Summary
중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.
Abstract
초파리의 난자 또는 난포 발달 널리 복잡한 발달 및 세포 생물학 프로세스의 이해를 사전에 이용되고있다. 이 방법 종이 중후반 단계 여포 (단계 10B-14)를 분리하고 개발 시간을 꽉 창 중에 발생하는 분자 형태 학적 이벤트에 새로운 통찰력을 제공하기 위해이를 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 격리 모낭 체외 개발 분석법, 라이브 영상, mRNA 발현 분석 및 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 포함한 실험 기법의 다양한 위해 사용될 수있다. 단계 (b) (S10B)에서 이상 모공 문화 개발을 완료 할 것이다, 이것은 하나의 개발의 특정 기간 동안 발생하는 과정에서 이러한 조작의 효과를 정의하기 위해 체외 개발 유전 약리학 적 교란을 결합 할 수 있습니다. 이러한 모공은 문화 발전하기 때문에 또한, 그들은 이상적으로 라이브 영상 연구에 적합종종 형태 학적 사건을 중재 새로운 메커니즘을 공개한다. 격리 여포 또한 분자 분석을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 유전 섭동 인한 유전자 발현의 변화는 특정 발달 윈도우에 대해 정의 될 수있다. 또한, 소낭 개발 특정 단계 동안 단백질 수준, 안정성 및 / 또는 번역 후 변형 상태는 웨스턴 블롯 분석을 통해 검사 할 수있다. 따라서, 초파리 여포의 단계 별 분리 개발 및 형태 형성의 널리 보존 프로세스에 풍부한 정보를 제공한다.
Introduction
각 초파리의 난소는 16 ovarioles, 또는 순차적으로 성숙 계란 챔버 또는 여포의 체인 ~로 구성되어있다. 각각의 뿌리가 하나의 난자, 15 세균 라인 파생 간호사 또는 지원 세포, 모낭 세포 (그림 1A)라고 ~ 650 체세포로 구성되어있다. 초파리의 난자가 개발 한 14 형태 학적으로 정의 된 단계로 나누어 져 있습니다. 난포 전개의 각 단계는 비교적 쉽게 스테이지 특정 모낭의 상당수를 분리하게, 단일 플라이 내에 여러 번 관찰된다.
난자 (10B-14 스테이지)의 중후반 단계 (그림 1) 단계의 분리에 특히 적합하다. 단계 10B (S10B)에서, 모낭 완전히 (즉, 그 길이가 14 단계 (S14) 모낭과 동일하다,도 1 및도 2H를 참조)으로 연장되고 모낭의 절반 길이는 널스 세포로 구성된다나머지 절반은 난자 (그림 1C) 동안. 이 단계에서 간호사 세포는 대뇌 피질의 액틴을 강화하고 액틴 필라멘트 2의 병렬 번들을 생성, 극적인 말라 리모델링을 받고있다. 동시에, 모낭 세포의 인구는 간호사 세포와 난자 사이에 마이그레이션, 구심 세포라고하고, 모낭 세포의 두 지느러미 그룹 등의 부속 기관, 배아 3 관 호흡 장치를 형성하기 위해 마이그레이션을 받아야 지정된 될 . 간호사가 배아 (그림 1D)를 완료하는 데 필요한 요인으로 난자를 제공 간호사 전지 덤핑라는 과정에서 난자에 자신의 세포질 내용을 짜내는 다음 계약 (S11), 세포. 간호사 세포는 세포 사멸 (S12-S13) 4를 받아야하고, 여포 세포는 달걀 껍질 5 (그림 1E-G)를 분비 및 패턴입니다. 따라서 난자의 끝이 중요한 발달이 풍부합니다D 형태 형성 과정.
격리 중후반 스테이지 여포 (S10B-S14)는 분자 분석 등 다양한 목적을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 단계적 모낭으로부터의 mRNA를 RT-PCR, 마이크로 어레이에 대해 분리 될 수 있고, 또는-RNA 서열 분석. 이것은 하나의 존재 단지 몇 종류의 세포로, 짧은 개발 윈도우 내에서 유전자 발현을보고, 유전자 발현이 약물이나 유전자 중 하나 섭동에 의해 변경하는 방법을 확인할 수 있습니다. 단 분리는 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을보고하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 하나의 특정 단계에서 돌연변이 대 야생형 단백질의 발현 수준을 정량 할 수 있기 때문에 이러한 분석은 중요하다. 하나를 사용할 수 있지만 면역 형광 정량 인해 모든 화소가 검출 6의 선형 범위 내에 엄격한 요구에 덜 견고, 비슷한 결과를 얻을 분석한다. 또한, 웨스턴 블롯 분석은 다른 정보를 제공 할 수있다 이러한발 단백질 posttranslationally 개질되거나 특정 스플 라이스 이소로부터 발현되는 경우. 격리 단계는 세포 이하 분획 또는 coimmunoprecipitation 포함한 상기 단백질 정제를 위해 사용될 수있다.
