Summary
半ばから後半ショウジョウバエ濾胞の段階特異的分離は、様々な目的に有用である。このような卵胞は、in vitroの開発アッセイとライブイメージングと結合される遺伝的および/ または薬理学的な操作を可能にする、文化の中で開発しています。さらに、毛包には、mRNAおよびタンパク質を単離するなどの分子的研究のために使用することができる。
Abstract
ショウジョウバエの卵形成または卵胞の発達が広く複雑な発達および細胞生物学的過程の理解を進めるために使用されている。この方法は紙は半ばから後期の卵胞（ステージ10B-14）を単離及び発達時間のタイトな窓の間に発生する分子および形態学的事象に新たな洞察を提供するために、それらを利用する方法について説明します。単離された毛包は、in vitroアッセイを開発、ライブイメージング、mRNA発現解析およびタンパク質のウェスタンブロット分析を含む実験技術、様々に使用することができる。卵胞期10B（S10B）で以降は文化の中で、開発を完了し、これは1、開発の特定の期間中に発生したプロセスに対するそのような操作の影響を定義するためのin vitro開発に遺伝的または薬理学的摂動を組み合わせることができます。これらの卵胞は文化の中で発展されるためさらに、それらは、理想的にライブイメージング研究に適しています、多くの場合、形態学的事象を仲介する新しいメカニズムを明らかにした。単離された毛包はまた、分子分析のために使用することができる。例えば、遺伝子の摂動から生じる遺伝子発現の変化は、特定の発達のウィンドウのために定義することができる。さらに、タンパク質レベル、安定性、および/または卵胞発育の特定の段階の間に翻訳後修飾の状態は、ウェスタンブロット解析を介して検査することができる。このように、 ショウジョウバエ包の段階特異的分離は、開発と形態形成の広く保存プロセスに豊富な情報源を提供しています。
Introduction
各ショウジョウバエ卵巣は〜16 ovarioles、または連続して卵室や卵胞を成熟の鎖から構成されている。各卵胞が単一の卵母細胞、15生殖系列に由来する看護師やサポート細胞、および濾胞細胞（ 図1A）と呼ばれる〜650体細胞で構成されている。 ショウジョウバエの卵形成は、開発1の14形態学的に定義されている段階に分けられる。卵胞の各発達段階は、それが比較的容易段階特異卵胞の実質的な数を単離すること、単一のフライ内で何度も観察される。
卵形成（ステージ10B-14）の半ばから後半のステージは、ステージの分離（ 図1）に特に適している。ステージ10B（S10B）では、毛包が完全に伸長される（ すなわち、その長さは、ステージ14のそれと等しい（S14）卵胞、 図1と図2Hを参照）、卵胞の半分の長さは、ナース細胞から構成されている他の半分は、卵母細胞（ 図1C）であり、一方。この段階では、看護師の細胞は、皮質アクチンを強化し、アクチンフィラメント2の並列バンドルを生成し、劇的なアクチンリモデリングを受ける。同時に、毛包細胞の集団は、求心性細胞と呼ばれる、背側付属物を形成するために、移行を受けるために指定なっナース細胞および卵母細胞および卵胞セルの2つの背側基との間で移行する、胚、3管状の呼吸装置。それは胚発生（ 図1D）を完了するために必要な要因と卵母細胞を提供し、看護師のセルはダンプと呼ばれるプロセスに卵母細胞にそれらの細胞質の内容を絞るナース細胞その後契約（S11）。ナース細胞は、次いで、細胞死（S12-S13）4を受け、卵胞細胞が卵殻5（ 図1E-G）を分泌し、パターン。このように、卵形成の終わりには、重要な発達ANと豊富であるD形態形成のプロセス。
単離された半ばから後期の卵胞（S10B-S14）は、分子分析など、さまざまな目的に使用することができる。例えば、段階的な卵胞からのmRNAは、RT-PCR、マイクロアレイのために単離することができ、又はRNA-seqの分析。これは1が存在する少数の細胞型と、短い発達ウィンドウ内の遺伝子発現を調べ、遺伝子発現を薬理学的または遺伝のどちらかの摂動によってどのように変化するかを決定することができます。ステージの分離もウェスタンブロッティングによってタンパク質を調べるために使用することができます。それは一つの特定の段階での突然変異体対野生型タンパク質の発現レベルを定量することを可能にするので、そのような分析は重要である。一つは免疫蛍光は、同様の結果を達成するために分析を使用できるが、蛍光の定量化は、全ての画素が検出6の線形範囲内である厳密な要件によりロバストである。さらに、ウェスタンブロット分析は、他の情報を提供することができるようなSタンパク質が翻訳後修飾されているか、特定のスプライスアイソフォームから発現されている場合。単離されたステージはまた、細胞下分画または免疫沈降を含むさらなるタンパク質精製のために使用することができる。
