Summary
Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila oogenez veya folikül gelişimi yaygın olarak karmaşık bir gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerin anlayışı ilerletmek için kullanılır olmuştur. Bu yöntemler kağıt orta-geç evre foliküllerini (Sahne 10B-14) izole ve gelişimsel zaman sıkı pencere sırasında meydana gelen moleküler ve morfolojik olaylara yeni bakış açıları sağlamak için bunları kullanmak için nasıl açıklar. İzole folikül gelişimi in vitro tahlilleri, canlı görüntüleme, mRNA ifade analizi ve proteinlerin western blot analizi de dahil olmak üzere deneysel teknikler, çeşitli için kullanılabilir. Sahne 10B (S10B) ya da daha sonra folikülleri kültür gelişimini tamamlayacak, bu bir gelişme belirli dönemlerinde ortaya çıkan süreçler üzerinde bu tür manipülasyonlar etkilerini tanımlamak için in vitro gelişimi ile genetik veya farmakolojik tedirginlikler birleştirmek sağlar. Bu folikülleri kültür gelişir çünkü Ayrıca, onlar ideal canlı görüntüleme çalışmaları için uygundur, Genellikle morfolojik olaylara aracılık yeni mekanizmalar ortaya hangi. İzole köklerinin aynı zamanda moleküler analiz için kullanılabilir. Örneğin, genetik düzensizliklerin neden gen ekspresyonunda değişiklikler belirli bir gelişimsel pencereler için tanımlanabilir. Ayrıca, folikül gelişiminin belirli bir aşamasında protein düzeyi, kararlılık, ve / veya sonrası tadilat devlet western blot ile analiz incelenebilir. Böylece, Drosophila köklerinin sahne özel izolasyon gelişimi ve morfojenezinin yaygın korunmuş süreçlerine zengin bir bilgi kaynağı sağlar.
Introduction
Her bir Drosophila yumurtalık 16 ovarioles, ya da sıralı olarak olgunlaşma yumurta odalar veya folikül zincirlerinin ~ oluşmaktadır. Her folikül tek oosit, 15 germ hattı türetilmiş hemşire veya destek hücreleri ve folikül hücreleri (Şekil 1A) olarak adlandırılan ~ 650 somatik hücrelerden oluşmuştur. Drosophila oogenez 1 geliştirme 14 morfolojik olarak tanımlanmış aşamaları ayrılmıştır. Folikül gelişiminin her aşaması nispeten kolay sahne özgü folikül önemli sayıda izole etmek için yapım, bir tek sinek içinde birçok kez görülmektedir.
Oogenezisin (10B-14 Aşamaları) orta-geç aşamaları (Şekil 1) evre izolasyonu için özellikle uygundur. Aşama 10B (S10B) olarak, folikül tamamen (yani, uzunluğu, bir evre 14 (S14) folikül eşit olan, Şekil 1 ve Şekil 2H bakınız) uzatılmış ve folikül yarısı uzunluğu hemşire hücrelerden oluşmaktadırdiğer yarısı oosit (Şekil 1C) iken. Bu aşamada hücreler, hemşire kortikal aktin güçlendirilmesi ve aktin ipliklerin 2 paralel demetleri üreten, dramatik aktin yeniden geçer. Aynı zamanda, folikül hücreler popülasyonu, hemşire hücreleri, ve oosit arasında geçiş, merkezcil hücreleri olarak adlandırılan ve folikül hücrelerin iki dorsal grup dorsal uzantıları, embriyo 3 için boru şekilli solunum cihazları meydana göç geçmesi için belirtilen olmak . Hemşire bu embriyojenezinin (Şekil 1D) tamamlamak için gerekli faktörleri ile oosit sağlar hemşire hücre damping denilen bir süreç içinde oosit içine sitoplazmik içeriğini sıkma sonra sözleşme (S11), hücreler. Hemşire Hücreler daha sonra hücre ölümünü (S12-S13) 4 geçmesi ve folikül hücreler, yumurtaların 5 (Şekiller 1 E-G) salgılar ve desen. Böylece, oogenezisin sonu önemli gelişimsel An ile zengind morfogenetik süreçler.
İzole orta-geç evre folikül (S10B-S14) ve moleküler analizlere dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, aşamalı foliküllerden mRNA RT-PCR, mikrodizi için izole edilebilir, ya da RNA-seq analiz eder. Bu bir hediye, sadece birkaç hücre tipleri ile, kısa bir gelişimsel pencere içinde gen ifadelerine bakılması ve gen ekspresyon farmakolojik veya genetik ya pertürbasyonlarm nasıl değiştiğini belirlemek için izin verir. Aşama izolasyonu da western blotting ile protein bakmak için kullanılabilir. Bu belirli aşamalarında mutantlann karşı yabani tip protein ekspresyonu seviyesini ölçmek için izin verir, çünkü bu tür bir analiz önemlidir. Bir kullanımı olsa da immünofloresan flüoresans ölçümü nedeniyle piksellerin her algılama 6 lineer aralığında sıkı gereksinimleri daha az sağlam olan, benzer sonuçlar elde etmek için analiz eder. Buna ek olarak, western blot analizi, diğer bilgileri sağlayan bu tür birs protein çevrim sonrası modifiye edilir ya da belirli bir ek yeri izoform eksprese ise. Izole edilmiş hücre altı paya ayırma aşamaları da dahil olmak üzere, daha fazla veya coimmunoprecipitation protein saflaştırma için kullanılabilir.