스테이지 별 모낭 분리는 체외 개발 분석 7과 라이브 영상 8 사용할 수 있습니다. 고립 된 S10B-S13 여포 (아래 참조) 간단한 배지에 S14을 개발하는 것입니다. 그것은 S10A 모낭이 원고에서 논의 된 배양 조건을 사용하여 덤핑 간호사 셀을 진행하지 않을 것을주의하는 것이 중요합니다. 우리는 읽기 아웃 7,9로 간호사 덤핑 세포 및 개발을 사용하여 말라 리모델링을 조절하는 두 약리학 적 및 유전, 프로스타글란딘의 역할을 정의 할 수 S10B 체외 개발 분석을 사용했다. 마찬가지로, 개발 후기 단계는 약물 치료 또는 유전자 남자의 효과를 결정하기 위하여 분리 될 수있다이러한 구심 세포 이동, 등의 부속기 마이그레이션 / 대형 10, 간호사 세포의 죽음과 같은 특정 프로세스에 대한 ipulations. 이러한 분석이 지배적 인 상호 작용 화면이나 분석을 수행 할 수 있습니다, 예를 들어, PXT 또는 fascin 혼자 돌연변이 이형은 S10B 체외 발달에 영향을주지하면서, 이중 이형 전시 간호사 세포 결함 및 개발 9 블록을 덤프에서 난포.
S10B-13 배양에서 발전 할 수 있기 때문에 또한,이 시간 동안 발생하는 모든 프로세스는 실시간 이미징에 의해 관찰 될 수있다. 이러한 영상은 단순히 형광 프로브 또는 라이브 영상 염료로 염색 모공을 표현 형질 전환 초파리를 사용하여 (한 형태의 심한 변화에만 관심이있는 경우) 투과광을 사용하거나 공 초점 현미경을 수행 할 수 있습니다. 라이브 영상은 실질적으로 발달 과정에 대한 우리의 이해를 사전에 사용하고 있습니다. 실제로, 걸 보면 라이브말기 여포의 G는 등의 부속기 이주의 지식, 세뇨관 (10)의 예를 확장했다. 우리는 투기 간호사 셀 동안 말라 역학 등의 추가 최종 단계 프로세스의 라이브 영상이 발달 이벤트에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대합니다. 그것은 S10A 및 난포 발달의 초기 단계는 문화 S14에 개발을 계속하는 것은 아니지만 개발하는 단계에서 발생하는 이벤트의 라이브 영상은 (이상 설명을 참조 다른 배양 조건에게 11 ~ 14를 사용 할 수 있습니다하는 것이 중요합니다 정보).
여기에서 우리는 하나의 생체 개발을위한 최종 단계 모낭 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 라이브 영상, 또는 분자 분석 (mRNA와 단백질 격리).
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Protocol
1. 초파리는 이전에 격리 스테이지 준비
- 증류수 90 ㎖의 활성 건조 효모 50 g의 결합에 의해 젖은 효모 붙여 넣기를합니다. 결합 주걱으로 섞는다. 혼합물이 일관성을 평가하기 전에 ~ 30 분 동안 서 보자. 일관성은 충분한 두께의 비행 병의 측면에 부착하지만 측면을 실행해야합니다. 원하는 일관성을 달성하기 위하여는 다시 10 ㎖의 물 또는 건조 효모의 작은 금액을 추가 할 필요가있다. 4 ° C.에 덮여 용기에 보관 저장 효모 ~ 1 ~ 2 주간 사용할 수 있습니다.
- <원하는 유전자형의 24 시간 이전 파리 성충 (남성과 여성 모두)을 수집하고 비행 음식 플러스 유리 병의 측면에 얼룩 져 젖은 효모 페이스트를 유리 병에 넣어. 해충이 유지되는 온도는 실험에 따라 달라질 것이다. 일상적인 실험에서, 파리, 실온에서 유지된다. 반면 유전자가되는 실험UAS/GAL4 시스템 (15)을 사용하여 과다 발현되는 것은 적절, 25 ° C 이상에서 파리를 유지해야 할 수 있습니다.
- 2 일 동안 매일 효모 붙여 넣기의 신선한 얼룩과 파리를 제공합니다. 참고 : 난포의 개발은 밀접하게 여성 비행의 영양 상태에 의해 규제되기 때문에, 그것을 해부하기 전에 적어도 36 시간 동안 영양이 풍부한 효모 페이스트 비행을 제공하는 것이 필수적입니다.
2. 분리 중후반 초파리 여포에게 단계적
- 미디어 실내 온도 (~ 30 분)에 올 수 있습니다. 단계적 모공이 체외 개발 분석으로 사용하는 경우, 갓 IVEM 미디어를 준비 (그레이스의 곤충 미디어, 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신). 단계적 모공의 mRNA 또는 단백질 분리 그레이스의 곤충 또는 IVEM 미디어 중 하나를 사용으로 사용하는 경우. 중요 : 미디어 온도가 중요합니다. 미디어가 추운 경우에는 변경합니다말라와 미세 소관 cytoskeletons 블록 개발 모두.
- CO 2 가스를 주입하여 yeasted 유리 병에 파리를 마취 및 CO 2에서 비행 패드에 3-5 여성 파리를 놓습니다. 중요 : 플라이 패드에 10 분 시간에 해부 할 수있는 것보다 더 많은 여성을 두지 마십시오 CO 2에 대한 확장 된 노출로 발생할 수 있습니다 불임과 죽음.
- 미디어 9 자리 플레이트 잘 하나를 입력하고 (블랙 플렉시 글라스의 조각이 잘 작동) 어두운 화면의 상단에 배치합니다. 우물의 바닥에 해부 범위에 초점을 맞 춥니 다.
- 사용 # 5 뒤몽의 집게 (이가 가장 지배적 인 손을 사용하여 수행됩니다) 한 손으로 하나의 여성을 선택합니다. 그것은 날개, 다리, 또는 복부 전환에 흉부에 의해 여성을 선택하는 것이 가장 쉬운 방법입니다. 잘 못 미디어에서 여성의 잠수함. 필요에 따라 현미경의 초점을 조정합니다.
