Air Filter enheter, inkludert vevet maskene av elektrospunnede Rekombinant Spider Silke Proteiner

Summary

Edderkopp silke fiber vise ekstraordinære mekaniske egenskaper. Konstruert

Abstract

Basert på den naturlige rekkefølgen av Araneus diadematus fibroin 4 (ADF4), den rekombinant edderkopp silke protein eADF4 (C16) har blitt utviklet. Denne svært repetitive protein har en molekylvekt på 48kDa og er oppløselig i forskjellige løsemidler (heksafluorisopropanol (HFIP), maursyre og vandige buffere). eADF4 (C16) gir et stort potensial for ulike tekniske programmer når behandles i morfologi som filmer, kapsler, partikler, hydrogeler, belegg, fiber og vevde maskene. På grunn av deres kjemiske stabilitet og kontrollert morfologi, kan sistnevnte anvendes for å forbedre filtermaterialer. I denne protokollen, presenterer vi en prosedyre for å effektivisere ulike luftfilter enheter, ved deponering av vevde masker av elektrospunnede rekombinante edderkopp silke proteiner. Electrospinning av eADF4 (C16) oppløst i HFIP bidrar til en jevnere fibre. Variasjon av proteinkonsentrasjonen (5-25% w / v) resulterer i ulike fiberdiametre (80-1,100 nm) ogsåledes porestørrelser av den ikke-vevede maske.

Etter-behandling av eADF4 (C16) elektrospunnede fra HFIP er nødvendig siden proteinet viser en overveiende α-helisk sekundær struktur i fersk spunnet fiber, og således at fibrene er vannløselige. Påfølgende behandling med etanol damp induserer dannelsen av vannavstøtende, stabile β-sheet strukturer, bevare morfologi av silke fiber og maskene. Sekundær struktur-analyse ble utført ved hjelp av Fourier-transform infrarød (FTIR) og påfølgende Fourier selv-dekonvolusjon (FSD).

Det primære målet var å forbedre filteret effektiviteten av eksisterende filter underlag ved å legge silke vevde lag på toppen. Til å vurdere påvirkningen av electrospinning varighet og dermed vevde tykkelse på filteret effektivitet, utførte vi luft permeabilitet tester i kombinasjon med partikkel deponering målinger. Forsøkene ble utført i henhold til standardprotokoller.

Introduction

På grunn av deres kombinasjon av styrke og tøyelighet, kan edderkopp silke fibre absorberer mer kinetisk energi enn de fleste andre naturlige eller syntetiske fibre ^en. Videre, i motsetning til de fleste syntetiske polymere materialer silke materiale er ikke giftig og biokompatibel og ikke forårsaker allergiske reaksjoner når de er inkorporert ^2,3. Antatte helserisikoer kan forebygges ved hjelp av edderkopp silke. Disse egenskapene gjør edderkopp silke meget attraktive for en rekke medisinske og tekniske anvendelser. Siden edderkopper ikke kan være oppdrettsfisk på grunn av deres kannibalistiske atferd, har bioteknologiske metoder er utviklet for å produsere edderkopp silke proteiner, både kostnads-effektivt og i tilstrekkelige mengder ^fire.

Den rekombinant silke protein eADF4 (C16) har blitt utviklet basert på naturlig sekvens av Araneus diadematus fibroin 4 (ADF4). eADF4 (C16) har en molekylvekt på 48kDa ⁵ og er oppløselig i forskjellige løsningsmidler (hexafluoroisopropanol (HFIP) ^6, maursyre ⁷ og vannholdige buffere) ^8. eADF4 (C16) kan behandles i forskjellige morfologier eksempel ⁹ filmer, kapsler ^8, partikler ^{10, 11} hydrogeler, belegg ^{7, 12} fibre og ikke-vevede nett ^6. På grunn av deres kjemiske stabilitet, sistnevnte gir høyt potensial i filteranvendelser.

