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Biology

की उपयोगिता स्टेज विशिष्ट मध्य से देर से Published: December 2, 2013 doi: 10.3791/50493
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

मध्य से देर ड्रोसोफिला रोम के स्टेज विशिष्ट अलगाव विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोगी है. इस तरह के रोम में इन विट्रो विकास assays और लाइव इमेजिंग के साथ मिलकर किया जा करने के लिए आनुवंशिक और / या pharmacologic जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है जो संस्कृति में विकसित करना. इसके अतिरिक्त, रोम ऐसी mRNA और प्रोटीन को अलग रूप में आणविक पढ़ाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

ड्रोसोफिला oogenesis या कूप विकास व्यापक रूप से जटिल विकासात्मक और सेल जीवविज्ञान प्रक्रियाओं की समझ अग्रिम करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह तरीकों कागज मध्य से देर से मंच के रोम (स्टेज 10B-14) को अलग करने और विकासात्मक समय की तंग खिड़कियों के दौरान होने वाली आणविक और शब्द के भागों की घटनाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उन्हें का उपयोग कैसे करें. पृथक रोम में इन विट्रो विकास assays, लाइव इमेजिंग, mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण और प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सहित प्रयोगात्मक तकनीकों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्टेज 10B (S10B) पर या बाद में रोम संस्कृति में विकास पूरा हो जाएगा, यह एक विकास के विशिष्ट अवधि के दौरान होने वाली प्रक्रियाओं पर इस तरह के जोड़तोड़ के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए इन विट्रो विकास के साथ आनुवंशिक या pharmacologic perturbations गठबंधन करने की अनुमति देता है. इन रोम संस्कृति में विकसित क्योंकि इसके साथ ही, वे आदर्श लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं, अक्सर रूपात्मक घटनाओं मध्यस्थता कि नया तंत्र प्रकट जो. पृथक रोम भी आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, आनुवंशिक perturbations से परिणाम है कि जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन विशिष्ट विकासात्मक खिड़कियों के लिए परिभाषित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, कूप विकास के एक विशेष चरण के दौरान प्रोटीन के स्तर, स्थिरता, और / या posttranslational संशोधन राज्य वेस्टर्न ब्लॉट के माध्यम से विश्लेषण करती है की जांच की जा सकती है. इस प्रकार, ड्रोसोफिला रोम के मंच विशिष्ट अलगाव विकास और morphogenesis का व्यापक रूप से संरक्षित प्रक्रियाओं में जानकारी का एक समृद्ध स्रोत प्रदान करता है.

Introduction

प्रत्येक ड्रोसोफिला अंडाशय 16 ovarioles, या क्रमिक रूप से परिपक्व अंडा कक्षों या रोम की चेन ~ से बना है. प्रत्येक कूप एक एकल oocyte, 15 रोगाणु लाइन व्युत्पन्न नर्स या समर्थन कोशिकाओं, और कूप कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में कहा ~ 650 दैहिक कोशिकाओं से बना है. ड्रोसोफिला oogenesis विकास 1 की 14 आकृति विज्ञान परिभाषित चरणों में बांटा गया है. कूप विकास के हर चरण में यह अपेक्षाकृत आसान चरण विशिष्ट रोम के एक पर्याप्त संख्या अलग करने के लिए कर रही है, एक मक्खी के भीतर कई बार मनाया जाता है.

oogenesis (10B-14 चरणों) के मध्य से देर चरणों (चित्रा 1) चरण अलगाव के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. स्टेज 10B (S10B) में, कूप पूरी तरह से (यानी उसकी लंबाई एक स्टेज 14 (S14) कूप के बराबर है, चित्रा 1 और चित्रा 2H देखें) लम्बी है और कूप की लंबाई आधा नर्स कोशिकाओं से बना हैअन्य आधा oocyte (चित्रा 1C) है. इस स्तर पर नर्स कोशिकाओं cortical actin को मजबूत बनाने और actin filaments 2 के समानांतर बंडलों पैदा करने, नाटकीय actin remodeling गुजरना. इसी समय, कूप कोशिकाओं की आबादी, नर्स कोशिकाओं और oocyte के बीच में विस्थापित, केन्द्राभिमुख कोशिकाओं करार दिया, और कूप कोशिकाओं के दो पृष्ठीय समूहों पृष्ठीय उपांग, भ्रूण 3 के लिए ट्यूबलर सांस apparatuses के लिए फार्म प्रवास गुजरना करने के लिए निर्दिष्ट बनने . नर्स यह embryogenesis (चित्रा -1) को पूरा करने के लिए आवश्यक कारकों के साथ oocyte प्रदान करता है जो नर्स सेल डंपिंग नामक प्रक्रिया में oocyte में उनके cytoplasmic सामग्री फैलाएंगे तो अनुबंध (S11), कोशिकाओं. नर्स कोशिकाओं को फिर कोशिका मृत्यु (S12-S13) 4 से गुजरना है, और कूप कोशिकाओं eggshell 5 (आंकड़े 1E जी) छिपाना और पैटर्न. इस प्रकार, oogenesis के अंत महत्वपूर्ण विकास एक साथ समृद्ध हैडी morphogenetic प्रक्रियाओं.

पृथक मध्य से देर से मंच के रोम (S10B-S14) आणविक विश्लेषण सहित विभिन्न उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मंचन रोम से mRNA RT-पीसीआर, माइक्रोएरे के लिए अलग किया जा सकता है, या आरएनए seq विश्लेषण करती है. यह एक वर्तमान में केवल कुछ प्रकार की कोशिकाओं के साथ, एक छोटी विकासात्मक खिड़की के भीतर जीन अभिव्यक्ति को देखो, और जीन अभिव्यक्ति pharmacologic या आनुवंशिक या तो perturbations से बदल रहा है कैसे निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. स्टेज अलगाव भी पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन को देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक विशिष्ट चरणों में म्यूटेंट बनाम जंगली प्रकार में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर यों की अनुमति देता है, क्योंकि इस तरह के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. एक इस्तेमाल कर सकते हैं Immunofluorescent प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव के कारण पिक्सल के सभी पता लगाने 6 के रैखिक सीमा के भीतर हो कि सख्त जरूरतों को कम मजबूत है, इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए विश्लेषण करती है. इसके अतिरिक्त, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, अन्य जानकारी उपलब्ध करा सकता है इस तरह के एकप्रोटीन posttranslationally संशोधित किया गया है या एक विशिष्ट ब्याह isoform से व्यक्त किया जाता है. पृथक चरणों भी subcellular fractionation या coimmunoprecipitation सहित आगे प्रोटीन शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