段階特異的な卵胞の分離はまた、 インビトロのアッセイの開発7および8ライブイメージングのために使用することができる。孤立S10B-S13包（下記参照）の単純な培養培地中で、S14に開発していきます。これは、S10A包が看護セルは、この原稿で説明した培養条件を使用してダンプを経て進行しないことに注意することは重要である。我々はリードアウト7,9として看護師電池投棄や開発を使用することにより、アクチンリモデリングを調節する上で、両方の薬理学的および遺伝学的に、プロスタグランジンの役割を定義するためにS10B のin vitroアッセイの開発を使用している。同様に、発達の後期段階はまた、薬理学的治療または遺伝子人間の効果を決定するために、単離することができるこのような求心細胞移動、背側付属器の移行/形成10、看護師の細胞死のような特定のプロセスに関するipulations。このようなアッセイは、支配的な相互作用スクリーニングまたはアッセイを実行するために使用することができ、例えば、単独でPXTにおける突然変異のためにヘテロ接合性またはファシンは S10B インビトロ発達に影響を及ぼさないが、二重ヘテロ接合展示看護欠陥をダンプ細胞および現像9のブロックからの卵胞。
S10B-13培養で開発することができるので、さらに、この時間の間に発生するすべてのプロセスは、ライブイメージングによって観察することができる。そのような画像は、透過光（一方は形態の総変化にのみ関心がある場合）またはライブ画像形成色素で染色し、蛍光プローブ又は卵胞を発現するトランスジェニックハエを用いて共焦点顕微鏡とを使用して簡単に行うことができる。ライブイメージングは、実質的に発達過程の理解を進めるために使用されている。実際、ライブイマジン後期包のGは、背側付属器の移行、細管形成10の例の知識を拡大してきました。私たちは、看護師細胞中のアクチン動態を含む追加の後期過程のライブイメージング、ダンピングは、これらの発生事象に新たな洞察を提供することを期待しています。それは、S10Aと卵胞の発達の初期段階は、文化の中で、S14へと発展していきませんが、開発のそれらのステージ中に発生するイベントのライブイメージング（詳細のための議論を参照して、代替の培養条件を11から14を使用して可能であることに注意することが重要です情報）。
ここでは、in vitroでの開発やライブ映像、または分子解析（mRNAおよびタンパク質の分離）のいずれかのために後期包を単離するための詳細なプロトコルを提供する。
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Protocol
1。前段の分離にショウジョウバエの準備
- 蒸留水90ミリリットルとドライイーストの50グラムを組み合わせることにより、ウェット酵母ペーストを作る。組み合わせるためのへらで混ぜる。混合物は一貫性を評価する前に、約30分間放置してみましょう。一貫性は、ハエのバイアルの側面に付着するのに十分なだけの厚さであるが、側面を下に実行しないでください。所望のコンシステンシーを達成するためには、さらに10 mlの水または乾燥酵母を少量まで追加することが必要であり得る。 4℃で覆われた容器に保管してください記憶された酵母は、約1〜2週間以内に使用することができる。
- <希望の遺伝子型の24時間古い成虫ハエ（男女とも）を収集し、フライフードプラスバイアルの側面に塗抹湿った酵母ペーストをバイアルに入れます。ハエが維持される温度は、実験に依存して変化する。ルーチンの実験のために、ハエは室温で維持される。一方、遺伝子がある、実験UAS/GAL4系15は 、必要に応じて、25°C以上でハエを維持することが必要な場合があり使用して過剰発現されている。
- 2日間、毎日酵母ペーストの新鮮なスミアとハエを提供する。 NOTE：卵胞発育がしっかり雌ハエの栄養状態によって調節されるように、解剖の前に少なくとも36時間、栄養豊富な酵母ペーストでフライを提供することが不可欠である。
2。隔離半ばから後半ショウジョウバエ卵胞の段階的
- メディアは、室温（約30分）に来ることができます。段階的な卵胞がインビトロ現像アッセイに使用する予定の場合は、新たにIVEM媒体（グレース昆虫培地、10％熱不活性化ウシ胎児血清、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン）を調製。上演包がmRNAまたはタンパク質の単離に使用する予定の場合はグレース昆虫やIVEMメディアのいずれかを使用します。重要：メディア温度が非常に重要です。メディアが冷えている場合は、変更されますアクチンと微小管細胞骨格とブロックの開発の両方。
- CO 2ガスを注入してyeastedバイアル内のハエを麻酔して、CO 2の下でフライパッドに3-5女性のハエを置く。重要：無菌性や死を引き起こす可能性があり、CO 2に長時間さらさようにその場パッド上の10分の時間帯で解剖することができるよりも多くの女性を放置しないでください。