Aşama özgü folikül izolasyonu da in vitro tahliller gelişme 7 ve canlı-8 görüntüleme için kullanılabilir. İzole S10B-S13 folikül (aşağıya bakınız) basit bir kültür ortamı içinde S14 geliştirmek devam edecektir. Bu S10A folikülleri bu yazıda tartışılan kültür koşulları kullanılarak damping hemşire hücre yoluyla ilerleme olmayacağını dikkat etmek önemlidir. Biz okumak-çıkışları 7,9 olarak hemşire damping hücre ve gelişme ile aktin yeniden düzenleyen, hem de farmakolojik ve genetik, prostaglandinlerin rolünü tanımlamak için S10B in vitro geliştirme deneyleri kullandık. Benzer şekilde, daha sonraki gelişim aşamaları, aynı zamanda farmakolojik tedaviler veya genetik erkek etkilerini belirlemek için izole edilebilirBöyle merkezcil hücre göçü, dorsal apendiks göç / oluşumu 10, ve hemşire hücre ölümü gibi belirli süreçlere ipulations. Bu gibi deneyler, dominant etkileşim ekranlar veya tahlilleri yapmak için kullanılabilir, örneğin, PXT veya fascin tek mutasyonlar heterozigozite S10B in vitro gelişimi üzerine bir etkisi varken, çift heterozigot sergi hemşire hücre kusurları ve geliştirme 9'daki bir blok boşaltmaması folikül.
S10B-13 kültür geliştirebilir çünkü Ayrıca, bu süre esnasında meydana gelen işlemlerin tüm canlı görüntüleme ile gözlenebilir. Bu tür bir görüntüleme, sadece flüoresan probları ya da canlı görüntüleme boyalarla boyanmış köklerini ifade eden transjenik sinekleri kullanılarak (bir morfoloji toplam değişiklikleri sadece ilgi ise) iletilen ışık kullanılarak veya konfokal mikroskobu ile gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme ölçüde gelişim süreçleri anlayışımızı ilerletmek için kullanılıyor. Nitekim, imagin canlıGeç evre köklerinin g dorsal uzantı göç bilgi, tubulogenesis 10 bir örnek genişletti. Biz damping hemşire hücre sırasında aktin dinamikleri dahil olmak üzere ek geç evre süreçleri, canlı görüntüleme, bu gelişimsel olayların yeni bakış açıları sağlayacak bekliyoruz. Bu S10A ve folikül gelişiminin erken aşamalarında kültüründe S14 haline devam ederken, gelişim bu dönemlerinde meydana gelen olaylar canlı görüntüleme (daha fazla bilgi için Tartışma bakın alternatif kültür koşullarında 11-14 ile mümkün olduğuna dikkat etmek önemlidir bilgisi).
İşte biz ya in vitro gelişimi için geç dönem köklerinin izole etmek için ayrıntılı protokoller sağlamak ve canlı görüntüleme, veya moleküler analizleri (mRNA ve protein izolasyonu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Drosophila önce İzolasyon Sahne için hazırlanıyor
- Damıtılmış su 90 ml ile aktif kuru maya, 50 g ıslak maya birleştirerek hamur yapın. Birleştirmek için bir spatula ile karıştırın. Karışım kıvama değerlendirilmesinden önce ~ 30 dakika bekletin. Tutarlılık, sadece yeterince kalın bir sinek flakon tarafına uymak için değil, yüzü aşağı koşmak olmalıdır. İstenilen kıvama ulaşmak için bu ilave 10 ml su veya kuru maya küçük bir miktar kadar eklemek için gerekli olabilir. 4 ° C de kapalı bir kap içinde depolayın Mayanın ~ 1-2 hafta içinde de kullanılabilir.
- <Istenen genotip 24 saat yetişkin sinekler (erkek ve kadın her ikisi de) toplamak ve sinek gıda artı şişenin tarafında bulaşmış ıslak maya hamuru ile bir şişeye koydu. Sinekler muhafaza edildiği sıcaklık deney bağlı olarak değişecektir. Rutin deneyler için, sinekler, oda sıcaklığında muhafaza edilir. Oysa bir gen olduğu deneylerUAS/GAL4 sistemi 15 kullanılarak aşırı eksprese edilmiş, uygun olarak, 25 ° C ya da daha yüksek sinekler muhafaza gerektirebilir.
- 2 gün boyunca günlük maya hamur taze bir smear ile sinekler sağlayın. NOT: Eğer folikül gelişimi sıkı dişi sineğin beslenme durumuna göre düzenlenir gibi, diseksiyon önce en az 36 saat boyunca zengin besin maya hamur ile sinek sağlamak esastır.
2. Yalıtımlı Orta-geç Drosophila folikülleri Sahnelenen
- Medya, oda sıcaklığında (~ 30 dk) gelmesini bekleyin. Aşamalı köklerinin in vitro geliştirme deneyleri için kullanılacak olacak, taze IVEM ortam hazırlar (Grace böcek ortamı,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 1 x penisilin / streptomisin). Sahnelenen folikülleri mRNA veya protein izolasyonu Grace'in böcek veya IVEM medya kullanabilirsiniz için kullanılan olacak iseniz. ÖNEMLİ: Medya sıcaklığı önemlidir. Ortam soğuk ise, o değiştirecektiraktin ve mikrotübül cytoskeletons ve blok geliştirme hem.
