор (200 мкл) в шприц. Наложение допинг со 100 мкл воздух, с тем чтобы дать полное решение для экструдирования в процессе прядения.
   Примечание: Для того, чтобы избежать засорения игл, убедитесь, что там нет частиц (агрегатов или примесей) в прядильный раствор. Работа под тягой!
4. Приложить заполненный шприц в шприцевой насос из электропрядение устройство и осторожно нажмите на поршень шприца, пока капли не появится на кончике иглы. Блокировка поршня.
5. Установите расстояниемежду кончиком иглы и противоположным электродом, 8-20 см.
6. Начало шприцевой насос и удалить (обычно высохли) капли из отверстия от иглы. Активировать все безопасности установок электропрядения устройство немедленно и начать источника высокого напряжения, как только появляется новая капля. Электропрядения из прядильного раствора начнет впоследствии. Использовать секундомер для контроля спиннинг продолжительности.
   Примечание: Во избежание высыхания раствора и, таким образом закупоривать иглы, необходимо немедленно начать процесс прядения после удаления высушенного капли.
7. Поскольку электропрядение рекомбинантных белков шелка паука зависит от влажности и температуры, адаптации параметров процесса по отношению к отдельным лабораторных условиях может быть необходимо (рис. 2).
   Примечание: Чтобы предотвратить капли от сушки (фиг. 2В) позволяют с достаточной скоростью потока. Если есть низкий увлажненияти в окружающей атмосфере, регулировать относительную влажность или повышение скорости потока. Понизить напряжение до подходящего конуса Тейлора не происходит (рис. 2А). Когда нет решение на кончике (фиг.2С), повышение скорости потока и понизить напряжение, пока капли не происходит. Затем отрегулируйте напряжение для того, чтобы наладить регулярный и стабильный конус Тейлора (рис. 2А).
8. Через 30 сек / 60 сек / 90 сек электропрядения Выключите шприцевой насос. Для того, чтобы избежать падения капель, подождите 10 секунд перед выключением высокого напряжения источника выпустить остаточное давление в шприце.
9. Шаги 6 до 8 могут быть выполнены на различных типах фильтрующих материалов, таких как полиамид, полипропилен и полиэфирные нетканые сетки, а также черную бумагу для сравнения.
10. Для изготовления нетканого материала сетка для последующих экспериментов стабильность, использовать черную бумагу вместо фильтрующего материала и выполнять шаги с 5 по 7. Через 5 мин электропрядения, остановитепроцесс, описанный в пункте 8.

3. Доочистка Шелковый Нетканые Сетки

1. Предварительный нагрев печи до 60 ° С.
2. Поместите фильтр подложках с eADF4 (С16) нетканые сетки по вертикали и на расстоянии не менее 2 см в запираемый стеклянной таре. Контейнер должен иметь два отверстия, которая будет использоваться в последующем ввести этанолом и водой.
   Примечание: При креплении фильтрующих материалов, убедитесь, что площади, необходимой для экспериментов проницаемости не повреждается зажимов.
3. Соединение двух 60 мл шприцы, один с этанолом и один заполненный водой, с силиконовой трубы указывая внутрь нижней части последующей обработки контейнеров (рис. 3).
   Примечание: для того, чтобы иметь возможность удалить жидкость из контейнера после обработки поместить отверстия трубы как можно ближе ко дну.
4. Поместите последующая обработка контейнеров в О.В.ванной и добавляют 60 мл этанола путем экструзии шприца. Использовать секундомер для контроля продолжительности лечения.
5. Через 90 мин обработки паров этанола, удаления этанола с шприц из стекла, и добавляют 60 мл воды из второго шприца.
6. Подождите еще 90 минут, затем удалить воду и выключить духовку. Для того чтобы избежать капель путем конденсации, оставьте емкость в печь, пока она не должна остыть.