- （黒いプレキシガラスのピースがうまく機能）メディアと9スポットプレートの1つのウェルを埋めると暗い面の上に置きます。井戸の底に解剖スコープを当てる。
- ＃5を使用して、デュモン鉗子は、（これは最高の利き手を使用して行われます）片手で独身女性を拾う。それは翼、脚、腹部への遷移胸部で女性をピックアップして、多くの場合、最も簡単です。よく満たされたメディアで女性を沈める。必要に応じて顕微鏡の焦点を調整します。
- 非優位手で開催された鉗子の第二のペアを使用して、腹部の前端にメスをつかむ後方端部は、利き手（ 図2A）に向かって配置されるように。メディアに沈めフライを保つようにしてください。
- 利き手で、2番目に人気の後部色素沈着したとき、セグメントのキューティクルをつかんで離し腹部（ 図2B-C）の残りの部分からそれをリッピングする鉗子を使用しています。
- 卵巣が（図2D-E）を出てくるまで、利き手での鉗子を使用して、静かに腹部の前端を絞る。必要に応じて、2卵巣の間に鉗子を配置し、カーカスからそれらを引き出します。
- 新鮮な培地（図2F）で新しいウェルに卵巣を移動したり、キムワイプまたは紙タオルに死骸を取り除くのどちらか。卵胞がインビトロ開発のために単離されている場合、これは特に重要である。
- 卵巣の3-5ペアが分離されるまで繰り返します。注：各卵巣は〜16 ovariolesまたは連続して成熟卵胞の鎖から構成されている。各卵巣管筋鞘内に含まれる。
- ピン万力、それらに付属の針を使用して、静かにovarioles（ 図2G）との間に針を実行することで、卵巣を引き離す。これは時々だけでなく、個々の卵胞をリリースする予定です。
- 個々のovariolesと卵胞発育の容易に区別形態学的な段階になりました（ 図2Gは 、卵巣を離れてからかった）表示されるはずです。 図1および異なる段階を区別するために使用することができる形態学的差異について2Hを参照してください。そのままovarioles内にあり、まだ筋肉のシース内に含まれる卵胞を単離するために、前の卵胞の前で、すぐに関心のある毛包を次卵胞の後で卵巣管を横切る針を使用しています。これは筋肉の鞘を破壊すると離れて興味のある卵胞は今それを損傷することなく、隣接する卵胞から離れて切断することができる。 個々の段階が分離されているように、新鮮な培地で新しいウェルに、ガラスピペットを使用して、関心のある毛包を移動します。 in vitroでの開発のための卵胞を分離する場合に特に重要です。注：これはよく全体に関心のある毛包を再配布から気泡を防止するために、メディアに入る前に、ピペット球を絞ることが重要です。卵胞はガラスピペットに付着している場合に加え、ピペットを数回上下にBSA溶液をピペッティングし、解剖培地で洗浄することによって、3％ウシ血清アルブミン（BSA）でプレコートすることができる。
- 十分な卵胞が単離されたら、その後の実験を進める。
S10B包の3。 インビトロ開発
- IVEMメディアステージ単離プロトコール（ステップ2）を使用して、S10B包を隔離する。卵胞が急速に離れて破片から移動していることを確認してください。これらの卵胞が成熟していきますように、それはIMPOですS10Bsは30〜60分のために収集した後、選択した成熟培地中に配置されていることをrtant。注：S10BはS10A包がIVEM培養培地中で成熟していないよう慎重に、（1Bと比較した図1C）S10A包とは区別する必要がある。 S10A及びS10B包の両方で、長さの半分を、ナース細胞から構成され、他の半分は卵母細胞であるが、S10Bにおいて卵胞の長さはS14包のと同じである。
- ガラスピペットを用いて、24ウェル組織培養プレートのウェルに30〜S10B包を移動させる。注：転送中の卵胞がすべてS10Bで、S11に成熟していないことを確認してください。
- ウェルあたり成熟メディアの1μL、 すなわち IVEMメディアプラス理学的試薬を準備します。
- プルガラスピペットを使用すると、*、可能な限り十分に（ステップ3.2）から、できるだけ多くのメディアを削除し、すぐに選択の成熟メディアを追加。注：プルガラスPIPを使用することが不可欠である段階的な卵胞としてディスケットを簡単にピペットマンでガラスピペットまたはピペットチップのいずれかで、最大撮影することができます。
*プルピペットを作成するには：1）ガラスが軟化し始めるちょうどまで、ブンゼンバーナーの炎で長い、ガラスピペットの薄い部分を加熱し、2）すぐにフレームの外にピペットを移動し、ピペットを描画するために水平に引っ張る清澄管; 3）細かい点を生成するために分割します。注意：ガラスの破片が飛んで可能性がある目の保護を使用してください。 - 実験が必要と繰り返して、できるだけ多くのウェルについて3.1から3.4を繰り返します。