Her presenterer vi en protokoll for å dikte luftfilter enheter, inkludert en vevet netting av elektrospunnede rekombinante edderkopp silke proteiner. Electrospinning eller elektrostatisk sentrifugering er en teknikk som vanligvis anvendes for fremstilling av polymerfibre med diametre innen området fra 10 nm -10 um ^13, og ikke-vevede nett har allerede blitt undersøkt for ¹⁴ filteranvendelser. I det siste har electrospinning blitt brukt for behandling av regenerert ¹⁵ samt rekombinant produsert ¹⁶ edderkopp silkeproteiner. Typisk vil en høy elektrisk spenning (5-30 kV) tilføres til en sprøyte og en motelektrode (0-20 kV) plassert i en avstand på 8-20 cm. Den sterke elektrostatiske feltet induserer frastøtende kreftene innenfor belastes løsning. Hvis overflatespenningen overskrides tilsettes et Taylor-kjegle dannet, og en tynn stråle bryter ut fra spissen ^17,18. Etter dannelsen, bøying ustabiliteter oppstå i dysen noe som ytterligere strekker seg så løsningsmiddelet fordamper, og en fast fiber er dannet. Til slutt blir den fiber tilfeldig avsettes på motelektroden som et ikke-vevet maske ^19.. Fiber egenskaper som diameter og overflaten topologi (glatt, porøs) er i hovedsak avhengig løsning parametere som konsentrasjon, viskositet, overflate fri energi og løsemiddel iboende elektrisk ledningsevne og permeabilitet ^20. Electrospinning av eADF4 (C16) oppløst i HFIP bidrar til en jevnere fibre med diameter fra 80-1,100 nm avhengig av proteinkonsentrasjonen i løsningen.eADF4 (C16) elektrospunnede fra HFIP viser en overveiende α-helisk sekundær struktur og fibrene er vannløselige ^6.. For å stabilisere de silke fibre, β arks strukturer må bli indusert ved etterfølgende behandling med etanol. I motsetning til tidligere etablerte post-behandlingsmetoder ^21, har i denne studien eADF4 (C16)-vevde tekstiler vært behandlet med etanol damp for å bevare morfologien av silke fibre. Sekundær struktur-analyse ble utført ved hjelp av Fourier-transform infrarød (FTIR) og påfølgende Fourier selv-dekonvolusjon (FSD), som beskrevet i litteraturen ^22. FSD er en signalprosesseringsenhet verktøy som tillater oppløsning av FTIR spektra bestående av flere overlappende band. Dermed kan de utydelige band av den brede seg blant jeg region begrenses ved hjelp av et high pass filter for å motta en deconvoluted spektrum med forbedrede peak resolusjoner.

For å vurdere efficiency av filter underlag supplert med silke vevde masker, ble luft permeabilitet tester utført ved hjelp av en Akustron enhet i henhold til standard protokoller. Deponering priser ble målt ved hjelp av en Palas universell partikkel sizer.

Protocol

En. Spinning Dope Forberedelse

1. Ta lyofiliseres eADF4 (C16) protein.
2. Vei opp 20 mg eADF4 (C16) i en 1 ml reaksjonskar ved hjelp av en høy presisjon skala.
3. Tilsett 200 ul av heksafluorisopropanol (HFIP) og forsegle fartøyet med Parafilm.
   Merk: HFIP er svært volatile og ødeleggende. Som det kan føre til skade på luftveiene spor, arbeid under en avtrekkshette, pipette nøye, og hetten røret.
4. Vortex suspensjonen i 1 min og videre rist det for å fjerne løsning. For å sikre, at hele mengden av protein er fullstendig oppløst, vente over natten.