- CO 2 gazı enjekte edilerek mayalı flakon sinekler uyutmak ve CO 2 altında bir sinek ped üzerine 3-5 dişi sinekler yerleştirin. ÖNEMLİ: sinek pad üzerinde bir 10 dakika süre içinde disseke edilebilir daha fazla kadın bırakmayın CO 2 uzatıldı maruz kalma gibi neden olabilir sterilite ve ölüm.
- Medya ile 9-nokta plakanın bir kuyu doldurun ve (siyah pleksiglas bir parça iyi çalışır) Karanlık bir yüzeyin üstüne yerleştirin. Kuyunun altındaki kesme kapsamı Odak.
- Kullanımı # 5 Dumont forseps (bu iyi dominant el kullanılarak yapılır) tek elle bir tek kadın almak. Bu kanatlar, bacaklar, karın ya da geçiş toraks tarafından kadın almak için genellikle kolay değildir. De dolu medyada kadın Batmak. Gerektiği gibi mikroskop odağı ayarlayın.
- Dominant olmayan elde tutulan forseps ikinci bir çifti kullanarak, karın ön ucundaki kadın kapmakarka uç dominant elin (Şekil 2A) doğru konumlandırılmış böylece. Medyada batık sinek tutmak için emin olun.
- Dominant elin ile, 2. en arka pigmente segmentte manikür kapmak ve uzak karın (Şekil 2B-C) geri kalanından rip forseps kullanabilir.
- Yumurtalıklar (Şekil 2D-E) ortaya kadar dominant el forseps kullanarak, yavaşça karın ön ucunu sıkın. Gerekirse, iki yumurtalık arasında forseps yerleştirin ve karkas çekip çıkarın.
- Taze medya (Şekil 2F) ile yeni bir kuyuya yumurtalıklar taşımak veya bir Kimwipe'dan veya kağıt havlu karkas kaldırın. Bu köklerinin in vitro gelişimi için izole edilmektedir bu özellikle önemlidir.
- Yumurtalıkların 3-5 çiftleri izole edilmiştir kadar tekrarlayın. NOT: Her over ~ 16 ovarioles veya sırayla olgunlaşan folikül zincirlerinden oluşur. Her ovariolekas kılıf içinde bulunur.
- Pin vises ve onlarla verilen iğneler kullanarak, yavaşça ovarioles (Şekil 2G) arasındaki iğneler çalıştırarak yumurtalık ayrı çekin. Bu bazen de bireysel folikülleri yayınlayacak.
- Bireysel ovarioles ve folikül gelişiminin kolayca ayırt morfolojik aşamaları artık görünür (Şekil 2G, ayrı alay yumurtalık) olmalıdır. Şekiller 1 ve farklı aşamalarında ayırt etmek için kullanılabilir morfolojik farklılıklar için 2H bakınız. Bozulmamış ovarioles içinde ve hala bir kas kılıf içinde bulunan folikül ayırmak için, hemen ilgi folikül aşağıdaki önceki folikül anterior ve folikül posterior ovariole genelinde kesmek için bir iğne kullanın. Bu kas kılıfı kıracak ve uzak ilgi folikül artık zarar vermeden uzak komşu köklerinin kesilebilir. Tek tek aşamalar ayrılır gibi, taze ortam ile yeni bir oyuğuna, bir cam pipet ile, ilgi konusu köklerinin hareket eder. In vitro gelişimi için köklerinin izole edilmesi, bu özellikle önemlidir. NOT: Bu iyi boyunca ilgi foliküllerini dağıtarak hava kabarcıklarını engellemek için ortamı girmeden önce pipet ampul sıkmak için önemlidir. Folikül cam pipet yapışmasını ise ek olarak, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez BSA çözeltisi pipetle ve kesme ortamı ile durulanarak% 3 sığır serum albümin (BSA) ile kaplanmış olabilir.
- Yeterli folikül izole edildikten sonra, daha sonraki deneyler devam edin.
S10B Foliküllerinden 3. In vitro Geliştirme
- IVEM medyada aşama izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak S10B köklerinin izole. Folikülleri hızla uzak enkaz taşınmış olduğundan emin olun. Bu foliküllerin olgunlaşmaya devam edeceği gibi, bu impo olduğuS10Bs 30-60 dakika boyunca toplanmış ve daha sonra tercih edilen olgunlaştırma ortamına yerleştirilir ki rtant. NOT: S10B S10A folikülleri IVEM kültür ortamında olgun olmayacak gibi dikkatli, (1B karşılaştırıldığında Şekil 1C) S10A köklerinin ayırt edilmesi gerekir. S10A ve S10B köklerinin her ikisinde de, uzunluğunun yarısı hemşire hücrelerden oluşan ve diğer yarısı, oosit, ancak S10B içinde folikül uzunluğu S14 köklerinin eşittir.
- Bir cam pipet kullanılarak, bir 24-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya ~ 30 S10B folikül hareket eder. NOT: aktarılıyor köklerinin tüm S10B ve S11 için olgunlaştığını değil doğrulamak için emin olun.
- Yani IVEM medya artı farmakolojik reaktifler, kuyu başına olgunlaşma medya 1 ul hazırlayın.