- 卵胞が> 10時間開発し、解剖顕微鏡下で発達の進行を獲得することができます。注：実験は通常、卵胞が発達するのに十分な時間を確保するために、次の日採点する。 S10Bが約5時間である、S11が約30分で、S12が〜2時間であり、S13が室温で25℃、1と発展を持続時間は約1時間である少し時間がかかります。 S10B包のために記載したのと同様の実験をすることができるS11-S13包を用いて行った。
4。ライブイメージングのための段階の分離
- すぐに離れ破片から卵胞を移動IVEM媒体にステージ単離プロトコール（ステップ2）を用いて、選択した蛍光マーカーを発現する後期卵胞（S10B-14）を単離する。
- 新しいメディアに関心のある毛包を移動し、カバーガラス底ペトリ皿にガラスピペットで移す。それはカバースリップ下の領域にバブルアップが、こぼれないようにメディアを追加するように注意してください。
- より長い時間経過映画のために、ペトリ皿の内側縁部に、水で湿らせたキムワイプ巻き上げを加えることによってペトリ皿内の湿度を維持することが必要な場合がある。上部の蓋を置きます。
- 倒立顕微鏡の画像。詳細な解像度は、共焦点顕微鏡が必要になります。これは、撮像、照明の強さ、および撮像の長さの周波数をバランスさせる必要があり、これは、各々独立してlのために解決される必要がありますabelingツールや発達過程。
5。 mRNAの準備のための段階の分離
- グレースやIVEMメディアのいずれかで、ステージ単離プロトコール（ステップ2）を使用して、個々の段階の卵胞を分離します。
- ガラスピペットを使用して、メディアを含む新しいウェルに関心のある個々のステージを移動させ、それは、一度に複数のステージを回収することができる。
- 1時間の下で収集時間を保つ。 1.5mlマイクロチューブに、ガラスピペットを使用して、卵胞を移動します。
- 卵胞のすべてをペレットにしたミニ微量チューブを軽くスピン。引っ張られたガラスピペットを用いて（ステップ3.4参照）を慎重にすべてのメディアを削除します。注：フルサイズのマイクロを使用している場合は、低速での卵胞をスピンダウン。
- トリゾールの100μl加え、プラスチック乳棒を用いて約20秒間、手で挽く。微量フルスピードでスピンダウンし、任意のペレット化Dを乱さないように注意しながら、新しい1.5mlマイクロチューブにトリゾールを移動ebris。 -80℃で保存
- 十分な卵胞が実験のために得られるまで繰り返して5.1から5.5を繰り返します。日常、〜75 S10B、〜75、S12、およびS14〜100の卵胞は、RNAの〜10μgのをもたらす。
- サンプルを氷上で解凍する。 1マイクロチューブに、必要に応じて、サンプルを結合し、800μLまでトリゾール容積を。製造業者の指示通りにRNAの単離を進める。重要：RNaseを含まないDNA分解酵素で単離されたRNAを扱うDNA分解酵素を忘れないでください。
6。ウェスタンブロッティングのための段階の分離
- 100℃に加熱ブロックを予熱
- グレースやIVEMメディアのいずれかで、ステージ単離プロトコール（ステップ2）を使用して、個々の段階の卵胞を分離します。注：それは経験的に、それぞれ特定のタンパク質を観察するために必要とされているどのように多くの特定の段階包の決定する必要がある。高度に発現されたタンパク質については1-3 S10B包/ウェルは、ウェスタンブロットに強いシグナルを参照するのに十分である。しかし、それは確認することが重要です代表的なサンプルは、複数の雌から卵胞を取る。したがって、特定の段階の15〜20は、通常、卵胞収集される。
- 1.5mlマイクロチューブに、ガラスピペットを使用して、卵胞を移動します。 （ステップ5.4参照）卵胞をペレットにしたミニ微量で簡単にスピン。慎重に引っ張っガラスピペットを使用してメディアをすべて削除する（ステップ3.4を参照）、1×50μlのPBSと2Xレムリ緩衝液50μlを加える。
- プラスチック乳棒で〜20秒間手で挽く。注：プラスチック乳棒を洗浄によって西部のサンプルを粉砕して、それらをオートクレーブに再利用することができます。
- ヒートブロック中で10分間サンプルを沸騰させる。
- 微量での15秒間フルスピードで氷とスピンで簡単に冷やす。すぐに-20℃でのSDS-PAGEゲルまたはストアにロードのどちらか注：サンプルが保存されている場合は、ゲルにロードする前にサンプルを再沸騰することを忘れないでください。
- 標準プロトコルに従ってウェスタンブロット解析を行う。
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Representative Results