2. Electrospinning

1. Klargjør elektrospinning enhet (figur 1): sted filtermaterialet på toppen av motelektroden og på forhånd kan spenningen av både elektroden (-22.5 kV) og motelektroden (2,5 kv). Still inn volumet strømme til 315 mL / hr.
   Merk: while electrospinning, giftig HFIP vil være fordampet. Sørg for at electrospinning enheten er koblet til en avtrekkshette.
2. Ta en kommersielt tilgjengelig 20 G nål og male den skarpe spissen med en hånd jeksel til en gjenværende lengde på 30 mm. Koble nålen på en 1 ml sprøyte.
   Merk: Et fly nålespissen er nødvendig for å generere en veldefinert Taylor kjegle.
3. Laste hele spinnende impregneringsstoff (200 pl) inn i sprøyten. Overlegg av dope med 100 mL av luft, for å tillate den fullstendige løsning som skal ekstruderes under spinneprosessen.
   Merk: For å unngå tilstopping av nålen, sørg for at det ikke finnes partikler (aggregater eller forurensninger) i spinning dop. Arbeid under en avtrekkshette!
4. Fest fylte sprøyten til sprøytepumpen av elektrospinningen enheten og forsiktig trykk på stempelet på sprøyten inntil en dråpe kommer til syne på spissen av nålen. Låse stempelet.
5. Angi distansenmellom spissen av nålen og motelektroden til 8-20 cm.
6. Start sprøytepumpe og fjerne den (vanligvis tørket ut) dråpen fra åpningen av nålen. Aktivere alle sikkerhetsinstallasjoner av electrospinning enheten umiddelbart og starte høyspenningskilde så snart en ny dråpe kommer til syne. Electrospinning av spinnende dope vil starte senere. Bruk en stoppeklokke for å kontrollere spinnende varighet.
   Bemerk: For å unngå uttørking av oppløsningen og dermed tilstopping av kanylen, er det nødvendig å starte umiddelbart spinneprosessen etter fjerning av det tørkede dråpene.
7. Siden electrospinning av rekombinante edderkopp silke proteiner er avhengig av luftfuktighet og temperatur, kan en tilpasning av prosessparametre mot individuelle laboratorieforhold være nødvendig (figur 2).
   Merk: For å forhindre dråpen tørker (figur 2B) gjør en tilstrekkelig vannmengde. Hvis det er en lav hygrostatty i den omkringliggende atmosfæren, justere den relative luftfuktigheten eller øke flow rate. Senke spenningen til en skikkelig Taylor kjegle skjer (Figur 2A). Når det ikke er noen løsning på spissen (figur 2C), øke strømningshastigheten og senke spenningen inntil en dråpe inntreffer. Deretter justerer spenningen for å etablere en regelmessig og stabil Taylor Cone (Figur 2A).
8. Etter 30 sek / 60 sek / 90 sek electrospinning slå av sprøytepumpe. For å unngå fallende dråper, vent 10 sek før slår av høyspenningskilde for å løsne det gjenværende trykket i sprøyten.
9. Fremgangsmåte 6 til 8 kan utføres på forskjellige typer filtermaterialer, slik som polyamid, polypropylen og polyester nonwoven maskene, samt svart papir for sammenligning.
10. For å produsere en ikke-vevd netting for påfølgende stabilitet eksperimenter, bruker sort papir istedenfor filtermateriale og utføre trinnene 5-7. Etter 5 min av electrospinning, stoppden prosess som er beskrevet i trinn 8.

3. Post-behandling av silke vevet maskene

1. Forvarm ovnen til 60 ° C.
2. Plasser filteret underlag med eADF4 (C16) vevde masker vertikalt og med en avstand på minst 2 cm i en låsbar glassbeholder. Beholderen bør ha to åpninger som vil bli benyttet senere for å innføre etanol og vann.
   Merk: Ved montering av filteret materialer, sørg for at området er nødvendig for permeabilitet eksperimenter ikke er skadet av klemmene.
3. Koble to 60 ml sprøyter, en fylt med etanol og en fylt med vann, med silikon-rør som peker inn i den indre bunnen av den post-behandling beholder (figur 3).
   Bemerk: For å være i stand til å fjerne væske fra beholderen etter behandlingen, plassere åpningene i rørene så nær som mulig til bunnen.
4. Plasser etter behandlingen container i OVnn og tilsett 60 ml etanol ved å ekstrudere i sprøyten. Bruk en stoppeklokke for å kontrollere behandlingstid.
5. Etter 90 min etanol damp behandling, fjerne etanol med sprøyten fra glasset, og tilsett 60 ml vann fra den andre sprøyten.
6. Vente til en annen 90 min, deretter fjerne vannet og slå av ovnen. For å unngå at dråper ved kondensering, forlater beholderen i ovnen før det er helt avkjølt.

4. Analyse av edderkopp silke vevet maskene

1. Forbered silke vevde masker for stabilitet tester på svart papir eller andre flyttbare støtte. Skjær to rammer av papp og justere dobbelt-klebrig tape. Trykk én ramme på silke vevde mesh avsatt på svart papir og bruke en skalpell til å kutte av overskuddet av silke fiber (holde overflødige fibre for etterfølgende SEM-imaging). Fjern forsiktig rammen for å løsne nonwoven fra papiret. Gjenta dette trinnet med den andre rammen(Figur 4).
2. Praktisk dip test: Klipp et stykke (1 cm ²⁾ av hvert, det post-behandlet og ubehandlet silke vevde mesh og dyppe den i avionisert vann. Den ikke-behandlede silke nonwoven mesh vil umiddelbart oppløses, mens det behandlede ikke-vevde mesh vil være stabil (figur 5). Etter å ha dyppet, tørke dyppet prøven og klargjøre den for SEM bildebehandling.
3. Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR)-måling og påfølgende Fourier self-deconvolution (FSD): For å få informasjon om de strukturelle endringene i silke proteiner ved etterbehandling av vevde nett, kan FTIR påføres med parametrene: Transmittance -modus, skanning fra 800 til 4000 cm ^-1, er 60 ansamlinger målt og i gjennomsnitt for hvert spektrum, er en referanse målt per spekteret. For kvantitativ analyse av dataene, kan FSD benyttes (figur 6 og figur 7). Derved blir kurvene redusert til dataene area mellom 1590 og 1705 cm ^-1 og en baseline korreksjon er utført. En lokal minst firkantet form er beregnet i henhold til peak posisjoner tatt fra tidligere studier (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 cm ^{-1) 22.}
4. SEM avbildning: SEM kan anvendes for å undersøke fiberdiametre og morfologien av silke fibre på forskjellige substrater, og filter for å analysere påvirkningen av den post-behandling på fiberen morfologi (figur 8). Bruk forstørrelser av 5000 x 25.000 x for å få tilstrekkelig detaljerte bilder.