- 잘 쓰지 손에 개최 포셉 번째 쌍을 사용하여, 복부의 전방 단부에 암형 잡아후방 단부는 지배적 인 손 (도 2a)을 향해 위치하도록. 미디어에 빠져들 비행을 유지해야합니다.
- 지배적 인 손으로, 2 번째로 가장 뒤 착색 된 부분에 표피를 잡아 멀리 복부 (그림 2B-C)의 나머지 부분을 찢어 집게를 사용합니다.
- 난소 (그림 2D-E)를 등장 할 때까지 지배적 인 손에 집게를 사용하여 부드럽게 복부의 앞쪽 끝을 짠다. 필요한 경우, 두 개의 난소 사이에 집게를 배치하고 시체에서 나오라고.
- 신선한 미디어 (그림 2 층)과 새도에 난소를 이동하거나 킴 와이프 종이 타월에 시체를 제거 하나. 이것은 모낭이 체외 개발에 고립되는 경우에 특히 중요합니다.
- 난소 ~ 5 쌍의 격리 될 때까지 반복합니다. 참고 : 각 난소는 16 ~ ovarioles 또는 순차적으로 성숙 난포의 사슬로 구성되어있다. 각 ovariole근육 칼집에 포함된다.
- 핀 바이스 그들과 함께 제공되는 바늘을 사용하여 부드럽게 ovarioles (그림 2G) 사이의 바늘을 실행하여 난소를 분리 당깁니다. 이것은 때때로뿐만 아니라 개별 모낭을 발표 할 예정이다.
- 개인 ovarioles 및 난포 발달의 쉽게 구별 형태 단계는 이제 볼 수 있습니다 (그림 2G 떨어져 조롱 난소)해야한다. 도 1 및 다른 단계를 구별하는 데 사용할 수있는 형태의 차이에 대한 2H 참조. 그대로 ovarioles 내에 여전히 근육 칼집에 포함 된 모낭을 분리, 바로 그 뿌리를 다음 위의 여포의 앞쪽에와 여포의 후방에 ovariole에 걸쳐 잘라 바늘을 사용합니다. 이 근육 칼집을 중단하고 멀리 관심의 뿌리는 지금에 손상을주지 않고 멀리 이웃 여포에서 절단 할 수 있습니다. 각각의 단계가 분리되면, 새로운 미디어와 새로운 웰에 유리 피펫을 사용하여, 관심있는 여포를 이동합니다. 체외 개발을위한 모낭을 분리 할 때 특히 중요합니다. 참고 : 잘 전반에 걸쳐 관심의 모낭을 재분배 기포를 방지하기 위해 미디어를 입력하기 전에 피펫 전구를 짜내는 것이 중요합니다. 모낭은 유리 피펫을 고집하는 경우 또한, 피펫 상하 수회 BSA 용액을 피펫 팅하고 해부 미디어 린스하여 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 예비 코팅 될 수있다.
- 충분히 모공이 고립되고 나면, 이후의 실험을 진행합니다.
S10B 여포의 3. 체외 개발
- IVEM 미디어에서 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 S10B 모낭을 분리합니다. 모공이 빠르게 떨어져 파편에서 이동되어 있는지 확인합니다. 이 난포가 성숙하는 것, 그것은의 impo입니다S10Bs이 30 ~ 60 분 동안 수집 한 다음 선택의 성숙 미디어에 배치되는 rtant. 참고 : S10B은 S10A 여포가 IVEM 문화 미디어 성숙하지 않으므로 신중하게, (1B에 비해 그림 1C) S10A 여포 구별 할 필요가있다. S10A 및 S10B 여포 모두에서, 길이의 절반은 널스 세포로 구성되고, 나머지 반은 난자이지만 S10B에서 모낭의 길이는 S14 여포 동일하다.
- 유리 피펫을 이용하여 24 - 웰 조직 배양 플레이트로 잘 ~ 30 S10B 모낭을 이동. 참고 : 전송되는 모낭의 모든 S10B하고 S11 성숙되지 않았는지 확인해야합니다.
- 즉 IVEM 미디어 플러스 약물 시약, 잘 당 성숙 매체의 1 μl를 준비합니다.
- 뽑아 유리 피펫 *를 사용하여 가능한 한 잘 (단계 3.2)에서 많은 미디어를 제거하고, 신속하게 선택의 성숙 미디어를 추가 할 수 있습니다. 참고 :이 뽑아 유리 주사위를 사용하는 것이 필수적입니다무대 여포로 ETTE 쉽게 Pipetman 유리 피펫이나 피펫 팁 중 하나와 함께 촬영 할 수 있습니다.
* 뽑아 피펫을 만들려면 : 1) 유리가 부드럽게 시작 바로 전까지 분젠 버너의 불꽃 긴 유리 피펫의 얇은 부분을 가열, 2) 즉시 불꽃 밖으로 피펫을 이동에 피펫을 그리는 수평으로 당겨 미세한 관 3) 좋은 점을 생성하는 휴식. 주의 : 유리의 파편이 날아 수 있으므로 보안경을 사용하십시오. - 실험이 필요로 반복 많은 우물에 3.1-3.4 단계를 반복합니다.