ショウジョウバエの卵胞発育の特定の段階を単離する場合、それは正確に異なる形態学的段階を区別することができることが不可欠である。ナース細胞と卵母細胞は、これらの各段階で卵胞の長さの半分を占めるので、これは（1Cと比較した図1B）、S10AおよびS10Bのためやや困難である。 S10B包が完全に細長い、S14の包（1Gと比べて図1C）と長さがこのように等しいしかし、S10A包は、S10B包より長さが短い。また、求心包細胞と呼ばれる卵母細胞の上毛包や体細胞のサブセットは、ナース細胞及びS10Bの卵母細胞の間での移行を開始します。 S11でナース細胞契約は、卵母細胞にそれらの細胞質の内容を絞るように〜5時間かかりますS10B、中、看護師の細胞は、動的アクチンリモデリングを受ける。従ってS11において、看護師セル領域が有する卵母細胞（ 図1D）を拡大しているが大幅に減少した。 S12では、ナース細胞が死を起こす、より不透明な外観（ 図1E）を取るために始め、S12包内興味深いことに、文化の中で、看護師の細胞残骸カール背（ 図3C'-D 'でS12のを参照してください）。 S13の間に細胞死が完了しているように、看護師セル領域は透明であり、背側付属物の形成（ 図1F）が発生している。 S14によってのみ卵母細胞と卵胞細胞が残り、背側付属器の形成（ 図1G）が完了した。
インビトロ現像アッセイ（ 図3）ダンピングS10B開発や看護師細胞上の種々の薬理学的治療および遺伝子変異の影響を評価するために使用することができる。培養中S10Bsの開発は、しかし、多くの要因が悪い実験結果につながることが、ロバストである。 図3Aにおいて、成功および失敗した実験の両方からの実験データが提供される。成功した実験は、コントロール培地における野生型包の80から100パーセントが完了した看護師電池ダンプとS12-14への進行ものである（ 図3A、重量1）。時折、野生型のコントロールは卵胞未満の80％が（ 図3A、重量2）を開発することを意味し、失敗します。 ） など S10Bの卵胞からS10Aを区別するための1）ができない（ 図1と図2を参照）、2）メディアの問題（温度、年齢、および/ または3）卵胞があった：この障害は含めて多くの問題が原因で発生することができあまりにも長い間破片にさらさ。
S10Bs のインビトロ開発は薬物療法と組み合わせて使用することができる。このような実験のためには、薬物のコントロール、薬物と野生型包の、すなわち治療は、全ての実験を用いて行われることが重要であるため、薬物の有効性および/ またはconcentratイオンが時間とともに変化することができます。薬理学的実験のため、コントロール培地に含まれるのと同じ薬物治療における現像卵胞の割合の比を分析することが便利であるが、これはわずかな遺伝的背景の差異を制御する。それは、薬物のIC 50濃度で処理することが有用であることが多いが、これは、開発をダンプし、さらに看護師のセルを受けてからブロックの野生型（YW）卵胞の50％を濃度である。したがって、野生型卵胞についての割合は、0.5（ 図3B、薬物1）であると予想される図3Bは 、薬物（アスピリン）が大き濃縮なることができる方法の例（薬物2;溶媒蒸発しやすいため）である。ブロック現像由来の野生型包の50％を超える。さらに、 インビトロでのアッセイの開発を説明するために、現像S10B包の2つのウェルの画像が提供される。 図3CおよびDは、冒頭のS10B包を示しているアスピリン治療卵胞の大半はいないが、コントロールまたはアスピリン治療中のアッセイ、（〜2 mM）のメディア。 図3C 'とD'は 、コントロールの大半は、S14に開発された卵胞をあしらったことを明らかにし、アッセイの終わりを示している完成した看護師電池投棄。
インビトロ現像アッセイはまた、特定の薬物に対してより敏感である遺伝的背景をスクリーニングするために使用することができる。 図3Eは、この2つの例が含まれている。逆に、第2の例では、遺伝的背景（expt2、赤いバー）がアスピリンの効果を高め、最初の例では、遺伝的背景（expt1、青いバーは）比が約0.5のままとして、アスピリンとの対話に失敗します。従って、 インビトロでのアッセイが開発後期卵形成中に発生するイベントの発生および形態学上の変異および薬理学的試薬の影響を定義するために使用することができ、加えて、アッセイ （9参照）の薬理学的および遺伝的相互作用の両方を評価するために使用することができる。
ステージの分離はまた、発達過程のライブイメージングのために使用することができる。 図4ユートロフィン-GFP、緑色蛍光タンパク質に融合したヒトユートロフィンからアクチン結合ドメインを発現S10B包のタイムラプスムービーの一例である。このイメージングツールを用いて、アクチン束形成および縮合を可視化することができる。多くのツールは、タンパク質トラップトランスジェニック系統16,17を含め、ライブイメージングのために利用できる、蛍光駆動UASはオルガネラマーカータグ付けされた（ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、等 。）、蛍光駆動UASは細胞骨格マーカー（アクチンとアクチン結合タンパク質、微小管をタグ付け微小管）結合タンパク質、任意の発現するトランスジェニック系統は、蛍光（ナイルレッド）がエドゥのラベルは、DNA、FM4-64のラベルの膜を複製、中性脂質を標識する目的のタンパク質、および重要な染料タグ付き。