5. Fastsettelse av luftgjennomtrengelighet

1. Plasser en riktig montering del av filteret materialet på måling av areal på en Akustron luftgjennomtrengelighet enhet. Merk :: Hvis du bruker en annen type luft permeabilitet enhet, må du kontrollere at den oppfyller kravene til DIN 53 887, 53 DIN 120, ISO 9237 og ASTM D 737-96 standarder.
2. Anvende et Akustron luftgjennomtrengelighet enhet (eller en hvilken som helst annen som vist i avsnitt 5.1). Om nødvendig beregne normert data [l / (m ² x sek)].
3. Gjenta trinn 1 og 2 minst 10 ganger med ulike deler av prøven og beregne aritmetisk midten (Figur 9).
   Merk: Measuring luftgjennomtrengelighet krever kontakt mellom enheten og vevde mesh. Dermed er en forsiktig håndtering av prøvene viktig for å hindre brudd av den skjøre silke nonwoven mesh.

6. Fastsettelse av Filter Efficiency

1. Bruk en skikkelig maskin med trykkontroll og partikkel teller, slik som et partikkel sizer (Palas GmbH, Karlsruhe, Ger).
2. Plasser filteret prøver i enheten og måle partikler (Figur 10). Aerosol: Di-etyl-heksyl-sebacat (DEHS); partikkelstørrelser: 0,3-3 mikrometer, varighet: 30 sekunder; væskehastigheten: 2350 cm / sek, luftstrøm: 3400 m ³ / time.
   Merk: Håndter prøven med forsiktighet og ikke berøre overflaten for å hindre ødeleggelse av vevde mesh og unngå forurensning. Sørg for å lage nok prøver av samme kvalitet for resultatmåling.

Representative Results

Electrospinning av rekombinante edderkopp silke løsninger med konsentrasjoner på 10% vekt / volum fra HFIP ført glatte fibre med diameter i området 80-120 nm, slik at dannelsen av ikke-vevde nett. Post-behandling med etanol damp førte ikke til synlige morfologiske endringer, som var derfor etablert som en skikkelig måte av silke vevet post-behandling (Figur 8). Strukturelle forandringer ble detektert ved bruk av FT-IR og påfølgende FSD av amid I bånd ble utført for å analysere enkelt bidrag toppene (figur 6). Det kunne vises at etter behandling fører til en økning i β arks strukturer, mens innholdet av α-sylindrisk und tilfeldig spiral strukturer avtar (figur 7). Dette resultatet kan i praksis vist seg ved å dyppe et post-behandlet ikke-vevet inn i vann (Figur 5). Selv etter en uke, vil ingen oppløsning av den ikke-vevede maske forekomme.

Spinning durasjon er den viktigste parameter i forbindelse med anvendelsen av silke nonwovens i filter-materialer på grunn av trykkfallet basert på den økende tetthet av elektrospunnede fibre. Utvidet spinnende varigheter und dermed et høyere antall fiberlag resulterer i en eksponentiell reduksjon av luftpermeabilitet. Denne effekten kunne påvises for alle forskjellige filter substratmaterialer før og etter post-behandling (figur 9). Likeledes, filtrering effektiviteten av silke-holdige filtermaterialene av sub-mikrometer partikler øker (Figur 10). Mens korte spinnende varigheter (30 sek) få lave filter effektivitet, høyere spinnende varigheter (90 sek) fører til høyere effektivitet.

Figur 1. Høy elektrisk spenning (0-30 kV) i s anbrakt på en sprøyte fylt med et silke-løsning, og en motelektrode (0-20 kV) er plassert i en avstand på 8-20 cm. Dette oppsettet fører til en sterk elektrostatisk felt, indusere frastøtende kreftene innenfor belastes løsning. Hvis overflatespenningen overskrides tilsettes et Taylor-kjegle dannet, og en tynn stråle bryter ut fra spissen. Etter dannelsen, bøying ustabiliteter oppstå i dysen noe som ytterligere strekker seg så løsningsmiddelet fordamper, og en fast fiber er dannet. Til slutt blir den fiber tilfeldig avsettes på motelektrode i form av et ikke-vevet maske.