- Çekti cam pipet * kullanarak, mümkün olduğunca kuyuda (adım 3.2) kadar medyayı çıkartın ve hızlı bir şekilde seçim olgunlaşma medya ekleyebilirsiniz. NOT: Bu çekti cam pip kullanmak esastırsahnelenen folikül olarak ette kolayca Pipetman cam pipetler veya pipet uçları ile ya kadar alınabilir.
* Çekti pipetler yapmak için: 1) cam yumuşamaya başlar sadece kadar bir Bunsen brülör alev uzun, cam pipetler ince kısmını ısıtmak; 2) hemen alevin dışında pipet taşımak ve içine pipet çekmek için yatay olarak çekin daha ince bir tüp; 3) ince bir nokta oluşturmak için bölünürler. DİKKAT: cam parçaları kapalı uçabilirsiniz gibi göz koruması kullanın. - Deneme gerektirir tekrarlayın gibi birçok kuyu için 3,1-3,4 adımları.
- Folikül> 10 saat boyunca geliştirmek ve diseksiyon kapsamında gelişimsel ilerlemesini puan verin. NOT: Deneyler genellikle köklerinin geliştirmek için yeterli zaman tanımak için ertesi gün puanlanır. S10B ~ 5 saat olan, S11 ~ 30 dk, S12 ~ 2 saat ve S13 biraz daha uzun sürer, oda sıcaklığında 25 ° C 1 ve geliştirme, süresi ~ 1 hr. S10B köklerinin için tarif edilene benzer deneyler olabilir,S11-S13 folikül kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
4. Canlı Görüntüleme Sahne izolasyonu
- Çabucak enkaz folikülleri hareketli, IVEM medyada aşama izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak seçim floresan işaretleyici ifade geç evre foliküllerini (S10B-14) izole.
- Yeni medya içine ilgi folikülleri taşıyın ve daha sonra bir lamel alt Petri plaka cam pipetle aktarın. Bu lamel alt bölgede kabarcıklar ama üzerinden dökülmemesi kalmaması medya eklemek için özen gösterin.
- Daha uzun bir zaman atlamalı filmler için, bu Petri plakanın iç kenarı, su ile nemlendirilmiş bir rulo Kimwipe ekleyerek Petri plakası içinde nem sağlamak için bazen gereklidir. Üst kapağı yerleştirin.
- Ters bir mikroskop görüntüsü. Ayrıntılı çözünürlüklü konfokal mikroskopi gerektirir. Bu görüntüleme, aydınlatma gücü, ve görüntüleme uzunluğu frekansını dengelemek için gerekli olduğunu, bu bağımsız olarak her l için çalıştım gerekecektirabeling aracı ve gelişim süreci.
5. Preparasyon mRNA izolasyonu için Aşama
- Grace ya IVEM medya ile ya aşamalı izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak bireysel sahne köklerinin izole.
- Bir cam pipet kullanılarak, ortam ile yeni bir kuyu içine ilgilenilen tek tek aşamaları hareket, bir kerede bir çok aşamaları toplamak mümkündür.
- 1 saat altında toplama saatleri tutun. 1.5 ml mikrofüj tüplerine, bir cam pipet ile, folikül hareket ettirin.
- Köklerinin her pelet için bir mini-mikrosantrifüjde kısaca tüp spin. Çekti cam pipet (adım 3.4) kullanılarak dikkatlice tüm medya çıkarın. NOT: Bir tam boy mıkro kullanıyorsanız, düşük hızda köklerinin aşağı doğru döndürün.
- TRIZOL 100 ul ekleyin ve bir plastik tokmak kullanılarak ~ 20 saniye boyunca elle eziyet. Mikrosantrifuj'de tam hızda aşağı Spin ve herhangi topaklandı d rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni bir 1.5 ml mikrofuge'de tüp Trizol hareketebris. -80 ° C'de saklayın
- Follikül yeterli deney için elde edilinceye kadar tekrarlayın 5,1-5,5 adımları. Rutin, ~ 75 S10B, ~ 75 S12 ve S14 ~ 100 köklerinin RNA ~ 10 mikrogram verim.
- Buz örnekleri çözülme. Bir mikrofuj tüpüne uygun olarak, örnek birleştirmek ve 800 ul kadar Trizol ses getirmek. Üretici tarafından yönlendirildiği gibi RNA izolasyonu ile devam edin. ÖNEMLİ: RNazsız DNase ile izole RNA tedavisi DNase'ının unutmayın.
6. Western Blot için Sahne izolasyonu
- 100 ° C bir ısıtma bloğu ısıtın
- Grace ya IVEM medya ile ya aşamalı izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak bireysel sahne köklerinin izole. NOT: Bu ampirik her özel protein gözlemlemek için gerekli olan nasıl belirli bir aşama folikül birçok belirlemek gereklidir. Derece olarak ifade edilen proteinleri de 1-3 S10B foliküllerinin / batı lekelerinin güçlü bir sinyal görmek için yeterlidir. Bununla birlikte, bunu yapmak için önemli olan birtemsili bir örnek, birden çok kadın folikülleri alıyor. Bu nedenle, belirli bir aşamasında 15-20 köklerinin genellikle toplanır.
- Bir 1.5 ml mikrofüj tüpe bir cam pipet kullanarak, folikül hareket ettirin. (Adım 5.4) köklerinin pelet için bir mini-mikrosantrifüjde kısaca Spin. Dikkatle (adım 3.4) çekti cam pipet kullanarak ortamların tümünü çıkarın ve 1x PBS 50 ul ve 2x Laemmli tampon 50 ul ekleyin.