- 모공> 10 시간 동안 개발하고 해부 범위에 개발 진행을 득점 할 수 있습니다. 참고 : 실험은 일반적으로 모공이 개발을위한 충분한 시간을 허용하기 위해 다음 날 채점됩니다. S10B가 ~ 5 시간이며, S11은 ~ 30 분이며, S12은 1 ~ 2 시간이며, S13은 다소 시간이 오래 걸릴 것 실내 온도 25 ° C에서 1 개발의 기간에 ~ 1 시간입니다. S10B 여포에 대해 기재 한 것과 유사한 실험을 할 수있다S11-S13 여포를 사용하여 수행.
4. 라이브 이미징 단계 격리
- 빨리 떨어져 이물질이 모공을 이동, IVEM 미디어에서 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 선택의 형광 마커를 발현하는 최종 단계의 난포 (S10B-14)를 분리합니다.
- 새로운 미디어에 관심 여포를 이동 한 후 커버 슬립 바닥 페트리 접시에 유리 피펫으로 전송할 수 있습니다. 이 커버 슬립 바닥 면적에 거품 만에 유출되지 않도록 용지를 추가 할주의하십시오.
- 더 이상 시간 경과 영화의 경우, 페트리 접시의 안쪽 가장자리에 물에 적신 올리고 킴 와이프를 추가하여 배양 접시 내에서 습도를 유지하기 위해 때때로 필요하다. 상단에 뚜껑을 놓습니다.
- 거꾸로 현미경에 이미지. 자세한 해상도는 공 초점 현미경이 필요합니다. 그것은 영상, 조명의 강도, 영상의 길이의 주파수를 균형을 필요가있다, 이것은 각각 독립적으로 L 위해 일해야합니다abeling 도구 및 개발 과정.
5. mRNA의 준비를위한 단계 격리
- 그레이스의 또는 IVEM 매체 하나와 함께 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 각각의 단계 모낭을 분리합니다.
- 유리 피펫을 사용하여 미디어와 새로운 우물에 관심의 각 단계를 이동, 그것은 한 번에 여러 단계를 수집 할 수 있습니다.
- 1 시간에서 수집 시간을 유지합니다. 1.5 ML의 microfuge 튜브에 유리 피펫을 사용하여 모공을 이동합니다.
- 모공의 모든 펠렛 미니 마이크로 원심에서 간단히 튜브를 스핀. 뽑아 유리 피펫 (단계 3.4 참조)를 사용하여 조심스럽게 용지를 모두 제거합니다. 참고 : 전체 크기의 마이크로 원심을 사용하는 경우, 낮은 속도로 모공을 스핀 다운.
- 트리 졸 100 μl를 추가하고 플라스틱 유를 사용하여 ~ 20 초 동안 손으로 갈기. 마이크로 원심의 전체 속도로 스핀 다운 및 펠렛 D를 방해하지 않도록주의하고 새로운 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 트리 졸 이동ebris. -80 ° C.에 저장
- 충분히 모공이 실험을 얻을 때까지 반복 5.1-5.5 단계를 반복합니다. 일상적 ~ 75 S10B은, ~ 75 S12 및 S14 ~ 100 여포는 RNA의 ~ 10 μg을 얻을 수 있습니다.
- 얼음에 샘플을 해동. 한 미세 원심 분리 튜브에 적절하게 샘플을 배합하고 800 μL까지 트리 졸 볼륨을 가져온다. 제조업체의 지시에 따라 RNA 분리를 진행합니다. 중요 :의 RNase 무료 DNase의와 격리 된 RNA를 DNA 분해 효소 치료해야합니다.
6. 웨스턴 블로 팅을위한 무대 격리
- 100 ℃로 가열 블록을 예열
- 그레이스의 또는 IVEM 매체 하나와 함께 무대 격리 프로토콜 (2 단계)를 사용하여 각각의 단계 모낭을 분리합니다. 참고 : 경험적으로 각각의 특정 단백질을 관찰하는 데 필요한 방법을 특정 단계 모낭의 수를 결정하는 것이 필요하다. 높은 발현 된 단백질의 경우도 1-3 S10B 여포 /는 서양 얼룩에 강한 신호를 볼 충분하다. 그러나, 확인하는 것이 중요합니다대표 예제, 다수의 여성에서 난포를 복용. 따라서, 특정 단계의 15-20 모공은 일반적으로 수집됩니다.
- 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 유리 피펫을 사용하여 모공을 이동합니다. (단계 5.4 참조) 모공 펠렛 미니 마이크로 원심에서 간단히 스핀. 조심스럽게 (단계 3.4 참조) 뽑아 유리 피펫을 사용하여 용지를 모두 제거하고 1X PBS 50 μL와 배 램리 버퍼의 50 μl를 추가합니다.
- 플라스틱 유 봉 20 초 ~에 손으로 갈기. 참고 : 플라스틱 방앗 공이 세탁물에 따라 서부 샘플을 연마하고 압력 가마로 소독을 위해 재사용 될 수있다.
- 열 블록에 10 분 동안 샘플을 끓인다.
- 마이크로 원심에서 15 초 동안 전체 속도로 얼음과 스핀에 간단히 풀어. 즉시 -20 ℃에서 SDS-PAGE 젤 또는 상점에로드 하나 참고 : 샘플이 저장되어있는 경우, 젤에로드하기 전에 샘플을 재비 기억.
- 표준 프로토콜을 다음과 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.