स्टेज विशेष कूप अलगाव भी इन विट्रो विकास assays 7 और रहते इमेजिंग 8 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पृथक S10B-S13 रोम (नीचे देखें) सरल संस्कृति मीडिया में S14 के लिए विकसित करने के लिए जारी रहेगा. यह S10A के रोम इस पांडुलिपि में चर्चा की संस्कृति शर्तों का उपयोग डंपिंग नर्स सेल के माध्यम से प्रगति नहीं होगी कि नोट करना महत्वपूर्ण है. हम पढ़ने के बहिष्कार 7,9 के रूप में नर्स डंपिंग सेल और विकास का उपयोग करके actin remodeling को विनियमित करने में, दोनों औषधीय और आनुवंशिक रूप से, prostaglandins की भूमिका को परिभाषित करने के लिए S10B इन विट्रो विकास assays का इस्तेमाल किया है. इसी तरह, विकास के बाद के चरणों में भी pharmacologic उपचार या आनुवंशिक आदमी के प्रभावों का निर्धारण करने के लिए अलग किया जा सकता हैऐसे केन्द्राभिमुख सेल प्रवास, पृष्ठीय उपांग माइग्रेशन / गठन 10, और नर्स कोशिका मृत्यु के रूप में विशेष प्रक्रियाओं पर ipulations. ऐसे assays प्रमुख बातचीत स्क्रीन या assays के प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, PXT में या fascin अकेले परिवर्तन के लिए heterozygosity S10B इन विट्रो विकास पर कोई प्रभाव नहीं है, जबकि डबल heterozygotes प्रदर्शनी नर्स सेल दोष और विकास 9 में एक ब्लॉक डंपिंग से रोम.

S10B -13 संस्कृति में विकसित कर सकते हैं, क्योंकि इसके साथ ही, इस समय के दौरान होने वाले प्रक्रियाओं के सभी रहते इमेजिंग द्वारा मनाया जा सकता है. ऐसे इमेजिंग बस फ्लोरोसेंट जांच या लाइव इमेजिंग रंगों के साथ दाग के रोम व्यक्त ट्रांसजेनिक मक्खियों का उपयोग (एक आकृति विज्ञान में सकल परिवर्तन में ही दिलचस्पी है तो) प्रेषित प्रकाश का उपयोग कर या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. लाइव इमेजिंग काफी विकास की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ अग्रिम करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. दरअसल, कल्पना रहते हैंदेर से मंच के रोम के ग्राम पृष्ठीय उपांग प्रवास का ज्ञान, tubulogenesis 10 का एक उदाहरण का विस्तार किया गया. हम डंपिंग नर्स सेल दौरान actin गतिशीलता सहित अतिरिक्त देर चरण प्रक्रियाओं, के रहते इमेजिंग इन विकासात्मक घटनाओं में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा उम्मीद है. यह S10A और कूप विकास के प्रारंभिक दौर संस्कृति में एक S14 में विकसित करने के लिए जारी नहीं किया जाएगा, जबकि विकास के उन चरणों के दौरान होने वाली घटनाओं के लाइव इमेजिंग (अधिक के लिए चर्चा देखने वैकल्पिक संस्कृति शर्तों 11-14 का उपयोग संभव है कि नोट करना महत्वपूर्ण है जानकारी).

यहाँ हम या तो इन विट्रो विकास के लिए देर से मंच के रोम अलग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और रहते इमेजिंग, या आणविक विश्लेषण (mRNA और प्रोटीन अलगाव).

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Protocol

1. ड्रोसोफिला पिछले अलगाव स्टेज की तैयारी

  1. आसुत पानी की 90 मिलीलीटर के साथ सक्रिय सूखी खमीर के 50 ग्राम के संयोजन से गीला खमीर पेस्ट बनाएं. गठबंधन के लिए एक रंग के साथ मिलाएं. मिश्रण स्थिरता का आकलन करने से पहले ~ 30 मिनट के लिए खड़े हैं. स्थिरता सिर्फ मोटी पर्याप्त एक मक्खी शीशी की तरफ से पालन करने के लिए नहीं बल्कि नीचे की ओर चलाया जाना चाहिए. इच्छित स्थिरता प्राप्त करने के लिए यह 10 अतिरिक्त पानी की मिलीलीटर या सूखी खमीर की एक छोटी राशि में जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कवर कंटेनर में स्टोर संग्रहित खमीर ~ 1-2 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. <वांछित जीनोटाइप के 24 घंटा पुराने वयस्क मक्खियों (दोनों पुरुषों और महिलाओं) लीजिए और मक्खी भोजन प्लस शीशी के पक्ष में लिप्त गीला खमीर पेस्ट के साथ एक शीशी में डाल दिया. मक्खियों से बनाए रखा है, जिस पर तापमान प्रयोग के आधार पर अलग अलग होंगे. दिनचर्या प्रयोगों के लिए, मक्खियों कमरे के तापमान पर रखा जाता है. जबकि एक जीन है जो में प्रयोगोंUAS/GAL4 प्रणाली 15 का उपयोग overexpressed जा रहा है के रूप में उपयुक्त, 25 डिग्री सेल्सियस या अधिक पर मक्खियों को बनाए रखने की आवश्यकता है.
  3. 2 दिनों के लिए दैनिक खमीर पेस्ट की एक ताजा धब्बा साथ मक्खियों प्रदान करें. नोट: कूप विकास कसकर महिला मक्खी के पोषण की स्थिति से नियंत्रित किया जाता है के रूप में, यह विच्छेदन के लिए पहले कम से कम 36 घंटे के लिए पोषक तत्व अमीर खमीर पेस्ट के साथ उड़ प्रदान करने के लिए आवश्यक है.