ove_content ">分子分析は、 ショウジョウバエ包の単離されたステージを用いて行うことができる。ウェスタンブロッティングによるタンパク質分析のためには、経験的に、発達の特定の段階で、目的のタンパク質を観察するために必要とされるどのように多くの卵胞決定する必要がある。 図5順次、特定のタンパク質、ファシンを観察するために必要S10B包の数を決定するために濃縮されたタンパク質溶解物を希釈する方法の例であり、この場合、一つS10B包をウェスタンブロッティングによってこのタンパク質を観察するのに十分である。
図1。ダイアグラム半ばから後期ショウジョウバエ FOLの形態学的差異を示すショウジョウバエ濾胞や画像の細胞組成を記述するS10A包の細胞組成を描いlicles。A.図。BG。スコープを解剖ステレオを使用して撮影S10A-S14 ショウジョウバエ包の代表的な画像。 ショウジョウバエの卵胞が16生殖細胞由来の細胞で構成されています：1卵母細胞（赤、A）と〜650により体細胞由来の上皮細胞（白、マゼンタ、シアン、包囲されている15看護師やサポート細胞（黄色、A）を 、 ）。 S10Aでは、毛包の長さの半分を延伸包細胞（Aマゼンタ）によって覆われているナース細胞（黄色ブラケット、B）から構成され、他の半分は、卵母細胞（赤いアスタリスクで構成されている、B）は 、本体包細胞（A、白色）によって覆われている。 S10Bにおいて、ナース細胞（黄色ブラケット、C）および卵母細胞（赤いアスタリスク、C）は、各ルの半分を構成する卵胞のngthしかし卵胞の全長は現在、S14包（GにCと比較 ）と同等である。 S11の中、看護師細胞（黄色ブラケット、D）は 、急速に伸長し卵母細胞にそれらの細胞質の内容を絞る（赤いアスタリスク、D）のアクチン/ミオシン依存性プロセスにおいては、ダンピング看護セルと呼ばれる。 S12によって、卵母細胞（赤のアスタリスク、E）は 、完全に看護セルがダンピングとして細長くており、完全かつ唯一の看護師細胞レムナント（黄色ブラケット、E）のままです。ナース細胞レムナント（黄色ブラケット、F）S13の完全な細胞死。 S14が背付属（白矢印、G）のB.スケールバー= 0.1ミリメートルなど、卵母細胞（赤のアスタリスク、G）、体細胞、および卵殻、で構成されて完全に成熟した卵胞を表します。
図2。画像は卵巣切開および卵胞の分離の概要を提供する。 A.解剖メディアフライ水没し、それが非優位手に、鉗子によって、保持されるようにそれを向けます。B.利き手を用いて、腹部の後部でキューティクルをつかむ。 では 、キューティクルをやってのける卵巣（黄色の矢印）を露出させる。後部に向かって腹部の前方から作業Dで 、優しく卵巣（黄色の矢印）を放出腹部を絞る。E.は残りのキューティクルから卵巣（黄色の矢印）を分離（赤矢印）および/ または内臓（白矢印）。F.よく解剖メディアを含む新鮮に孤立した卵巣を転送します。G.いじめる卵巣離れて、、個を露出するために、解剖針を使用々の包（分離卵巣（下）にそのまま卵巣（上）を比較。刺さS10B包、その後の実験。H.セ レクト関心の形態学的な段階（ステージ10Aには使用しないでください卵胞の例に白い矢印のポイント-14（S10A-S14）を参照）。
図3。 インビトロ開発アッセイの例。文化の中で完全な開発S10B包の割合のA.チャート 。重量1 2 WTは文化の中で貧しい発展（68％の現像）の一例であるが、野生型S10B包（96％が途上）の予想される発展の一例です。対照培地における野生型S10B包の発育が80％未満である場合、我々は、典型的には、実験全体を廃棄するであろう。B.を 50を含む培地中で（dev.）を開発S10B包の割合の比のグラフ。 IC 50は、開発からのブロックS10B包の50％をその濃度であり、これは、野生型の値は〜0.5でなければならないことを意味します。薬物2は薬物濃度は（0.37）が強すぎる場合の動作例である間、薬物1は、予想される野生型の比（0.52）の一例です。 のCD」。in vitroでの開発井の画像。C-C 'コントロール。DDは治療'。アスピリン（〜2 mM）を処理した。CD。アッセイの開始時S10Bsの画像は。C'-D'アッセイの終点で卵胞のイメージ。コントロールは、「（アスピリン治療卵胞の大多数はD）をダンプ看護セルを完成することができないながら、S10B包が文化（C） 'にS14sに開発し処理した。