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Representative Results
초파리 여포 개발의 특정 단계를 분리 할 때 정확하게 상이한 형태 학적 단계를 구별 할 수있을 것이 필수적이다. 간호사 세포와 난자 각 (그림 1B는 1C에 비해)이 단계에서 뿌리 길이의 반을 차지로이, S10A 및 S10B에 대한 다소 도전이다. S10B 모낭이 완전히 신장 및 S14 여포 (1G에 비해 그림 1C)에 길이에 따라서 동일 그러나, S10A 여포는, S10B 여포보다 길이가 짧다. 또한, 구심 여포 세포라는 난자에 뿌리 또는 체세포의 일부는 간호사 세포와 S10B의 난자 사이에 이주하기 시작한다. S11에서 간호사 세포 계약, 난자에 자신의 세포질 내용을 짜내도록 ~ 5 시간이 소요 S10B, 동안, 간호사 세포는 동적 말라 리모델링을 받고있다. 따라서, S11에서, 간호사 셀 영역에는난자 (그림 1D)를 확장하고있는 동안 크게 감소했다. S12에서, 간호사 세포는 죽음을 받아야하고 불투명 모양 (그림 1E)에 걸릴하기 시작, 흥미롭게도, 문화, S12 모낭에있는 간호사 세포 잔해 컬 등쪽은 ( '그림에 3C'-D를 S12s 참조). S13 동안 세포의 죽음이 완료되는대로, 간호사 셀 영역은 투명하고 지느러미 부속 기관 형성 (그림 1 층)이 발생한다. S14 만이 난자와 여포 세포가 남아 있고, 지느러미 부속 기관 형성 (그림 1G) 완료됩니다.
체외 개발 분석 (도 3)를 덤핑 S10B 개발 및 간호사 전지에 다양 약리 치료 및 유전자 돌연변이의 결과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 문화 S10Bs의 개발은 그러나 요인이별로 실험 결과로 이어질 수, 강력. 도 3a에서,성공과 실패 실험 모두에서 실험 데이터가 제공됩니다. 성공적인 실험은 제어 미디어 야생형 여포 80-100 %의 완전한 간호사 전지 덤핑 및 S12-14에 진행되는 하나입니다 (그림 3A, 중량 1). 때때로 야생 형 컨트롤은 모공 미만 80 % (그림 3A, 중량 2)을 개발하는 것을 의미한다, 실패합니다. ) 등 S10B 모낭에서 S10A를 구별하기 1) 무능력 (그림 1과 2 참조), 2) 미디어 문제 (온도, 연령, 및 / 또는 3) 여포는 :.이 실패 등의 문제로 인해 발생할 수 너무 오래 파편에 노출.
S10Bs의 체외의 개발은 약물 치료와 조합하여 사용할 수있다. 이러한 실험을 위해, 약물 조절, 약제와 야생형 모낭 즉 처리는, 모든 실험으로 수행되는 것이 중요하기 때문에 약물의 효과 및 / 또는 정광이온은 시간에 따라 변경 될 수있다. 약리 실험을 위해, 제어 매체에 해당하는 약물 치료의 개발에 모낭의 백분율의 비율을 분석하는 데 편리하다; 이것은 유전 적 배경에 약간의 차이를 제어한다. 그것은 약물의 IC (50)의 농도로 처리하는 것이 유용합니다,이 블록은 야생형 (YW)의 50 % 덤핑 및 발전 간호사 셀을 겪고에서 여포하는 농도이다. . 블록, 따라서 야생형 모낭의 비율이 0.5 (그림 3B, 약 1)이 될 것으로 예상된다 그림 3b는 약물 (아스피린) (증발 용매 가능성으로 인해 약 2) 너무 집중 될 수있는 방법의 예입니다 50보다 큰 현상에서 야생형 모낭 %. 또한 체외 개발 분석을 설명하기 위해 개발 S10B 여포의 두 우물의 이미지가 제공됩니다.도 3C와 D의 시작 부분에 S10B 여포를 설명분석은, 제어 또는 처리 아스피린에 (~ 2 ㎜) 미디어.도 3C '와 D'공개, 분석의 끝을 설명하는 아스피린 치료 모낭의 대부분이하지 않은 반면, S14으로 개발 한 제어 처리 여포의 대부분 완료 간호사 전지 덤핑.
체외 개발 분석 또한 특정 약물에 더 민감 유전 적 배경에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 그림 3E는이 두 가지 예제가 포함되어 있습니다. 반대로, 두 번째 예에서, 유전 적 배경 (expt2, 빨간색 막대)은 아스피린의 효과를 강화하며, 첫 번째 예에서, 유전 적 배경 (expt1, 파란색 막대)는 비율이 0.5 ~ 남아있는 아스피린과 상호 작용할 수 없습니다. 따라서, 체외 개발 분석은 늦은 난자 중에 발생 발달 및 형태 학적 사건에 돌연변이 및 약리학 시약의 결과를 정의하는 데 사용될 수 있으며, 또한 분석 (9 참조) 약리 유전 상호 작용 모두를 평가하기 위해 사용될 수있다.