2. अलग मध्य से देर ड्रोसोफिला रोम मंचन

  1. मीडिया कमरे के तापमान (~ 30 मिनट) के लिए आने की अनुमति दें. मंचन के रोम में इन विट्रो विकास assays के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए जा रहे हैं, हौसले IVEM मीडिया को तैयार (अनुग्रह कीट मीडिया, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन). मंचन के रोम mRNA या प्रोटीन अलगाव अनुग्रह कीट या IVEM मीडिया या तो उपयोग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए जा रहे हैं. महत्वपूर्ण: मीडिया तापमान महत्वपूर्ण है. मीडिया ठंड है, तो इसे बदल जाएगाactin और microtubule cytoskeletons और ब्लॉक विकास दोनों.
  2. सीओ 2 गैस इंजेक्शन लगाने के द्वारा yeasted शीशी में मक्खियों anesthetize और सीओ 2 के तहत एक मक्खी पैड पर 3-5 मादा मक्खियों जगह है. महत्वपूर्ण: मक्खी पैड पर एक 10 मिनट का समय अवधि में विच्छेदित किया जा सकता है और अधिक से अधिक महिलाओं के मत छोड़ो सीओ 2 के लिए बढ़ा जोखिम के रूप में पैदा कर सकता है बाँझपन और मौत.
  3. मीडिया के साथ एक 9 मौके थाली में से एक अच्छी तरह से भरें और (काला Plexiglass का एक टुकड़ा अच्छी तरह से काम करता है) एक अंधेरे सतह के शीर्ष पर जगह है. अच्छी तरह से नीचे पर विदारक गुंजाइश ध्यान दें.
  4. का प्रयोग # 5 Dumont संदंश (यह सबसे अच्छा प्रमुख हाथ का उपयोग किया जाता है) एक हाथ से एक भी महिला उठाओ. यह पंख, पैर, या पेट के संक्रमण को छाती से महिला को लेने के लिए अक्सर सबसे आसान है. अच्छी तरह से भरा मीडिया में महिला डूब. आवश्यक रूप खुर्दबीन ध्यान समायोजित करें.
  5. Nondominant हाथ में आयोजित संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, पेट के पूर्वकाल अंत में महिला हड़पनेपीछे अंत प्रमुख हाथ (2A चित्रा) की ओर से तैनात है कि इतनी. मीडिया में डूबे हुए उड़ रखने के लिए सुनिश्चित करें.
  6. प्रमुख हाथ से, 2 सबसे पीछे pigmented खंड पर छल्ली हड़पने और दूर पेट (आंकड़े 2 बी सी) के बाकी हिस्सों से चीर करने के लिए संदंश का उपयोग करें.
  7. अंडाशय (आंकड़े 2 डी ई) में उभरने जब ​​तक प्रमुख हाथ में संदंश का प्रयोग, धीरे पेट के पूर्वकाल अंत निचोड़. यदि आवश्यक हो, दो अंडाशय के बीच में संदंश जगह है और शव का उन्हें बाहर खींच.
  8. ताजा मीडिया (चित्रा 2 एफ) के साथ एक नया अच्छी तरह से करने के लिए अंडाशय ले जाने या एक Kimwipe या कागज तौलिया के लिए शव हटाता है. यह रोम में इन विट्रो विकास के लिए पृथक किया जा रहा है अगर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
  9. अंडाशय के 3-5 जोड़े पृथक किया गया है जब तक दोहराएँ. नोट: प्रत्येक अंडाशय ~ 16 ovarioles या क्रमिक रूप से परिपक्व होने के रोम की जंजीरों से बना है. प्रत्येक ovarioleएक मांसपेशी म्यान के भीतर निहित है.
  10. पिन vises और उनके साथ आपूर्ति की सुई का प्रयोग, धीरे ovarioles (चित्रा 2 जी) के बीच सुइयों चलाकर अंडाशय अलग खींच. यह कभी कभी के रूप में अच्छी तरह से व्यक्ति के रोम जारी करेंगे.
  11. व्यक्तिगत ovarioles और कूप विकास के आसानी से अलग पहचाना रूपात्मक चरणों अब दिखाई चित्रा (2 जी, अलग छेड़ा अंडाशय) होना चाहिए. आंकड़े 1 और विभिन्न चरणों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि रूपात्मक अंतर के लिए 2H का संदर्भ लें. बरकरार ovarioles के भीतर हैं और अभी भी एक मांसपेशी म्यान के भीतर निहित है कि रोम को अलग करने के लिए, तुरंत ब्याज के कूप निम्नलिखित पूर्ववर्ती कूप के पूर्वकाल में और कूप के पीछे में ovariole भर में कटौती करने के लिए एक सुई का उपयोग करें. यह मांसपेशी म्यान टूट जाएगा और दूर ब्याज के कूप अब यह नुकसान पहुँचाए बिना दूर पड़ोसी के रोम से काटा जा सकता है. व्यक्तिगत चरणों अलग हो रहे हैं के रूप में, ताजा मीडिया के साथ एक नया अच्छी तरह से करने के लिए, एक गिलास पिपेट का उपयोग कर, ब्याज की रोम चाल है. इन विट्रो विकास के लिए रोम अलग है जब यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. नोट: यह अच्छी तरह से भर में ब्याज की रोम redistributing से हवाई बुलबुले को रोकने के लिए मीडिया में प्रवेश करने से पहले पिपेट बल्ब निचोड़ करने के लिए महत्वपूर्ण है. रोम कांच विंदुक चिपके हुए हैं ही, यदि विंदुक ऊपर और नीचे कई बार बीएसए समाधान pipetting और विदारक मीडिया के साथ rinsing द्वारा 3% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ precoated किया जा सकता है.
  12. पर्याप्त रोम पृथक किया गया है एक बार, बाद के प्रयोगों के साथ आगे बढ़ना.

S10B रोम के 3. इन विट्रो विकास

  1. IVEM मीडिया में मंच अलगाव प्रोटोकॉल (चरण 2) का उपयोग S10B रोम अलग. रोम तेजी से दूर मलबे से स्थानांतरित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. इन रोम परिपक्व करने के लिए जारी रहेगा के रूप में, यह जन्मदिन हैS10Bs 30-60 मिनट के लिए एकत्र की है और उसके बाद चुनाव की परिपक्वता मीडिया में रखा जाता है कि rtant. नोट: S10B S10A के रोम IVEM संस्कृति मीडिया में परिपक्व नहीं देगा ध्यान, (1 बी की तुलना में चित्रा 1C) S10A के रोम से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए. S10A और S10B रोम दोनों में, लंबाई के आधे नर्स कोशिकाओं से बना है और दूसरे आधे oocyte है, लेकिन S10B में कूप की लंबाई S14 रोम के बराबर है.
  2. एक गिलास विंदुक का प्रयोग, एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं में ~ 30 S10B रोम चाल है. नोट: स्थानांतरित किया जा रहा रोम के सभी S10B हैं और S11 के लिए परिपक्व नहीं है कि सत्यापित करने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. यानी IVEM मीडिया के साथ साथ औषधीय अभिकर्मकों, अच्छी तरह से प्रति परिपक्वता मीडिया की 1 μl तैयार करें.
  4. एक खींच लिया गिलास विंदुक * का प्रयोग, संभव के रूप में अच्छी तरह से (3.2 कदम) से ज्यादा के रूप में मीडिया को हटाने, और जल्दी चुनाव की परिपक्वता मीडिया जोड़ें. नोट: यह एक खींच लिया गिलास रंज का उपयोग करने के लिए आवश्यक हैमंचन के रोम के रूप में ette आसानी से एक Pipetman साथ कांच pipettes या पिपेट सुझावों के साथ या तो हाथ में लिया जा सकता है.
    * निकाला pipettes बनाने के लिए: 1) गिलास नरम करने के लिए शुरू होता है, तो अभी तक एक लैम्प बर्नर की लौ में लंबे, कांच pipettes की पतली भाग गर्मी, 2) तुरंत लौ से बाहर पिपेट कदम है और में पिपेट आकर्षित करने के लिए क्षैतिज खींच एक महीन ट्यूब, 3) एक अच्छी बात उत्पन्न करने के लिए टूट गया. चेतावनी: कांच के टुकड़े से उड़ सकता है के रूप में आंखों की सुरक्षा का प्रयोग करें.
  5. प्रयोग की आवश्यकता के रूप में दोहराने के रूप में कई कुओं के लिए 3.1-3.4 कदम.
  6. रोम> 10 घंटे के लिए विकसित और एक विदारक गुंजाइश के तहत विकास की प्रगति स्कोर करने की अनुमति दें. नोट: प्रयोगों आमतौर पर रोम को विकसित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए अगले दिन रन बनाए हैं. S10B ~ 5 घंटा है, S11 ~ 30 मिनट है, S12 ~ 2 घंटा है, और S13 थोड़ा अधिक समय लगेगा कमरे के तापमान पर 25 डिग्री सेल्सियस 1 और विकास पर अवधि में ~ 1 घंटा है. S10B रोम के लिए वर्णित है कि इसी तरह के प्रयोगों से किया जा सकता हैS11-S13 के रोम का उपयोग कर प्रदर्शन किया.