図4。ライブイメージングのための孤立S10B包の使用を示す例。 AF。ユートロフィンから分離S10B包のタイムラプスZスタックから3スライスの最大予測:: GFPトランスジェニックハエ（SQH-ユートロフィン:: GFP）。A '〜F'を表す。拡大挿入図から、単一の看護師のセルをハイライト表示A- F. AF 'F-アクチン（ユートロフィン:: GFP）、白A、A'。時間（t）= 0分B、B 'のt = 20分C、C' = 40 分のt。 = 100分D、D 'のt = 60分E、E'のt = 80分F、F 'はトン。初期の時点で、短いアクチンフィラメントは、ナース細胞膜（A、A '）から内側に延びる観察することができる。これらは、完全に（D、D '）細長いまで、これらのアクチンフィラメントは、初期の時点（' A、Aに比べて「BC）の全体に細長く。後の時点では、これらの完全に長いアクチンフィラメントは、その後短縮 し、（E-F '）をダンプナース細胞全体に凝縮Aにスケールバー=50μmである。A'スケールバー=10μmである。
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図5ウェスタンブロット解析により特定のタンパク質を調べるために必要な卵胞の数を決定する方法のイラストこれは7C、クーリー、L. SN S10B包でファシン表情を見て、ウェスタンブロット（1:20、である;。発生研究ハイブリドーマ銀行（DSHB）、NICHDの後援の下に開発され、アイオワ大学、生物学科、アイオワシティ、アイオワ、52242）によって維持。上部の数字は、レーン毎にロードされS10B包のおおよその数を表す。
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Discussion
ショウジョウバエの卵胞は形態学的および分子解析の両方に最適です、細胞種の数が少ないから構成されている。さらに、卵巣の構造に起因し、それは一般的な解剖範囲および最小のトレーニングで卵胞発育の特定の段階を大量に得ることは比較的容易である。各ステージは短い時間窓を表すように、ステージの分離は、そのステージ中に発生する発生過程に重要な分子の洞察を提供することができます。例えば、我々はS10B、S12、S14及び18の間に生じる遺伝子発現の変化を特徴づけるために半ばから後期卵胞の分離を使用している。この分析は、以前に特徴付けられていない遺伝子の数は、卵胞の発達、特に、卵殻形成に貢献する可能性が示唆される。
ステージの分離は、ライブ撮影により形態学的事象への劇的な洞察を提供することができます。このような画像は、他に実行することができます ショウジョウバエの卵胞発育のLステージ。胚腺13、卵胞伸び19、ステージ9 11,12,14：この作品の焦点はS10B-14ですが、読者は、初期段階のライブイメージングのための以下の記事を参照している。これらの研究で利用される培養条件は、この作品で説明したものとは異なる。具体的には、これらの研究は、いくつかのケースでは、トレハロースをさらに加え、メトプレン、20 -ヒドロキシ、及び、可変FBS（2.5から15パーセント）のレベルならびにインスリン11-13,19を添加してシュナイダー昆虫培地を使用し、アデノシンは、14を脱アミド。それは、これらのライブイメージング研究が大きく発展、これらの初期の段階で発生する事象の理解を進めてきたことを指摘することは重要である。しかし、これらの初期段階の卵胞が卵胞の発達、S14の最終段階までずっと進行することはできません。逆に、S10B-13は、培養中のS14に展開してまいります。
S10B-S14多くの形態学的プロセス中> "ove_contentは、ライブイメージングによって研究することができる起こる。例えば、ライブイメージングダンプナース細胞の過程を調べるために使用することができ、ナース細胞は、卵母細胞にそれらの細胞質内容物を圧迫するプロセスそれは胚形成を完了するために必要なすべてをそれに提供する。ナース細胞ダンプが送信7光や蛍光マーカーを発現するトランスジェニック系統を用いた共焦点イメージングにより使用してタイムラプスイメージングで観察することができます（ 図4を参照）。ライブイメージングの継続的な使用が期待されているダンピング看護電池に必要な細胞骨格のダイナミクスに新たな洞察を提供しています。後のステージのライブイメージングはまた、背側心耳原基の移行と細管形成10の我々の理解を進んでいる。S10B-S13包の発達インビトロで起こるプロセスの両方の薬理学的試薬および遺伝子操作の影響を定義するために使用することができるこの期間中に鳴る。我々は7ダンピング看護婦細胞の調節におけるプロスタグランジンの役割を確立するために、S10B包の体外開発に使用してきた。その後、我々は薬理学的相互作用スクリーンを実行するには、このアッセイを使用している、アクチンレギュレータの1コピーの損失がプロスタグランジンの喪失に起因する欠陥をダンプ看護セルを増強または抑制した場合具体的には、テストされています。この画面では、推定される下流の標的（9とSpracklen、マイヤー、そしてゆっくり吹き続ける、未発表データ）の数を明らかにした。このアッセイはまた、2つの異なる因子のためのヘテロ接合に起因するダンピングナース細胞、（この例については9参照）、このようなブロックとして発達障害を評価することにより、遺伝的相互作用を調べるために使用できる。