단 분리는 발달 과정의 라이브 영상에도 사용할 수 있습니다. 4 Utrophin-GFP, 녹색 형광 단백질에 융합 된 인간 Utrophin에서 액틴 결합 도메인을 표현하는 S10B 여포의 시간 경과 영화의 예입니다 그림. 이 이미징 도구, 말라 번들 형성과 응축을 사용하는 것은 시각화 할 수 있습니다. 많은 도구가 단백질 트랩 형질 전환 라인 (16, 17)를 포함하여 라이브 영상에 사용할 수 있으며, 구동 UAS는 형광 세포 기관 마커 태그 (미토콘드리아, 골지체, 소포체, 등.), 구동 UAS는 찬란하게 굴지과 액틴 결합 단백질, 미세 소관 (골격 마커 태그 및 미세 소관) 단백질을 결합, 어떤 표현하는 유전자 변형 라인은 형광 (나일 레드) 에듀 레이블 DNA, FM4-64 라벨의 세포막을 복제, 중성 지질 레이블 관심의 단백질과 중요한 염료를 태그.
ove_content "> 분자 분석은 초파리 여포의 절연 스테이지를 사용하여 수행 될 수있다. 웨스턴 블롯에 의해 단백질 분석을 위해, 그것을 경험적으로, 개발의 특정 단계 중에서, 관심의 단백질을 관찰하는 데 필요한 몇 모낭 결정할 필요가있다.도 5 순차적으로 특정 단백질 Fascin을 관찰하는 데 필요한 S10B 모낭의 수를 결정하기 위하여, 농축 된 단백질 용 해물을 희석하는 방법의 일례이다. 이때 하나 S10B 소낭 웨스턴 블롯으로이 단백질을 관찰하기에 충분하다.
그림 1. 다이어그램 중후반 단계 초파리 FOL의 형태 학적 차이를 나타내는 초파리 여포와 이미지의 세포 구성을 설명하는licles. S10A 뿌리. BG의 세포 성분을 묘사 A. 다이어그램. 범위를 해부 스테레오를 사용하여 촬영 S10A-S14 초파리 여포의 대표 이미지. ~ 650 체세포 유래 상피 세포 (화이트, 마젠타, 시안,에 둘러싸여 1 난 모세포 (빨강, A) 및 (15) 간호사 또는 지원 세포 (노란색) : 초파리의 뿌리는 16 생식 세포에서 파생 된 세포로 구성 ). S10A에서, 모낭의 길이의 절반은 스트레치 여포 세포 (마젠타)에 의해 덮여있다 널스 셀 (옐로우 부류, B)으로 구성되고, 나머지 반은 난자 (빨간색 별표로 구성된다 , B), 이는 본체 여포 세포에서 (흰색)으로 덮여있다. S10B에서, 간호사 세포 (노란색 브래킷, C)와 난자 (빨간색 별표, C)는 각 르의 절반을 구성여포의 ngth 그러나 뿌리의 전체 길이는 지금 S14 여포 (G로 C 비교)의 그것과 동일하다. S11 동안, 간호사 세포 (노란색 브라켓, D)이 빠르게 말라 / 마이 오신에 의존하는 과정에서 길게 난 모세포 (빨간색 별표, D)으로 자신의 세포질 내용을 짜내는 투기 간호사 세포라고합니다. S12으로 난자 (빨간색 별표, E)가 완전히 완료 만 간호사 세포 잔해는 (E 노란색 브라켓) 남아는 간호사 세포는 덤핑과 같다 연장했다. 간호사 세포 잔해 S13에서 (노란색 브래킷, F) 완전 세포 죽음. S14는 등의 부속물 (흰색 화살표, G). B. 스케일 바 = 0.1 mm를 포함하여 난자 (빨간색 별표, G), 체세포, 달걀 껍질,로 구성되어 완전히 성숙 난포를 나타냅니다.
그림 2. 이미지는 난소 절제 및 모낭 분리의 개요를 제공한다. A.이 해부 미디어의 비행 잠수함과는 잘 쓰지 손, 집게으로 개최 될 수 있도록 방향을 맞 춥니 다. B.이 지배적 인 손을 사용하여 복부의 뒤쪽에서 표피를 잡아. C.는 표피를 당겨 난소 (노란색 화살표)을 노출. 후방으로 복부의 전방에서 근무 D.이 부드럽게 난소 (노란색 화살표)를 해제 복부를 짠다. E.이 남아있는 표피에서 난소 (노란색 화살표)를 분리 (빨간색 화살촉) 및 / 또는 내부 장기 (흰색 화살촉). F. 신선한 잘 포함 해부 미디어에 고립 된 난소를 전송합니다. G. 티즈 떨어져 난소, 해부 바늘을 사용하여, 개별 주문을 노출vidual 여포 (분리 난소 (아래)에 그대로 난소 (상단)를 비교합니다. 찔 S10B 여포, 이후의 실험. H. 선택 관심의 형태 학적 단계 (단계 10A에 사용할 수 없습니다 난포의 예에 화이트 화살촉 점 -14 (S10A-S14)) 표시됩니다.
그림 3. 체외 개발 분석의 예. S10B의 비율 A. 차트는 문화에 그 완전한 개발을 난포. 2 중량 문화에별로 개발 (68 % 현상)의 예입니다 동안 중량 1, 야생 형 S10B 여포 (96 % 현상)의 예상 개발의 예입니다. 제어 미디어 야생형 S10B 여포의 개발이 80 % 미만이면 우리는 일반적으로 전체 실험을 취소합니다. B.를 (50)를 포함하는 미디어 (dev.)를 개발 S10B 모낭의 비율의 비율 차트. 이것은 야생형 값 ~ 0.5이어야 수단; IC (50)는 블록 현상에서 S10B 모낭의 50 %가되는 농도이다. 약물 2의 약물 농도 (0.37). CD 너무 강한 때 발생의 일례 동안 약물 1 예상 야생형 비율 (0.52)의 일례이다 '. 체외 개발 웰의 이미지. CC'. 제어 처리. DD 분석의 끝 지점에서 난포. 이미지 '. 아스피린 분석. C'-D의 시작 S10Bs의 (~ 2 ㎜). CD. 이미지 처리'. 컨트롤 '(아스피린 치료 모낭의 대부분이 D)를 덤핑 간호사 셀을 완료하는 데 실패하면서, S10B 여포 문화 (C)'에 S14s에 개발 처리.