4. Анализ паутина Сетки Нетканые

1. Подготовьте шелка нетканых сетках для тестов стабильности на черной бумаге или любом другом съемном поддержки. Вырезать два кадра из картона и настроить двойной липкой лентой. Нажмите один кадр на сетку нетканые шелковые нанесенные на черную бумагу и использовать скальпель, чтобы отрезать избыток шелковых волокон (держать от волокон для последующего SEM-изображения). Осторожно снимите кадр для того, чтобы отсоединить нетканых от бумаги. Повторите эту операцию со второй кадр(Рис. 4).
2. Практический экзамен DIP: Отрежьте кусок (1 см ²⁾ каждого из них, при последующей обработке и необработанными сетки шелка нетканых и опустите ее в деионизированной воде. Необработанной шелковой сетки нетканых немедленно растворяются, в то время как обработанные нетканые сетки будет стабильным (рис. 5). После погружения, высушите ближний образца и подготовить его к SEM изображения.
3. Инфракрасной Фурье-спектроскопии (ИК)-измерения и последующего самостоятельного Фурье свертки (ФУР): Для того, чтобы получить информацию о структурных изменениях протеины шелка по доочистке нетканые сетки, ИК может применяться с использованием параметра: коэффициент пропускания -режиме сканирования от 800 до 4000 см ^-1, 60 накоплениями измеряется и усредняется для каждого спектра, одна ссылка измеряется в спектре. Для количественного анализа данных, FSD могут быть использованы (фиг.6 и 7). Таким образом, кривые приведены к данным арEA между 1590 и 1705 см ^-1 и коррекции базовой линии выполняется. Местные наименьших квадратов рассчитывается по положениям пиков взяты из предыдущих исследований (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 см ^{-1) 22.}
4. SEM изображения: SEM могут быть применены для исследования диаметров волокон и морфология шелковых волокон на различных подложках фильтра и проанализировать влияние после лечения на морфологии волокна (рис. 8). Используйте увеличениях х 5000 до 25000 х, чтобы получить достаточно детальные изображения.

5. Определение воздухопроницаемость

1. Разместите правильно подобранным часть фильтрующего материала на измерительной площади проницаемость воздуха Akustron устройства. Примечание :: Если вы используете другой тип устройства, воздухопроницаемость, убедитесь, что он соответствует требованиям DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 и ASTM D 737-96 стандартам.
2. Используют проницаемость воздуха Akustron устройство (или любой другой, как показано на 5.1). При необходимости расчета нормированных данных [л / (м ² х с)].
3. Повторите шаги 1 и 2 не менее 10 раз с различными частями вашего образца и рассчитать средние арифметические (рис. 9).
   Примечание: Измерение проницаемости воздуха требует контакта устройства и нетканые сетки. Таким образом, осторожное обращение образцов необходима, чтобы предотвратить разрыв тонкой сетки нетканых шелка.

6. Определение Эффективность фильтра

1. Используйте соответствующий аппарат с регулятором давления и счетчика частиц, например универсальный классификатор частиц (Palas GmbH, Карлсруэ, Германия).
2. Поместите фильтр образцов в устройство удержания и мера частиц (рис. 10). Аэрозоль: Ди-этилгексил-sebacat (DEHS); размеры частиц: 0,3-3 мкм, длительность: 30 сек; скорость жидкости: 2350 см / сек; расход воздуха: 3400 м ³ / час.
   Примечание: Ручка образца с осторожностью и не прикасайтесь к поверхности, чтобы предотвратить разрушение нетканые сетки и избежать любого загрязнения. Будьте уверены, чтобы создать достаточно выборках равного качества для измерения производительности.

Representative Results

Электропрядения из растворов рекомбинантных шелка паука с концентрацией 10% вес / объем от HFIP привело к гладкой волокна с диаметрами в диапазоне от 80 до 120 нм, что позволяет формирование нетканые сетки. Последующая обработка паров этанола не приводит к заметным морфологическим изменениям, который был, таким образом, создан в качестве надлежащего способа шелка нетканых после лечения (рис. 8). Структурные изменения были обнаружены с помощью FT-IR и последующего FSD в условиях I группы проводили анализ одиночных пиков взноса (рис. 6). Было показано, что пост-обработка приводит к увеличению β-складчатых структур, а содержание α-спиральных унд случайных структур катушки уменьшается (рис. 7). Этот результат может быть практически доказано путем погружения последующей обработке нетканых в воду (рис. 5). Даже после одной недели, не растворение нетканые сетки не произойдет.

Спиннинг дюрацион является наиболее важным параметром, касающихся применения шелка нетканых фильтрующих материалов в связи с падением давления основано на увеличении плотности волокон электропряденых. Расширенные вращающийся унд длительности таким образом, большее количество результатов слоев волокон в экспоненциальное уменьшение воздухопроницаемости. Этот эффект был обнаружен для всех различных фильтрующих материалов подложки до и после дополнительной обработки (рис. 9). Кроме того, эффективность фильтрации из шелка содержащие фильтрующие материалы суб-микронных частиц увеличивается (рис. 10). В то время как короткий спиннинг длительности (30 сек) Прибыль фильтр низких эффективности, более высокой продолжительности спиннинг (90 сек) приводит к более высокой эффективности.