Figur 2. Fotografier av en vanlig Taylor kjegle (A), en tørket dråpe (B), og oppsettet uten dråpe (C).

iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg "/>
Figur 3. Skjematisk prosedyre under damp etter behandling. I det første trinnet er kammeret fylt med etanol, og prøven er dampet ved 60 ° C i 90 min. For å mildne den ikke-vevede nett for påfølgende håndtering, blir etanol fjernet og fibrene blir dampet med vanndamp i 90 min ved 60 ° C. Trykk her for å vise større figur .

Fig. 4. Fotografi av en papp ramme med vedlagte silke uvevet masker som skal brukes til etter behandling.

Figur 5. Electrospun, og deretter etter-behandlet ikke-vevd i tørr tilstand (A) og under vann (B).

Figur 6. Fourier selv-deconvoluted Absorpsjonsspekteret av et amid I bånd av en ubehandlet (A) og en post-behandlet (B) edderkopp silke nonwoven mesh. Den heltrukne linjen viser absorbans bandet som følge av de enkelte bidrag toppene (stiplede linjer) som avledet etter deconvolution. Tildelingen av de respektive kurvene var basert på tidligere publiserte verdier fra litteraturen ^22. Klikk her for å se større figur .

t-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg" />
Figur 7. Sekundærstruktur innhold av ikke-behandlet og etter-behandlet eADF4 (C16)-vevde nett.

. Figur 8 SEM bilder av elektrospunnede eADF4 (C16)-fibre på ulike filter underlag: polyamid (PA), Polyester (PE), polypropylen (PP) og ren eADF4 (C16) fibre før (S1) og etter (S2) post- behandling med etanol damp. Klikk her for å se større figur .

/ Ftp_upload/50492/50492fig9.jpg "/>
Figur 9. Luftgjennomtrengelighet tester, før (A) og etter post-behandling (B) av silke vevde masker med etanol damp, økende spinne ganger føre til flere vevde lag deretter senke luften permeabilitet.

Figur 10. Filtereffektivitet av di-etyl-heksyl-sebacat aerosol på elektrospunnede edderkopp silke vevde masker på polyamid filter materialer på ulike spinnende varighet, påvirker silke lag mengde, etter post-behandling med etanol.

Discussion

Nye filter enheter bør tillate å senke det totale energiforbruket i luft filtrering i faste eller høyere filter effektivitet. Her ble slike enheter laget med fiberduk laget av edderkopp silke. På grunn av den lave overflatespenning og høy flyktighet, HFIP har blitt valgt som et passende oppløsningsmiddel for elektrospinningen. Videre har vannholdige silke løsninger er testet i tidligere forsøk, men ingen fibre kan genereres. Her vil det være avgjørende å bruke tilsetningsstoffer for å senke overflatespenningen og derved forbedre den roterende egenskapene til løsningen. Den mest kritiske trinnet er å justere betingelsene og den brukte materiale konsentrasjon og oppløsningsmiddel av den spinnende løsning, spinning høyde, spenning og hastighet ekstrudering. Under ytelse, kan for eksempel tilstopping av tuppen forhindres ved å forsyne nålespissen med fuktighet i form av vanndamp, men enhver form for tilsetninger i elektrospinningen konfigurasjonen kan deretter forstyrreden følsomme prosessen og elektrisk felt. Flyktige prosessparametre (konsentrasjon, spenning, avstand, fuktighet) ble individuelt bestemt utførelse av separate forsøksperiodene serie (data ikke vist). Tar alle parametere i betraktning er det viktig å ta vare på en kontinuerlig taylor kjegle og spinning prosess for å skape ensartede fibre.

Filteret effektivitet er en av de viktigste parametere av filtermaterialer. Denne parameteren blir i hovedsak påvirket av strukturen av filtermaterialet. Wovens arve uniform pore størrelser og senere konsekvent luft permeabilitet. Det er avgjørende å skape homogene ikke-vevde masker på disse mal-materialer for å fylle porene og å generere en null-feil-filteret. Filteret effektivitet i våre filtre viser en direkte avhengighet av den spinnende varighet (av silke proteiner), og derfor, på antall nonwoven mesh sjikt. Gapene mellom de enkelte fibre er jevnt fylt, slik at retensjonen of mindre partikler.

I dette arbeidet innførte vi en fremgangsmåte for å produsere en ny filtermateriale med edderkopp silke Ikke-vevet nett, som viser høy filtereffektivitet. Derfor er disse filtrene er lovende kandidater for fremtidig bruk i luftfiltreringssystemene.