그림 4. 고립 S10B의 사용을 보여주는 예는 라이브 영상에 모공. AF. Utrophin에서 격리 S10B 여포의 시간 경과 Z-스택 3 조각의 최대 전망 :: GFP 유전자 변형 파리 (SQH-Utrophin :: GFP). A'-F '를 표현. 확대 된 인세는에서 단일 간호사 셀을 강조 A- F. AF '. F-액틴 (Utrophin :: GFP), 흰색. A, A'. 시간 (t) = 0 분. B, B '. t = 20 분. C, C'= 40 분. t. = 100 분 D, D '. t = 60 분. E, E'. t = 80 분. F, F는 '. t. 초기 시점에서, 짧은 액틴 필라멘트 널스 세포막 (A, A ')으로부터 내측으로 연장되는 관찰 될 수있다. 그들은 ( 'D, D) 완전히 연장 될 때까지이 액틴 필라멘트 ('A, 비교 'BC) 초기 시점에 걸쳐 연장. 나중에 포인트,이 완전히 긴 액틴 필라멘트 다음 단축 (EF ')를 덤핑 간호사 세포를 통해 응축 A. 스케일 바 = 50 μm의.'. 스케일 바 = 10 μm의.
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.. 발달 연구, 웨스턴 블롯 분석하여 특정 단백질을 검사하는 데 필요한 모낭의 수를 결정하는 방법을 그림 5와 그림이 S10B 여포 (1:20 SN의 7C, 쿨리, L.에 Fascin 표정을보고 서양 얼룩입니다 하이 브리 도마 은행 (DSHB), NICHD의 후원하에 개발과 아이오와 대학, 생물학과, 아이오와 시티, 아이오와, 52242)에 의해 유지. 상단에있는 숫자는 레인 당로드 S10B 여포의 대략적인 수를 나타냅니다.
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Discussion
초파리의 뿌리는 형태 학적 및 분자 분석 모두에 이상적, 세포 유형의 작은 숫자로 구성되어 있습니다. 한층 인해 난소의 구조, 평범한 해부 범위 및 최소한의 교육 난포 개발의 특정 단계를 다수 구하는 것이 상대적으로 쉽다. 각 단계는 짧은 시간 창을 나타내는 바와 같이, 단 분리는 그 단계에서 발생하는 발달 과정에 중요한 분자 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 S10B, S12, S14 및 18 동안 발생하는 유전자 발현의 변화를 특성화하도록 중후반 스테이지 소낭 격리를 사용 해왔다. 이 분석은 이전에 uncharacterized 유전자의 수는 여포 발전에 기여 가능성, 특히, 달걀 껍질 형성에 제안합니다.
무대 격리는 라이브 영상을 통해 형태 학적 이벤트에 극적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이러한 촬상는 Al에 대해 수행 될 수있다 초파리의 난포 발달의 L 단계. germarium 13, 뿌리 신장 19 일 및 9 단계 11,12,14 :이 작품의 초점은 S10B-14 동안, 독자는 초기 단계의 라이브 영상에 대한 다음과 같은 기사라고합니다. 이 연구에 사용 된 배양 조건은이 작품에서 논의 된 것과 구별된다. 구체적으로,이 연구는 일부 경우에, 트레 할로 오스를 첨가, 메토 프렌, 20 hydroxyecdysone 및 가변 FBS (2.5-15 %)의 레벨뿐만 아니라 인슐린 11-13,19의 추가와 함께 슈나이더의 곤충 프레스를 사용 아데노신은 14 deamidase. 이들의 라이브 영상 연구는 크게 개발이 초기 단계에서 발생하는 이벤트에 대한 우리의 이해를 전진했다 것을 지적하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 초기 단계의 난포는 난포 개발, S14의 마지막 단계에있는 모든 방법을 진행 할 수 없습니다. 반대로, S10B-13 문화 S14을 개발합니다.