4. लाइव इमेजिंग के लिए स्टेज अलगाव

  1. जल्दी से दूर मलबे से रोम चलती है, IVEM मीडिया में मंच अलगाव प्रोटोकॉल (चरण 2) का उपयोग चुनाव के फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त देर से मंच के रोम (S10B-14) पृथक.
  2. नई मीडिया में ब्याज के रोम ले जाएँ और फिर एक coverslip नीचे पेट्री प्लेट को कांच विंदुक द्वारा हस्तांतरण. यह coverslip नीचे क्षेत्र में बुलबुले लेकिन फैल नहीं करता तो मीडिया को जोड़ने के लिए ध्यान रखना.
  3. अब समय चूक फिल्मों के लिए, यह पेट्री प्लेट के अंदर किनारे करने के लिए, पानी के साथ सिक्त तक लुढ़का Kimwipe, जोड़कर पेट्री प्लेट के भीतर नमी बनाए रखने के लिए कभी कभी आवश्यक है. शीर्ष पर ढक्कन रखें.
  4. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर छवि. विस्तृत संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता होगी. यह इमेजिंग, रोशनी की ताकत, और इमेजिंग की लंबाई की आवृत्ति संतुलन के लिए आवश्यक है, यह स्वतंत्र रूप से एक एल के लिए बाहर काम करने की आवश्यकता होगीabeling उपकरण और विकास की प्रक्रिया.

5. MRNA तैयारी के लिए स्टेज अलगाव

  1. अनुग्रह या IVEM मीडिया के साथ या तो मंच अलगाव प्रोटोकॉल (चरण 2) का उपयोग कर व्यक्ति मंच के रोम अलग.
  2. एक गिलास पिपेट का उपयोग, मीडिया के साथ नए कुओं में ब्याज की व्यक्तिगत चरणों के लिए कदम है, यह एक ही बार में कई चरणों इकट्ठा करने के लिए संभव है.
  3. 1 घंटा तहत संग्रह टाइम्स रखें. 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के लिए, एक गिलास पिपेट का उपयोग, रोम ले जाएँ.
  4. रोम के सभी गोली एक मिनी microcentrifuge में संक्षिप्त ट्यूब स्पिन. एक खींच लिया गिलास विंदुक (3.4 कदम देखें) का प्रयोग सावधानी से मीडिया के सभी को हटा दें. नोट: एक पूर्ण आकार microcentrifuge का उपयोग करते हैं, कम गति से रोम नीचे स्पिन.
  5. Trizol के 100 μl जोड़ें और एक प्लास्टिक मूसल का उपयोग ~ 20 सेकंड के लिए हाथ से पीस. एक microcentrifuge में पूर्ण गति से स्पिन और किसी भी pelleted डी परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है एक नया 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब Trizol स्थानांतरितebris. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  6. पर्याप्त रोम प्रयोग के लिए प्राप्त किया गया है जब तक दोहराएँ 5.1-5.5 कदम. नियमित, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, और ~ 100 S14 रोम शाही सेना के ~ 10 ग्राम उपज.
  7. बर्फ पर नमूने पिघलना. एक microfuge ट्यूब में, उचित रूप में, नमूने का मिश्रण है और 800 μl अप करने के लिए Trizol मात्रा लाने. निर्माता के निर्देशों के अनुसार शाही सेना अलगाव के साथ आगे बढ़ें. महत्वपूर्ण: RNase मुक्त DNase साथ पृथक आरएनए का इलाज DNase के लिए याद रखें.

6. पश्चिमी सोख्ता के लिए स्टेज अलगाव

  1. 100 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्मी ब्लॉक पहले से गरम
  2. अनुग्रह या IVEM मीडिया के साथ या तो मंच अलगाव प्रोटोकॉल (चरण 2) का उपयोग कर व्यक्ति मंच के रोम अलग. नोट: यह अनुभव से प्रत्येक विशिष्ट प्रोटीन का पालन करने की जरूरत है कि कैसे एक विशेष मंच कूप के कई निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से 1-3 S10B रोम / एक पश्चिमी धब्बा पर एक मजबूत संकेत देखने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है एकप्रतिनिधि नमूने, कई महिलाओं से रोम ले रही है. इस प्रकार, एक विशेष चरण की 15-20 रोम आमतौर पर एकत्र होते हैं.
  3. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए, एक गिलास पिपेट का उपयोग, रोम ले जाएँ. (कदम 5.4 देखें) के रोम गोली एक मिनी microcentrifuge में संक्षेप में स्पिन. ध्यान से (3.4 कदम देखें) एक खींच लिया गिलास पिपेट का उपयोग कर मीडिया के सभी हटाने और 1x पीबीएस के 50 μl और 2x Laemmli बफर के 50 μl जोड़ें.
  4. एक प्लास्टिक मूसल के साथ 20 सेकंड ~ के लिए हाथ से पीस. नोट: प्लास्टिक pestles धोने से पश्चिमी नमूने पीस और उन्हें autoclaving के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है.
  5. गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए नमूने उबाल लें.
  6. एक microcentrifuge में 15 सेकंड के लिए पूर्ण गति से बर्फ और स्पिन पर संक्षेप में शांत रहो. तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर एक एसडीएस पृष्ठ जेल या दुकान पर लोड या तो नोट: नमूने जमा हो जाती है, तो जेल पर लोड करने से पहले नमूने reboil याद है.
  7. मानक प्रोटोकॉल का पालन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करते हैं.