- Plastik bir havan tokmağı ile 20 sn ~ için elle eziyet. NOT: Plastik havan yıkanarak batı örnekleri öğütme ve onları otoklav için tekrar edilebilir.
- Isıtma bloğu içinde 10 dakika için örnekleri kaynatın.
- Mikrosantrifuj'de 15 saniye boyunca tam hızda buz ve spin kısaca Chill. Hemen -20 ° C 'de, bir SDS-PAGE jeli üzerine ya da mağaza yük ya NOT: örnekleri kaydedilirse, jel üzerine yüklemeden önce örnekleri reboil unutmayın.
- , Standart protokolleri takiben western blot analizi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila folikül gelişiminin belirli aşamaları izole zaman doğru bir şekilde farklı morfolojik aşamaları ayırt edebilmek için gereklidir. Hemşire hücreleri ve oosit her (Şekil 1B 1C karşılaştırıldığında) bu aşamada folikül yarısı uzunluğunu almak gibi bu, S10A ve S10B için biraz zordur. S10B köklerinin tam olarak uzatılmış ve bir S14 folikül (1 g ile karşılaştırıldığında Şekil 1C) uzunluğunda ve böylece eşit gibi Ancak, S10A folikülleri, S10B köklerinin daha uzunluğu kısadır. Buna ek olarak, merkezcil folikül hücreleri adı oosit üzerindeki folikül ya da somatik hücrelerinin bir alt hemşire hücreleri ve S10B da oosit arasında geçiş başlar. S11 de hemşire hücreler sözleşme, oosit içine sitoplazmik içeriğini sıkma böylece ~ 5 saat sürer S10B sırasında, hemşire hücreler dinamik aktin yeniden geçmesi. Böylece S11 de, hemşire hücre bölgesi varoosit (Şekil 1D) genişletilmiş ise önemli ölçüde azalmıştır. S12 de, hemşire hücreleri ölümünün geçmesi ve bir daha opak bir görünüm (Şekil 1E) almaya başlar; ilginç, kültür, S12 köklerinin hemşire hücre kalıntıları kıvırmak dorsal ('Rakamlarla 3C'-D S12s bakınız). S13 sırasında hücre ölümü tamamlandı ediliyor gibi, hemşire hücre bölge şeffaf, ve dorsal apendiks oluşumu (Şekil 1F) meydana geliyor. S14 ile sadece oosit ve folikül hücrelerin kalır ve dorsal ek formasyonu (Şekil 1G) tamamlanır.
In vitro gelişimi tahlili (bkz. Şekil 3) damping S10B gelişimi ve hücre hemşire çeşitli farmakolojik tedaviler ve genetik mutasyonların sonuçlarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültüründe S10Bs gelişimi, ancak bir dizi faktör zayıf deneysel sonuçlara yol açabilir, sağlamdır. Şekil 3A içinde,Başarılı ve başarısız bir deney hem de deneysel veriler sağlanmaktadır. Başarılı bir deney, kontrol ortamı içinde yabani tipte köklerinin% 80-100 tam hemşire hücre damping ve S12-14 ilerleme hangi bir (Şekil 3A, ağırlıkça 1). Bazen, vahşi tip kontrol köklerinin az% 80 (Şekil 3A, ağırlıkça 2) geliştirmek, yani başarısız olur. Vb) S10B folikülleri S10A ayırt etmek 1) yetersizlik (Şekil 1 ve 2'ye bakınız), 2) medya sorunları (sıcaklık, yaş, ve / veya 3) folikül vardı:. Bu başarısızlık gibi konularda bir dizi neden olabilir çok uzun süre enkaz maruz.
S10Bs in vitro gelişimi farmakolojik tedavisi ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Bu tür deneyler için, ilaç kontrol, ilaç ile vahşi tip köklerinin, yani tedavi, her bir deneyde gerçekleştirilir olması önemlidir, çünkü ilaç etkinliği ve / veya concentratiyon zamanla değişebilir. Farmakolojik deneyler için, bu kontrol ortam içinde bu için ilaç tedavisi gelişen folikül yüzdesinin oranını analiz etmek uygundur, bu küçük farklar için genetik arka plan kontrol eder. Bu, ilacın IC50 konsantrasyonu ile tedavi etmek için yararlı olur, bu bloklar, vahşi tip (yw)% 50 oranında boşaltma ve daha da geliştirilmesi hemşire hücre geçiren köklerinin olduğu konsantrasyondur. . Ve blok, Bu nedenle, vahşi tür foliküllerin için bu oran 0.5 (Şekil 3B, ilaç 1) olması beklenir Şekil 3B, bir ilaç (aspirin) (çözücü buharlaşma olasılığı nedeniyle ilaç 2) çok konsantre hale nasıl bir örnektir 50'den daha fazla geliştirmesini, vahşi tip köklerinin%. Bundan başka, in vitro gelişimi tahlili açıklamak için, gelişen S10B folikül iki kuyu görüntüleri verilmiştir. Şekil 3C ve D başında S10B köklerinin açıklamaktadırdeney, kontrol ya da tedavi aspirin (~ 2 mM) media. Şekil 3C 've D' ortaya, tahlilin sonuna göstermektedir ki aspirin tedavi köklerinin çoğunluğu değil ise, S14 için geliştirilen kontrol tedavi köklerinin çoğunluğu tamamlanmış hemşire hücre damping.