S10B-S14 많은 형태 학적 과정에서> "ove_content는 라이브 영상에 의해 연구 할 수 생긴다. 예를 들어, 라이브 영상 덤핑 널스 셀의 프로세스를 검사하는 데 사용될 수 널스 세포가 난자로 그들의 세포질 내용을 짜내하는 프로세스 이 배아를 완료해야합니다. 간호사 전지 덤핑 (그림 4 참조) 라이브 영상의. 계속 사용하는 형광 마커를 발현하는 형질 전환 라인을 사용하여 전송 등 7 또는 공 촛점 이미징에 의해를 사용하여 시간 경과 영상으로 관찰 할 수있는 모든 것을 함께 제공하는이 것으로 예상된다 이후 단계의 간호사 전지 덤핑에 필요한 골격 역학에 새로운 통찰력을 제공합니다. 라이브 영상도 등의 부속기 원기 마이그레이션 및 세뇨관 (10)에 대한 우리의 이해를 전진했다.S10B-S13 모낭 체외의 개발에서 발생 공정에서 약리학 시약 및 유전자 조작 양쪽의 효과를 정의하기 위해 사용될 수있다이 시간 동안 반지. 우리는 7 덤핑 간호사 세포를 조절하는 프로스타글란딘의 역할을 설정하는 S10B 모낭의 체외 개발에 사용했다. 그 후 우리는 약물 상호 작용 화면을 수행하기 위해이 분석을 사용하고, 말라 레귤레이터의 사본의 손실이 향상 또는 간호사 세포는 프로스타글란딘의 손실로 인한 결함을 투기 억제하면 구체적으로, 우리는 테스트되었습니다. 이 화면은 추정 다운 스트림 대상 (9 Spracklen 마이어, 그리고 잡담, 게시되지 않은 데이터)의 숫자를 공개했다. 분석은 또한 (9보기의 예를 들면) 서로 다른 두 가지 요인으로 인해 이형로, 덤핑 간호사 셀 블록으로 발달 결함을 평가하여 유전자의 상호 작용을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
아주 간단한 절차 중후반 단계 초파리 여포입니다 분리하면서, 최적의 성공을위한 중요한 요인은 여러 가지가있을 수 있습니다. 먼저, 파리의 제제는매우 중요합니다. 그것은 유리 병 당 파리의 수, 남성 (분 비율이 이상적이다)에 여성의 비율, 즉 가능한 한 유사한 상태에있는 파리의 다른 유전자형을 유지하고 지속적으로 신선한, 젖은 효모를 제공하는 것이 가장 좋습니다. 먹이 (습식 효모)와 해부 시간은 개발의 다른 단계의 유행을 변경합니다. 우리는 파리가 지속적으로 아침에 공급 될 때 더 S12s 오후에 존재하는 동안, 더 S10Bs이 아침에 고립 될 수 있다는 것을 발견했다. 두 번째 중요한 요인은 미디어입니다. 체외 개발 및 라이브 영상을 위해 신선한 IVEM 미디어를 준비하는 것이 필수적입니다. 또한, 미디어는 액틴과 미세 소관 모두 차가운 미디어 cytoskeletons을 변경합니다 실온에 와서해야한다, 따라서, 추가 개발을 중단. 그것은 거리에 이물질이 모공을 유지하는 것도 중요합니다. 때때로, 해부하는 동안, 창자는 난소에 나올 것입니다. 우리가 발견 한 그 용기가 파손 된 경우그리고 모공이 오염 된 미디어에 보관, 모공은 문화에서 발전 가능성이 있습니다. 모공이 문화를 개발하기 위해 지속적으로, 그것은 체외 개발 또는 분자 분석 중 하나를 진행하기 전에 절개 후 준비를 다시 확인하는 것이 필수적입니다. 마지막으로,이 실험을 위해 적절한 컨트롤을하는 것이 중요합니다. 체외 개발의 경우, 미디어가 정상적인 발달 (80-100% 완료 간호사 전지 덤핑)을 허용하는지 테스트하는 야생 형 여포를 사용하고, (그림 3 참조) 예상대로 약물 시약 행동하는지 테스트 할 필요가있다.
결론적으로, 중후반 단계 초파리 모낭의 분리 실험 다양한 기술을 통해 개발 프로세스에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
특정 시약 및 장비의 테이블 :
| 시약의 이름 | 회사 | 고양이alogue 수 | 댓글 (옵션) |
|---|---|---|---|
| 활성 건조 효모 | 제네 과학 | 62-103 | 활성 건조 효모의 모든 소스는 괜찮습니다 |
| 그레이스의 곤충 미디어 | 론자 | 04-457F | |
| 열 불 활성화 태아 혈청 | 애틀랜타 체액 | S11050H | 모든 열 불 활성화 FBS 작동합니다 |
| 배 펜 / Strep의 | 기브 / 인비 트 로젠 | 15140-122 | |
| 핀 바이스와 바늘 | 테드 펠라 주식 | 13561-10 | |
| 스팟 플레이트, 나인 음 | 코닝 | 7220-85 | |
| # 5 뒤몽의 포셉 | 파인 과학 도구 | 11252-20 | |
| 24 멀티 웰 플레이트 | 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) | 35 3226 | 상관 없음 24 - 잘 조직 배양 접시가 작동한다 |
| 바닥 요리를 커버 슬립 (35 ㎜) | MatTek 공사 | P35G-1.0-14-C | coverslip에 두께는 현미경 / 목적이 사용에 따라 달라집니다 |
| 유리 피펫 | 코닝 | 7095B-5X (여포를 전송) 7095B-9 (뽑아 피펫 제조) | |
| 샘플 유봉 (1.5 μL, RNA 분해 효소 / DNA 분해 효소 무료) | 연구 제품 국제 | 199228 | 1.5 μL의 미세 튜브에 적합합니다 모든 플라스틱 유를 사용할 수 있습니다 |
| 트리 졸 | 인비 트 로젠 | 15596-018 |
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Disclosures
공개 아무것도 없다.
Acknowledgments
우리는 시약 토마스 Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP 라인), 블루밍턴 증권 센터 및 발달 연구 브리 도마 은행에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원고의 도움이 토론과 비판에 대한 잡담 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 자금은 국립 과학 재단 MCB-1158527, 그리고 해부학 및 세포 생물학 부서에서 창업 자금, 아이오와의 대학은이 작업을 지원했다. 약리 과학 T32GM067795 건강 Predoctoral 교육 그랜트의 국립 연구소는 AJS을 지원했다. 데이터 스토리지 지원은 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 UL1RR024979을 통해 번역 상 과학, 건강의 국립 연구소를, 전진을위한 국립 센터에서 지원하는 CTSA 재정 지원을 통해 ICTS에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
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