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Representative Results

ड्रोसोफिला कूप विकास के विशिष्ट चरणों अलग जब यह सही morphological अलग चरणों में भेद करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है. नर्स कोशिकाओं और oocyte प्रत्येक (चित्रा 1 बी 1 सी की तुलना में) इन चरणों में कूप का आधा लंबाई का उपयोग करना, क्योंकि यह S10A और S10B के लिए कुछ हद तक चुनौती दे रहा है. S10B रोम पूरी तरह से लम्बी और एक S14 कूप (1G की तुलना में चित्रा 1C) के लिए लंबाई में इस प्रकार के बराबर हैं लेकिन, जैसा कि S10A के रोम, S10B रोम से लंबाई में कम कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, केन्द्राभिमुख कूप कोशिकाओं बुलाया oocyte से अधिक कूप या दैहिक कोशिकाओं का एक सबसेट नर्स कोशिकाओं और S10B पर oocyte के बीच में विस्थापित करने के लिए शुरू करते हैं. S11 पर नर्स कोशिकाओं अनुबंध, oocyte में उनके cytoplasmic सामग्री फैलाएंगे कि इतनी ~ 5 घंटा लेता है जो S10B, के दौरान, नर्स कोशिकाओं गतिशील actin remodeling गुजरना. इस प्रकार S11 पर, नर्स सेल क्षेत्र हैoocyte (चित्रा -1) विस्तार किया गया है, जबकि काफी कमी आई है. S12 कम, नर्स कोशिकाओं मौत से गुजरना और एक अधिक अपारदर्शी उपस्थिति (चित्रा 1E) पर लेने के लिए शुरू, दिलचस्प है, संस्कृति में, S12 रोम में नर्स सेल अवशेष कर्ल पृष्ठीय ('आंकड़े में 3C' डी S12s देखें). S13 के दौरान कोशिका मृत्यु पूरा किया जा रहा है के रूप में, नर्स सेल क्षेत्र पारदर्शी है, और पृष्ठीय उपांग गठन (चित्रा 1F) उत्पन्न हो रही है. S14 तक केवल oocyte और कूप कोशिकाओं रहते हैं, और पृष्ठीय उपांग गठन (चित्रा 1G) पूरा हो गया है.

इन विट्रो विकास परख (चित्रा 3) डंपिंग S10B विकास और नर्स सेल पर विभिन्न औषधीय उपचार और आनुवंशिक परिवर्तन के परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संस्कृति में S10Bs के विकास हालांकि कारकों में से एक नंबर गरीब प्रयोगात्मक परिणामों को जन्म दे सकता है, मजबूत है. चित्रा 3 में,एक सफल और एक असफल प्रयोग दोनों से प्रयोगात्मक डेटा प्रदान की जाती हैं. एक सफल प्रयोग नियंत्रण मीडिया में जंगली प्रकार के रोम का 80-100% पूर्ण नर्स सेल डंपिंग और S12-14 के लिए प्रगति, जिसमें से एक है (चित्रा 3, WT 1). कभी कभी जंगली प्रकार के नियंत्रण के रोम के कम से कम 80% (चित्रा 3A, WT 2) विकसित जिसका अर्थ है कि विफल हो जाएगा. ) आदि S10B रोम से S10A भेद करने के लिए 1) अक्षमता (आंकड़े 1 और 2 को देखें), 2) मीडिया समस्याओं (तापमान, उम्र, और / या 3) के रोम थे. इस विफलता सहित कई मुद्दों के कारण हो सकता है बहुत लंबे समय तक मलबे से अवगत कराया.

S10Bs की इन विट्रो विकास pharmacologic उपचार के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. इस तरह के प्रयोगों के लिए, यह दवा नियंत्रण, दवा के साथ जंगली प्रकार के रोम का यानी उपचार, हर प्रयोग के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है क्योंकि दवा के प्रभाव और / या concentratआयन समय के साथ बदल सकते हैं. Pharmacologic प्रयोगों के लिए, यह नियंत्रण मीडिया में है कि नशीली दवाओं के उपचार में विकसित करने के रोम का प्रतिशत के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए सुविधाजनक है, इस मामूली आनुवंशिक पृष्ठभूमि मतभेद के लिए नियंत्रित करता है. यह दवा की आईसी 50 एकाग्रता के साथ इलाज के लिए अक्सर उपयोगी है, इस ब्लॉक जंगली प्रकार (YW) का 50% डंपिंग और आगे विकास नर्स सेल के दौर से गुजर से रोम कि एकाग्रता है. . और ब्लॉक, इस प्रकार, जंगली प्रकार के रोम के अनुपात 0.5 (चित्रा 3 बी, दवा 1) होने की उम्मीद है चित्रा 3B एक दवा (एस्पिरिन) (वाष्पीकरण विलायक की संभावना की वजह से दवा 2) भी केंद्रित हो सकता है की एक उदाहरण है 50 से अधिक विकसित करने से जंगली प्रकार के रोम का%. आगे इन विट्रो विकास परख उदाहरण देकर स्पष्ट करने, विकासशील S10B रोम की दो कुओं की छवियों प्रदान की जाती हैं. आंकड़े -3 सी और डी की शुरुआत में S10B के रोम को वर्णनपरख, नियंत्रण या इलाज एस्पिरिन में (~ 2 मिमी) मीडिया. आंकड़े -3 सी 'और डी' का खुलासा, परख के अंत वर्णन है कि एस्पिरिन इलाज के रोम का बहुमत नहीं है, जबकि S14 के लिए विकसित नियंत्रण इलाज के रोम का बहुमत पूरा नर्स सेल डंपिंग.

इन विट्रो विकास परख भी एक विशेष दवा के प्रति संवेदनशील हैं कि आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3E इस के दो उदाहरण हैं. इसके विपरीत, दूसरे उदाहरण में, आनुवंशिक पृष्ठभूमि (expt2, लाल पट्टी) एस्पिरिन के प्रभाव को बढ़ाता है, पहले उदाहरण में, आनुवंशिक पृष्ठभूमि (expt1, नीली पट्टी) अनुपात ~ 0.5 रहता है के रूप में एस्पिरिन के साथ बातचीत करने में विफल रहता है. इस प्रकार, इन विट्रो विकास परख देर oogenesis के दौरान होने वाली विकास और रूपात्मक घटनाओं पर म्यूटेशन और pharmacologic अभिकर्मकों के परिणामों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही, परख (9 देखें) pharmacologic और आनुवंशिक बातचीत दोनों का आकलन किया जा सकता है.