In vitro deney geliştirme, aynı zamanda, belirli bir ilaca karşı daha duyarlı olan genetik arka taranması için de kullanılabilir. Şekil 3E, bu iki örnekleri içerir. Tersine, İkinci örnekte, genetik arka planı (expt2, kırmızı bar) aspirinin etkisini artırır, birinci örnekte, genetik arka planı (expt1, mavi bar) oranı en az yaklaşık 0.5 kalır aspirin ile etkileşim başarısız olur. Bu nedenle, in vitro gelişimi tahlili oogenezisin geç ortaya çıkan gelişimsel ve morfolojik olaylara mutasyonlar ve farmakolojik reaktifler sonuçlarını tanımlamak için kullanılabilir, ilave olarak, deney (9) farmakolojik ve genetik etkileşimleri hem de değerlendirmek için de kullanılabilir.
Aşama izolasyon gelişim süreçleri canlı görüntüleme için de kullanılabilir. 4 utrophin-GFP, yeşil floresan protein kaynaşmış insan utrophin aktin bağlama alanı ifade eden bir S10B folikül bir zaman atlamalı film bir örnektir Şekil. Bu görüntüleme aracı, aktin demet oluşumu ve yoğunlaşmayı kullanılarak görüntülenebilir. Birçok araç protein tuzak transgenik hatları 16,17 dahil olmak üzere canlı görüntüleme için kullanılabilir, tahrik UAS floresan organel belirteçleri ekledi (mitokondri, golgi, endoplazmik retikulum, vs.), Tahrik UAS floresan aktin ve aktin bağlayıcı proteinler, mikrotübül (sitoskeletal işaretçileri etiketlendi ve mikrotübül) bağlayıcı proteinleri, ifade eden bir transjenik soy, floresan (Nile Red) Edu etiket DNA, FM4-64 etiketler membranlar kopyalayan, nötr lipitleri etiketler ilgi protein ve vital boya etiketli.
ove_content "> Moleküler analizler, Drosophila köklerinin izole edilmiş katı ile yapılabilir. western blotting ile protein analizi için, deneysel olarak, belirli bir gelişme aşamasında, ilgi konusu proteini gözlemlemek için gerekli olan kadar çok sayıda folikül belirlemek gereklidir. Şekil 5 ardışık olarak, belirli bir protein, fascin gözlemlemek için gerekli S10B folikül sayısını belirlemek için konsantre edilmiş bir protein lizat seyreltilmesi için nasıl bir örnektir. bu durumda, bir S10B folikül western blotting ile bu proteini gözlemlemek için yeterlidir.
Şekil 1.. Şeması orta-geç evrede Drosophila fol morfolojik farklılığı gösteren Drosophila köklerinin ve görüntülerin hücresel kompozisyonu anlatanlicles. bir S10A folikül. BG hücresel bileşimini gösteren A. Şeması. diseksiyon kapsamı stereo kullanılarak çekilen S10A-S14 Drosophila köklerinin Temsilcisi görüntüler. ~ 650 somatik kaynaklı epitel hücreleri (beyaz, kırmızı ve mavi, A ile çevrilidir 1 oosit (kırmızı, A) ve 15 hemşire veya destek hücreleri (sarı, A): Drosophila folikül 16 germlıne türetilmiş hücrelerden oluşur .) S10A olarak, folikül uzunluğunun yarısı germe folikül hücreleri (A kırmızı) ile kaplıdır hemşire hücreleri (sarı aparatı, B) oluşmaktadır, ve diğer yarısı oosit (kırmızı yıldız oluşmaktadır , B), burada ana gövde folikül hücreleri A (beyaz) ile kaplanmıştır. S10B de, hemşire hücreleri (sarı dirsek, C) ve oosit (kırmızı yıldız, C) Her le yarısını oluşturanFolikül ngth Ancak folikülünün toplam uzunluğu artık S14 folikül (G C karşılaştırın) bu eşittir. S11 sırasında, hemşire hücreleri (sarı dirsek, D) hızla aktin / miyozin bağımlı sürecinde uzatma oosit (kırmızı yıldız, D) onların sitoplazmik içeriğini sıkmak damping hemşire hücre olarak adlandırılır. S12 ile, oosit (kırmızı yıldız, E) tam tam ve sadece hemşire hücre kalıntıları (E sarı dirsek) kalır hemşire hücre damping olduğu gibi uzatılmış oldu. Hemşire hücre kalıntıları S13 de (sarı dirsek, F) tam hücre ölümü. S14 dorsal uzantıların (beyaz oklar, G). B. Ölçü bar = 0.1 mm olmak üzere oosit (kırmızı yıldız işareti, G), somatik hücrelerin ve yumurta kabuğu, oluşan tam olgun folikül temsil eder.