Рисунок 1. Высокие электрические напряжения (0-30 кВ) я сек применяется к шприц с шелком раствора и противоположным электродом (0-20 кВ) помещают на расстоянии 8-20 см. Эта установка приводит к сильному электростатического поля, вызывая силы отталкивания из загруженной решение. Если поверхностное натяжение превышении конуса Тейлора формируется, и тонкой струей вырывается из наконечника. После образования, гибка неустойчивости происходит в течение струи приводит к дальнейшему растяжения как растворитель испаряется, и твердый волокна сформированы. Наконец, волокно случайно нанесенных на противоположном электроде в виде нетканого материала сетки.

Рисунок 2. Фотографии регулярно конуса Тейлора (А), высушенный капли (B), а также установки без капли (С).

iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Схематическое процедура, во время пар после лечения. На первом этапе, камера заполнена этанол, и образец обрабатывают паром при 60 ° С в течение 90 мин. Для того, чтобы смягчить нетканые сетки для последующей обработки, этанол удаляют, а волокна на пару с водяным паром в течение 90 мин при 60 ° C. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4. Фотография картонной раме с прикрепленными шелка нетканых сеток, которые будут использоваться для пост-обработки.

Рисунок 5. Electrospип и впоследствии подвергнут последующей обработке нетканого материала в сухом виде (А) и в воде (В).

Рисунок 6. Фурье самостоятельно деконволюции спектр поглощения амида я группа необработанной (A) и пост-обработке (B) шелка паука нетканые сетки. Сплошная линия отображает полосу поглощения в результате одиночных пиков вклада (пунктирные линии), как полученные после деконволюцией. Назначение соответствующих кривых была основана на ранее опубликованных значений из литературы ^22. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

T-ширина = "5 дюймов" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg" />
На рисунке 7. Вторичные структуры содержания необработанных и обработанных сообщение eADF4 (С16) нетканые сетки.

. Рисунок 8 СЭМ изображения электропряденых eADF4 (С16)-слоями на различных подложках фильтра: полиамид (PA), полиэфир (ПЭ), полипропилена (ПП) и чистый eADF4 (С16) волокон до (S1) и после (S2) после обработка паров этанола. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

/ Ftp_upload/50492/50492fig9.jpg "/>
На рисунке 9. Испытаний Воздухопроницаемость, до (А) и после дополнительной обработки (В) из шелка нетканых входит в зацепление с паров этанола, повышение спиннинг раз привести к более слоев нетканого материала впоследствии снижение проницаемости воздуха.

Рисунок 10. Эффективность фильтра ди-этил-гексил-sebacat аэрозоля на электропряденых шелка паука нетканые сетки на полиамид фильтрующих материалов при различных прядильных длительности, влияющие на количество шелка слой, после дополнительной обработки этанолом.

Discussion

Новый фильтр устройства должны позволит снизить общее потребление энергии в области фильтрации воздуха при постоянном или выше фильтра эффективности. Здесь, такие устройства были созданы с использованием нетканых материалов из шелка паука. Из-за низкого поверхностного натяжения и высокую летучесть, HFIP был выбран в качестве подходящего растворителя для электропрядение процесса. Кроме того, водные растворы, шелковых были испытаны в предыдущих экспериментах, но волокна не могут быть получены. При этом, было бы важно использовать добавки для снижения поверхностного натяжения и тем самым улучшить свойства прядильного раствора. Наиболее важным шагом является корректировка условий и используемого материала и концентрации растворителя прядильного раствора, спиннинг высоты, напряжения и скорости экструзии. Во время выполнения, например засорение кончика может быть предотвращено путем подачи кончик иглы с влагой в виде водяного пара, но любые дополнения в электропрядение установка может впоследствии мешатьчувствительным процессом и электрического поля. Основные параметры процесса (концентрация, напряжение, расстояние, влажность) отдельно определены проведение отдельной серии экспериментов (данные не показаны). Принимая во внимание все параметры во внимание очень важно, чтобы заботиться о непрерывном конуса Тейлора и прядения для создания однородных волокон.

Эффективность фильтра является одним из наиболее важных параметров фильтрующих материалов. Этот параметр в основном зависит от структуры фильтрующего материала. Wovens наследуют равномерным размеров пор и в дальнейшем последовательно воздухопроницаемость. Это имеет решающее значение для создания однородной нетканых сетках на этих шаблонов материалов для заполнения пор и сформировать бездефектное фильтр. Эффективность фильтра в наших фильтров показывает прямую зависимость от вращающегося продолжительность (из протеинов шелка), и, следовательно, на количество слоев нетканого материала сетки. Зазоры между одиночными волокнами последовательно заполнены, позволяя удержание ое более мелкие частицы.

В этой работе мы ввели способ получения новых фильтрующих материалов с ячейкой паучьего шелка нетканых, показывая высокую эффективность фильтра. Таким образом, эти фильтры являются перспективными кандидатами для будущего использования в системах фильтрации воздуха.