स्टेज अलगाव विकास की प्रक्रिया का लाइव इमेजिंग के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है. 4 Utrophin GFP, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए मानव Utrophin से actin बाध्यकारी डोमेन व्यक्त S10B कूप की एक समय व्यतीत हो फिल्म का एक उदाहरण है चित्रा. इस इमेजिंग उपकरण, actin बंडल गठन और संक्षेपण का उपयोग कल्पना की जा सकती है. कई उपकरण प्रोटीन जाल ट्रांसजेनिक लाइनों 16,17 सहित रहते इमेजिंग, के लिए उपलब्ध हैं, प्रेरित यूएएस fluorescently organelle मार्कर में चिह्नित (mitochondria, Golgi, जालिका, आदि.), संचालित यूएएस fluorescently actin और actin के बंधनकारी प्रोटीन, microtubule (cytoskeletal मार्करों टैग और microtubule) प्रोटीन बंधन, किसी भी व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों fluorescently (नील लाल) शिक्षा लेबल डीएनए, FM4-64 लेबल झिल्ली नकल, तटस्थ लिपिड लेबल ब्याज की प्रोटीन, और महत्वपूर्ण रंगों में चिह्नित.

ove_content "> आणविक विश्लेषण ड्रोसोफिला रोम के अलग चरणों का उपयोग किया जा सकता है. पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए प्रोटीन, यह अनुभव से, विकास की एक विशेष चरण की, ब्याज की प्रोटीन का पालन करने की आवश्यकता है कि कितने रोम निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. चित्रा 5 क्रमिक रूप से एक विशेष प्रोटीन, Fascin निरीक्षण करने की जरूरत S10B रोम की संख्या निर्धारित करने के लिए एक केंद्रित प्रोटीन lysate को कमजोर करने का एक उदाहरण है. इस मामले में एक S10B कूप पश्चिमी सोख्ता द्वारा इस प्रोटीन का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है.

चित्रा 1
चित्रा 1. आरेख मध्य से देर से मंच ड्रोसोफिला fol के रूपात्मक अंतर illustrating ड्रोसोफिला के रोम और छवियों के सेलुलर संरचना का वर्णनlicles. एक S10A कूप. बीजी के सेलुलर संरचना चित्रण ए आरेख. गुंजाइश विदारक एक स्टीरियो का उपयोग कर लिया S10A-S14 ड्रोसोफिला रोम के प्रतिनिधि छवियाँ. ~ 650 somatically व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं (सफेद, रानी, ​​और सियान, एक से घिरे हैं जो 1 oocyte (लाल, ए) और 15 नर्स या समर्थन कोशिकाओं (पीला, ए),: ड्रोसोफिला कूप 16 germline व्युत्पन्न कोशिकाओं के होते हैं ). S10A में कूप की लंबाई में से एक आधा खिंचाव कूप कोशिकाओं (ए में मैजेंटा) द्वारा कवर कर रहे हैं जो नर्स कोशिकाओं (पीला वर्ग, बी), से बना है, और दूसरे आधे oocyte (लाल तारांकन से बना है , बी), जो मुख्य शरीर कूप कोशिकाओं को एक में (सफेद) द्वारा कवर किया जाता है. S10B पर, नर्स कोशिकाओं (पीला वर्ग, सी) और oocyte (लाल तारांकन, सी) प्रत्येक Le के आधे रचनाकूप के ngth, हालांकि कूप की कुल लंबाई अब एक S14 कूप (जी सी की तुलना) के बराबर है. S11 के दौरान नर्स कोशिकाओं (पीला वर्ग, डी) तेजी से एक actin / मायोसिन निर्भर प्रक्रिया में elongating oocyte (लाल तारांकन, डी) में अपने cytoplasmic सामग्री निचोड़ डंपिंग नर्स सेल करार दिया. S12 करके, oocyte (लाल तारांकन, ई) पूरी तरह से पूरा करने और केवल नर्स सेल अवशेष (, ई पीले ब्रैकेट) रहना नर्स सेल डंपिंग के रूप में है लम्बी गया है. नर्स सेल अवशेष S13 पर (पीले ब्रैकेट, एफ) पूरी कोशिका मृत्यु. S14 पृष्ठीय उपांग (सफेद तीर, जी). बी स्केल बार = 0.1 मिमी सहित oocyte (लाल तारांकन, जी), दैहिक कोशिकाओं, और eggshell, से बना है, जो पूरी तरह से परिपक्व कूप, का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 2 चित्रा 2. छवियाँ अंडाशय विच्छेदन और कूप अलगाव की एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं. ए विदारक मीडिया में मक्खी डूब और यह nondominant हाथ में, संदंश द्वारा आयोजित किया जाता है कि तो यह पूरबी. बी प्रमुख हाथ का उपयोग करना, पेट के पीछे से छल्ली हड़पने. सी. छल्ली बंद खींचो, अंडाशय (पीले तीर) को उजागर. पीछे की ओर पेट के पूर्वकाल से कार्य डी., धीरे अंडाशय (पीले तीर) को रिहा पेट दबाओ. ई. किसी भी शेष छल्ली से अंडाशय (पीले तीर) अलग (लाल arrowhead) और / या आंतरिक अंगों (सफेद तीर). एफ एक ताजा अच्छी तरह से युक्त विदारक मीडिया के लिए अलग अंडाशय स्थानांतरण. जी छेड़ो अलग अंडाशय, विदारक सुई का उपयोग, भारतीयों को बेनकाब करने के लिएvidual रोम (अलग हो अंडाशय (नीचे) को बरकरार अंडाशय (ऊपर) की तुलना करें. एक चाकू मारा S10B कूप, बाद के प्रयोगों. एच. चयन ब्याज की रूपात्मक चरणों (चरणों 10A के लिए नहीं किया जाना चाहिए कि एक कूप का एक उदाहरण के लिए व्हाइट Arrowhead अंक -14 (S10A-S14)) दिखाया.

चित्रा 3
चित्रा 3. इन विट्रो विकास assays के उदाहरण हैं. S10B के प्रतिशत के ए चार्ट संस्कृति में है कि पूर्ण विकास के रोम. 2 WT संस्कृति में गरीब विकास (68% विकासशील) का एक उदाहरण है, जबकि WT 1, जंगली प्रकार S10B रोम (96% विकास) की उम्मीद विकास का एक उदाहरण है. नियंत्रण मीडिया में जंगली प्रकार S10B रोम के विकास को 80% से नीचे है, तो आम तौर पर हम पूरे प्रयोग त्यागने होगा. बी 50 युक्त मीडिया में (dev.) के विकास S10B रोम के प्रतिशत के अनुपात का चार्ट. इस जंगली प्रकार मूल्य ~ 0.5 होनी चाहिए मतलब है, आईसी 50 ब्लॉकों के विकास से S10B के रोम का 50% है कि एकाग्रता है. दवा 2 दवा एकाग्रता (0.37). सीडी भी मजबूत होता है जब उसका एक उदाहरण है, जबकि ड्रग 1, उम्मीद जंगली प्रकार अनुपात (0.52) का एक उदाहरण है '. इन विट्रो विकास कुओं की छवियाँ. सीसी'. नियंत्रण इलाज. डीडी परख के अंत बिंदु पर रोम की. छवि '. एस्पिरिन परख. C'डी के शुरू में S10Bs की (~ 2 मिमी). सीडी. छवि इलाज'. कंट्रोल '(एस्पिरिन इलाज के रोम के बहुमत डी) डंपिंग नर्स सेल को पूरा करने में विफल है, जबकि S10B रोम संस्कृति (सी)' में S14s को विकसित इलाज किया. 50 युक्त मीडिया में (dev.) के विकास S10B रोम के प्रतिशत के अनुपात की आरक्षित चार्ट. इस pharmaco-बातचीत की तलाश में दो प्रयोगों का एक उदाहरण है. expt2 (लाल पट्टी) उत्परिवर्ती एस्पिरिन (0.16) के प्रभाव को बढ़ाता है, जबकि expt1 (नीली पट्टी) उत्परिवर्ती, एस्पिरिन (0.57) के लिए आईसी 50 के प्रभाव को बदल नहीं है.