かなり単純なプロセス半ばから後期ショウジョウバエ包をされている分離しながら、最適な成功のための重要な要素がいくつかあります。まず、ハエの調製物である非常に重要。これは、バイアルあたりハエの数は、男性に、女性の比率（2:1の比率が理想的である）、つまり 、可能な限り同じような状態でハエの異なる遺伝子型を維持し、一貫して新鮮な、湿った酵母を提供することをお勧めします。給餌（ウェット酵母）と、解剖時には、開発のさまざまな段階の有病率が変更されます。我々は、ハエが一貫して、午前中に供給される場合に、よりS12の午後に存在するが、より多くのS10Bsは、午前中に単離できることを見出した。第二の重要な要素は、メディアである。 in vitroでの開発とライブイメージングのためにそれが新鮮IVEMのメディアを準備することが不可欠である。さらに、メディアは冷たいメディアは、細胞骨格を変化させ、アクチンと微小管の両方であるため、更なる発展が中断され、室温に来なければならない。それは離れて破片から卵胞を維持することも重要です。時々、解剖時に、腸が卵巣で出てくるでしょう。発明者らは、腸が破裂した場合卵胞が汚染メディアに保存されており、卵胞を培養で成長する可能性は低い。卵胞が文化の中で発展し続けているために、in vitroでの開発や分子解析のどちらかを実行する前に、解剖後にステージングを再確認することが不可欠である。最後に、実験のための適切なコントロールを有することが重要である。 インビトロの発達のためには、（ 図3を参照）（80〜100％完全なナース細胞はダンピング）媒体が正常な発達を可能にすることをテストするために、野生型包を使用すると、予想通りの薬理学的試薬が作用することをテストする必要がある。
結論として、半ばから後期ショウジョウバエ包の単離は、実験技術のさまざまな発生過程に重要な洞察を提供することができます。
具体的な試薬および器具の表：
| 試薬の名前 | 会社 | 猫alogue数 | コメント（任意） |
|---|---|---|---|
| 活性ドライイースト | ジェネシー科学 | 62から103 | アクティブドライイーストのいずれかのソースは結構です |
| グレース昆虫メディア | ロンザ | 04-457F | |
| 熱不活性化ウシ胎児血清 | アトランタバイオロジカル | S11050H | 任意の熱不活性化FBSが動作するはずです |
| 10倍ペニシリン/ストレプトマイシン | GIBCO /インビトロジェン | 15140-122 | |
| ピン万力や針 | テッド·ペラ株式会社 | 13561から10 | |
| スポットプレート、ナイン井戸 | コーニング | 7220から85 | |
| ＃5デュモン鉗子 | ファイン科学ツール | 11252から20 | |
| 24マルチウェルプレート | ベクトン·ディッキンソン | 35 3226 | 任意の24ウェル組織培養皿は動作するはずです |
| カバーガラスボトムディッシュ（35ミリメートル） | マテック株式会社 | P35G-1.0-14-C | カバーガラスの厚さは、使用されている顕微鏡/客観的に依存することになる |
| ガラスピペット | コーニング | 7095B-5X（卵胞を転送するための） 7095B-9（引っ張らピペットを生成するため） | |
| サンプル杵（1.5μL、RNアーゼ/ DNアーゼ無料） | リサーチプロダクツ国際 | 199228 | 1.5μlの微量遠心管に適合する任意のプラスチック乳棒を使用することができる |
| トリゾール | インビトロジェン | 15596-018 |
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Disclosures
開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、試薬についてトーマスLecuit（SQH-ユートロフィン:: GFPライン ）、ブルーミントンストックセンター、発達研究ハイブリドーマバンクに感謝したいと思います。我々はさらに、原稿の有用な議論や批判のためにゆっくり吹き続けるラボのすべてのメンバーに感謝します。国立科学財団MCB-1158527からの資金調達、および解剖学と細胞生物学部門の立ち上げ資金、アイオワ大学は、この作品を支持した。薬理学T32GM067795保健博士号を取得する前のトレーニンググラントの国立研究所は、AJSを支持した。データ·ストレージのサポートは研究資源のための国民の中心とグラントUL1RR024979した翻訳科学、国立衛生研究所を進めるためのナショナルセンターでサポートされているCTSAを通じて資金を供給されるICTS、提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
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