Şekil 2.. Görüntüler yumurtalık diseksiyon ve folikül tecrit bir bakış sağlamak. A. diseksiyon medyada sinek daldırın ve dominant olmayan el, forseps tarafından, düzenlenen böylece onu yönlendirin. B. baskın eli kullanarak, karın posterior manikür kapmak. C. manikür çekin, yumurtalık (sarı ok) açığa. posterior doğru karın ön Çalışma D., yavaşça yumurtalıkların (sarı ok) serbest karın sıkın. E. kalan manikür yumurtalıkların (sarı ok) Ayrı (kırmızı ok ucu) ve / veya iç organları (beyaz ok başları). F. taze iyi içeren diseksiyon medya izole yumurtalıklar aktarın. G. Tease dışında yumurtalıklar, diseksiyon iğneler kullanılarak, indi maruzram folikül (ayrılmış yumurtalık (alt) için sağlam yumurtalığı (üst) karşılaştırın. bir bıçakladı S10B folikül, daha sonraki deneyler. H. Seçin ilgi morfolojik aşamaları (Aşamaları 10A için kullanılmamalıdır bir folikül bir örneğe Beyaz ok puan -14 (S10A-S14)) gösterilmiştir.
Şekil 3,. In vitro gelişimi tahlillerin örnekleri. S10B yüzdesinin A. tablosu kültüründe bu tam gelişme köklerinin. 2 wt kültüründe zayıf gelişme (% 68 gelişen) bir örnek ise ağırlıkla 1, vahşi tip S10B foliküllerin (% 96 gelişmekte) beklenen gelişme bir örnektir. Kontrol ortam içindeki yabani tip S10B folikül gelişimi% 80 altında ise, tipik olarak, bütün deney iptal olur. B. 50 ihtiva eden ortam içinde (dev.) gelişen S10B folikül yüzdesi oranının uymaktadır. Bu, vahşi tip değeri ± 0.5 olması gerektiği anlamına gelir; IC50 blok geliştirmesini S10B köklerinin% 50 olduğu konsantrasyondur. Ilaç 2 ilaç konsantrasyonu (0.37). CD'si çok güçlü olduğu zaman ne olur bir örnek ise ilaç 1, beklenen vahşi tip oranı (0.52) bir örneğidir '. In vitro gelişimi kuyuların Görüntüleri. CC'. Kontrolü işlemden geçirildi. DD tahlilin son noktasında köklerinin. görüntü '. Aspirin tahlilde. C'-D başlangıcında S10Bs (± 2 mM). CD. Image tedavi'. Control '(aspirin tedavi köklerinin çoğunluğu D) damping hemşire hücre tamamlamak için başarısız olurken, S10B folikül kültürü (C)' in S14s geliştirmek tedavi.
Şekil 4. Izole S10B kullanımını gösteren örnek canlı görüntüleme için köklerinin. AF. Utrophin izole bir S10B folikül time-lapse z-yığınlarının 3 dilim Maksimum projeksiyonları :: GFP transgenik sinekleri (SQH-utrophin :: GFP). AI-F 'ifade. Büyütülmüş takmalar tek bir hemşire hücreyi vurgulayın A- F. AF '. F-aktin (utrophin :: GFP), beyaz. A, A'. Süresi (t) = 0 dak. B, B '. T = 20 dak. C, C' = 40 dak. T. = 100 dk D, D '. t = 60 dak. E.E'. t = 80 dak. F, F '. t. İlk zaman noktasında kısa aktin filamanlar hemşire hücre zarının (A, A ') içe doğru uzanan gözlenebilir. Onlar ('D, D) tam olarak uzatılmış kadar bu aktin filamentler (' A, A ile karşılaştırıldığında 'BC) erken zaman noktalarında boyunca uzamaya. Daha sonra zaman noktalarında, bu tamamen uzatılmış aktin filamentler sonra kısaltmak ve (EF ') damping hemşire hücre boyunca yoğunlaşmasına A. Ölçek çubuğu = 50 mikron. A'. Ölçek çubuğu = 10 mikron.
_upload/50493/50493fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. Gelişim Çalışmaları; western blot analizi ile belirli bir proteini incelemek için gereken folikül sayısını belirlemek için nasıl Şekil 5 İllüstrasyon Bu S10B folikül (1:20, sn 7C, Cooley, L. Fascin ifade bakarak bir western leke olduğunu Hibridoma Bankası (DSHB), NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242) tarafından yapılmaktadır. Üstünde sayılar şeride yüklendi S10B folikül yaklaşık sayısını temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila folikül morfolojik ve moleküler analizlerin her ikisi için de idealdir, hücre tipleri çok az sayıda oluşmaktadır. Üstelik, yumurtalık yapısına, ortak bir kesme alanı ve en az eğitim ile folikül gelişiminin belirli aşamalarında çok sayıda elde etmek nispeten kolaydır. Her aşamada bir kısa zamansal pencereyi temsil gibi, sahne izolasyon bu evrede meydana gelişim süreçlerine önemli moleküler anlayışlar sağlayabilir. Örneğin, S10B, S12, S14 ve 18 sırasında meydana gelen gen ekspresyon değişiklikleri karakterize orta-geç evre folikül izolasyonu kullandık. Bu analiz, önceden karakterize edilmemiş bir gen sayıda folikül gelişmesine katkıda bulunması olasıdır, ve özellikle, kabuk oluşumuna olduğunu düşündürmektedir.