चित्रा 4
चित्रा 4. पृथक S10B का उपयोग प्रदर्शित करने वाला उदाहरण रहते इमेजिंग के लिए रोम. वायुसेना. Utrophin से अलग एक S10B कूप का समय व्यतीत हो Z-ढेर से 3 स्लाइस की अधिकतम अनुमानों :: GFP ट्रांसजेनिक मक्खियों (sqh-Utrophin :: GFP). A'एफ 'व्यक्त. Magnified insets से एक भी नर्स सेल उजागर ए एफ वायुसेना '. एफ actin (Utrophin :: GFP), सफेद. ए, ए'. समय (टी) = 0 मिनट. बी, बी '. टी = 20 मिनट. सी, सी' = 40 मिनट. टी. = 100 मिनट डी, डी '. टी = 60 मिनट. ई, ई'. टी = 80 मिनट. एफ, एफ '. टी. प्रारंभिक समय बिंदु पर, कम actin filaments नर्स कोशिका झिल्ली (ए, ए ') से अंदर की ओर का विस्तार देखा जा सकता है. वे ('डी, डी) पूरी तरह से लम्बी हैं जब तक इन actin filaments (' एक, एक की तुलना में 'ई.पू.) जल्दी समय अंक भर बढ़ाना. बाद में समय अंक में, ये पूरी तरह से लम्बी actin filaments तो छोटा और (एफई ') डंपिंग नर्स सेल भर गाढ़ा ए स्केल बार = 50 माइक्रोन. ए'. स्केल बार = 10 माइक्रोन.

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.. विकासात्मक अध्ययन, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा एक विशेष प्रोटीन की जांच करने की जरूरत रोम की संख्या निर्धारित करने के लिए कैसे की चित्रा 5 चित्रण इस S10B रोम (1:20, एस.एन. 7C, कूली, एल में Fascin अभिव्यक्ति को देखकर पश्चिमी धब्बा है हाइब्रिडोमा बैंक (DSHB), NICHD के तत्वावधान में विकसित और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आइए, 52,242) द्वारा बनाए रखा. शीर्ष भर में संख्या लेन प्रति लोड S10B रोम की अनुमानित संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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Discussion

ड्रोसोफिला कूप शब्द के भागों और आणविक विश्लेषण दोनों के लिए आदर्श बना रही है, कोशिका प्रकार के केवल एक छोटी संख्या से बना है. इसके अलावा, के कारण अंडाशय की संरचना करने के लिए, यह एक आम विदारक गुंजाइश है और न्यूनतम प्रशिक्षण के साथ कूप विकास के विशिष्ट चरणों की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. प्रत्येक चरण में एक छोटी अस्थायी खिड़की का प्रतिनिधित्व के रूप में, चरण अलगाव कि चरण के दौरान होने वाली विकास की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, हम S10B, S12, और S14 18 के दौरान होने वाली जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए मध्य से देर से मंच कूप अलगाव का इस्तेमाल किया है. इस विश्लेषण पहले से uncharacterized जीनों के एक नंबर कूप विकास में योगदान करने की संभावना है और, विशेष रूप से, खोल गठन में हैं पता चलता है.

स्टेज अलगाव रहते इमेजिंग के माध्यम से रूपात्मक घटनाओं में नाटकीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. ऐसे इमेजिंग अल पर प्रदर्शन किया जा सकता है ड्रोसोफिला कूप विकास के एल चरणों. Germarium 13, कूप बढ़ाव 19, और चरण 9 11,12,14: इस काम का ध्यान S10B-14 है, पाठकों को पहले चरण के रहते इमेजिंग के लिए निम्न आलेखों को भेज रहे हैं. इन अध्ययनों में उपयोग संस्कृति की स्थिति इस काम में चर्चा की उन लोगों से अलग हैं. विशेष रूप से, इन अध्ययनों कुछ मामलों में, trehalose के आगे इसके अलावा, methoprene, 20 hydroxyecdysone, और, चर FBS (2.5-15%) के स्तर के साथ ही इंसुलिन 11-13,19 के अलावा के साथ श्नाइडर कीट मीडिया का इस्तेमाल किया और एडेनोसाइन 14 deamidase. यह इन लाइव इमेजिंग अध्ययन में काफी विकास के इन पहले चरण के दौरान होने वाली घटनाओं के बारे में हमारी समझ को उन्नत किया है कि बाहर बात करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, इन प्रारंभिक चरण के रोम कूप विकास, S14 के अंतिम चरण के लिए सभी तरह से प्रगति नहीं कर सकता. इसके विपरीत, S10B -13 संस्कृति में S14 का विकास होगा.

S10B-S14 कई रूपात्मक प्रक्रियाओं के दौरान> "ove_content कि लाइव इमेजिंग द्वारा अध्ययन किया जा सकता होते हैं. उदाहरण के लिए, लाइव इमेजिंग डंपिंग नर्स सेल की प्रक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, नर्स कोशिकाओं oocyte में उनके cytoplasmic सामग्री निचोड़ प्रक्रिया है जिसके द्वारा यह embryogenesis को पूरा करने की जरूरत है. नर्स सेल डंपिंग (4 चित्र देखें) रहते इमेजिंग की. निरंतर उपयोग फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग कर प्रेषित प्रकाश 7 या confocal इमेजिंग द्वारा उपयोग कर समय चूक इमेजिंग द्वारा मनाया जा सकता है सब कुछ के साथ प्रदान करने की उम्मीद है बाद के चरणों की नर्स सेल डंपिंग के लिए आवश्यक cytoskeletal गतिशीलता में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. रहते इमेजिंग भी पृष्ठीय उपांग primordia प्रवास और tubulogenesis 10 के बारे में हमारी समझ को विकसित किया है.

S10B-S13 रोम के इन विट्रो विकास में होते प्रक्रियाओं पर pharmacologic अभिकर्मकों और आनुवंशिक जोड़तोड़ दोनों के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैइस समय के दौरान की अंगूठी. हम 7 डंपिंग नर्स सेल को विनियमित करने में prostaglandins की भूमिका की स्थापना के लिए S10B रोम के इन विट्रो विकास में इस्तेमाल किया है. इसके बाद हम एक pharmacologic बातचीत स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस परख का उपयोग किया गया है, एक actin नियामक की एक प्रति के नुकसान को बढ़ाता है या नर्स सेल prostaglandins के नुकसान की वजह से दोष डंपिंग को दबा अगर विशेष रूप से, हम परीक्षण किया गया है. यह स्क्रीन ख्यात बहाव के लक्ष्यों (9 और Spracklen, मेयर, और तुरही की आवाज़, अप्रकाशित डेटा) के एक नंबर से पता चला है. परख भी ऐसी (9 देख इस का एक उदाहरण के लिए) दो विभिन्न कारकों के कारण heterozygosity करने, डंपिंग नर्स सेल में एक ब्लॉक के रूप में विकास संबंधी दोषों का आकलन करने से आनुवंशिक बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

एक काफी सरल प्रक्रिया के मध्य से देर चरण ड्रोसोफिला के रोम है अलग है, जबकि अधिकतम सफलता के लिए महत्वपूर्ण कारकों में से एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, मक्खियों की तैयारी हैबहुत ही महत्वपूर्ण. यह शीशी प्रति मक्खियों की संख्या, पुरुषों (2:1 अनुपात आदर्श है) करने के लिए महिलाओं का अनुपात यानी, संभव के रूप में इसी तरह की स्थिति में मक्खियों के विभिन्न जीनोटाइप को बनाए रखने, और लगातार ताजा, गीला खमीर प्रदान करने के लिए सबसे अच्छा है. खिला (गीला खमीर) और विच्छेदन समय विकास के विभिन्न चरणों के प्रसार बदल जाएगा. हम मक्खियों लगातार सुबह में खिलाया जाता है जब अधिक S12s दोपहर में मौजूद हैं, जबकि अधिक S10Bs, सुबह में अलग किया जा सकता है कि मिल गया है. एक दूसरा महत्वपूर्ण कारक मीडिया है. इन विट्रो विकास और रहते इमेजिंग के लिए यह ताजा IVEM मीडिया तैयार करने के लिए आवश्यक है. इसके अतिरिक्त, मीडिया actin और सूक्ष्मनलिकाएं, दोनों के रूप में ठंड मीडिया cytoskeletons बदल जाएगा कमरे के तापमान को आना चाहिए, और इसलिए, आगे के विकास को बाधित. यह दूर मलबे से रोम रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है. कभी कभी, विच्छेदन के दौरान, पेट अंडाशय के साथ बाहर आ जाएगा. हमने पाया है कि पेट उठी है अगरऔर रोम दूषित मीडिया में रखा जाता है, रोम संस्कृति में विकसित करने की संभावना नहीं है. रोम संस्कृति में विकसित करने के लिए जारी रखते हैं, यह इन विट्रो विकास या आणविक विश्लेषण के साथ या तो आगे बढ़ने से पहले विच्छेदन के बाद मचान पुनः सत्यापित करने के लिए आवश्यक है. अंत में, यह प्रयोगों के लिए उचित नियंत्रण होना बहुत जरूरी है. इन विट्रो विकास के लिए, यह मीडिया सामान्य विकास (80-100% पूर्ण नर्स सेल डंपिंग) के लिए अनुमति देता है कि परीक्षण करने के लिए जंगली प्रकार के रोम का उपयोग करने के लिए, और (3 चित्र देखें) के रूप में उम्मीद pharmacologic अभिकर्मकों कार्य है कि परीक्षण करने के लिए आवश्यक है.

अंत में, मध्य से देर से मंच ड्रोसोफिला रोम के अलगाव प्रयोगात्मक तकनीकों की एक किस्म के माध्यम से विकास की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं.

विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका:

अभिकर्मक के नाम कंपनी बिल्लीalogue संख्या टिप्पणियां (वैकल्पिक)
सक्रिय सूखी खमीर Genesee वैज्ञानिक 62-103 सक्रिय सूखी खमीर का कोई स्रोत ठीक है
अनुग्रह कीट मीडिया Lonza 04-457F
गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम अटलांटा बायोलॉजिकल S11050H किसी भी गर्मी निष्क्रिय FBS काम करना चाहिए
10x पेन / Strep Gibco / Invitrogen 15140-122
पिन vises और सुई टेड पेला, Inc 13561-10
स्पॉट प्लेट, नौ खैर कोर्निंग 7220-85
# 5 Dumont संदंश ललित विज्ञान उपकरण 11252-20
24 बहु अच्छी तरह प्लेटें बेक्टन डिकिन्सन 35 3226 किसी भी 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान काम करना चाहिए
नीचे व्यंजन coverslip (35 मिमी) MatTek निगम P35G-1.0-14-C Coverslip मोटाई माइक्रोस्कोप / उद्देश्य में इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर करेगा
कांच pipettes कोर्निंग 7095B-5X (रोम स्थानांतरित करने के लिए)
7095B-9 (खींच लिया pipettes उत्पादन के लिए)
नमूना मूसल (1.5 μl; RNase / DNase मुक्त) अनुसंधान उत्पाद अंतर्राष्ट्रीय 199,228 1.5 μl microfuge ट्यूबों फिट बैठता है कि किसी भी प्लास्टिक मूसल इस्तेमाल किया जा सकता है
Trizol Invitrogen 15596-018

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम अभिकर्मकों के लिए थॉमस Lecuit (sqh-Utrophin :: GFP लाइन), ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र, और विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम आगे पांडुलिपि की उपयोगी चर्चा और आलोचनाओं के लिए तुरही बजाना लैब के सभी सदस्यों को धन्यवाद. धन से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन एमसीबी-1158527, और शारीरिक रचना और सेल बायोलॉजी विभाग की ओर से शुरू हुआ धन, आयोवा विश्वविद्यालय के इस काम का समर्थन किया. भेषज विज्ञान T32GM067795 में स्वास्थ्य predoctoral प्रशिक्षण अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों AJS का समर्थन किया. डाटा भंडारण समर्थन अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र और अनुदान UL1RR024979 के माध्यम से translational विज्ञान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा समर्थित सीटीएसए के माध्यम से वित्त पोषित है जो आईसीटी, द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media Lonza 04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11050H Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep Gibco/Invitrogen 15140-122
Pin Vises and Needles Ted Pella, Inc. 13561-10
Spot Plate, Nine Well Corning 7220-85
#5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
24 multi-well plates Becton Dickinson 35 3226 Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm) MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes Corning 7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes - long Corning 7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) Research Products International 199228 Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol Invitrogen 15596-018

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References

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Spracklen, A. J., Tootle, T. L. The… More

Spracklen, A. J., Tootle, T. L. The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation. J. Vis. Exp. (82), e50493, doi:10.3791/50493 (2013).

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