Sahne izolasyon canlı görüntüleme yoluyla morfolojik olayların içine dramatik anlayışlar sağlayabilir. Bu görüntüleme al gerçekleştirilebilir Drosophila folikül gelişiminin l aşamaları. Germarium 13, folikül uzama 19 ve evre 9 11,12,14: Bu çalışmanın odak S10B-14 iken, okuyucuların daha önceki aşamaları canlı görüntüleme için aşağıdaki makalelere adlandırılır. Bu çalışmalarda kullanılan kültür koşulları, bu çalışmada açıklanan olanlardan farklıdır. Özel olarak, bu çalışmalar, bazı durumlarda, trehaloz daha da ek olarak, metopren, 20-hidroksi ve değişken FBS (% 2,5-15) düzeyleri hem de insülin 11-13,19 ilavesiyle Schneider Böcek Medya kullanılmış ve adenozin 14 deamidase. Bu canlı görüntüleme çalışmaları önemli ölçüde gelişme bu erken aşamalarında meydana gelen olayların anlayışımızı ileri olduğunu işaret etmek önemlidir. Ancak, bu erken evre folikülleri folikül gelişimi, S14 son aşamasında tüm yol ilerleme olamaz. Tersine, S10B-13 kültür S14 geliştirmek olacaktır.
S10B-S14 birçok morfolojik işlemler sırasında> "ove_content o canlı görüntüleme ile ele alınabilir oluşabilir. Örneğin, canlı görüntüleme damping hemşire hücrenin sürecini incelemek için kullanılabilir, hemşire hücreler oosit içine sitoplazmik içeriğini sıkmak hangi işlem Bu embriyojenezinin tamamlamak gerekiyor. Hemşire hücre damping (bkz. Şekil 4) canlı görüntüleme. Devamı kullanımı floresan belirteçlerin ifade transgenik hatları kullanılarak iletilen ışık 7 veya konfokal görüntüleme kullanılarak time-lapse görüntüleme ile görülebilir her şeyi ile bunu sağlamak için bekleniyor sonraki aşamalarında hemşire hücre damping için gerekli sitoskeletal dinamikleri yeni bakış açıları sağlayacaktır. Canlı görüntüleme ayrıca dorsal uzantı taslakları göç ve tubulogenesis 10 anlayışımızı ilerlemiştir.S10B-S13 folikül geliştirilmesinde vitro meydana gelen süreçler üzerindeki farmakolojik reaktifler ve genetik manipülasyonlar iki etkilerini tanımlamak için kullanılabilirBu süre boyunca çalacak. Biz 7 damping hemşire hücre düzenlenmesinde prostaglandinlerin rol kurmak için S10B köklerinin vitro geliştirilmesinde kullanılmıştır. Sonradan bir farmakolojik-etkileşim ekran gerçekleştirmek için bu testte kullanıyorum; aktin regülatör bir kopyasının kaybı artırır veya hemşire hücre prostaglandinlerin kaybı nedeniyle kusurları damping bastırır eğer özellikle, biz test edilmiştir. Bu ekran varsayılan aşağı hedefler (9 ve Spracklen, Meyer ve Tootle, yayınlanmamış veri) bir dizi ortaya koymuştur. Tahlil, aynı zamanda, (9, bakınız, bu bir örnek için) iki farklı faktörler nedeniyle heterozigot için, hemşire boşaltma hücresinde bir blok olarak gelişim kusurlar, değerlendirerek genetik etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
Oldukça basit bir işlemdir orta-geç evrede Drosophila köklerinin olduğu izole ederken, optimum başarı için kritik bir dizi faktör vardır. İlk olarak, sinekler hazırlanmasıdırçok önemli. Bu flakon başına sineklerin sayısının, erkeklerde (2:1 oranı idealdir) için kadınların oranı yani, mümkün olduğunca benzer bir durumda sinekler farklı genotipleri korumak ve sürekli taze, ıslak maya sağlamak için en iyisidir. Besleme (ıslak maya) ve diseksiyon zaman gelişimin farklı aşamalarında yaygınlığı değiştirecektir. Bu sinekler sürekli sabah beslendiği zaman daha S12s öğleden sonra mevcut ise, daha S10Bs sabah, izole edilebileceğini bulduk. İkinci bir kritik faktör ortamdır. In vitro gelişimi ve canlı görüntüleme için taze IVEM ortam hazırlamak için gereklidir. Buna ek olarak, ortam aktin ve mikrotübüller, hem soğuk ortam cytoskeletons değiştirecektir oda sıcaklığına gelmeye gerekir ve bu nedenle, daha da geliştirilmesi bozabilir. O uzakta enkaz folikülleri tutmak da önemlidir. Bazen, diseksiyon sırasında, bağırsak yumurtalıklar ile çıkacaktır. Biz bulduk bağırsak yırtılması halindeve folikül kirlenmiş ortam içinde tutulur, köklerinin kültüründe geliştirmek için olası değildir. Folikülleri kültür geliştirmeye devam ederken, in vitro gelişimi ya da moleküler analizler ya geçmeden önce diseksiyonu sonrası evreleme doğrulama için esastır. Son olarak, bu deneyler için uygun kontroller olması önemlidir. In vitro gelişimi için, bu medya, normal geliştirme (80-100% tamamlandı hemşire hücre damping) için izin verdiğini test etmek için yabani tip folikül kullanmak, ve (bkz. Şekil 3) beklendiği gibi farmakolojik reaktifler hareket olduğunu test etmek için gereklidir.
Sonuç olarak, orta-geç evre Drosophila köklerinin izolasyon deneysel çeşitli teknikler yoluyla gelişim süreçlerine önemli fikir verebilir.
Özel reaktifler ve ekipman Tablo:
| Reaktifi Adı | Şirket | Kedialogue numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
|---|---|---|---|
| Aktif Kuru Maya | Genesee Bilimsel | 62-103 | Aktif Kuru Maya herhangi bir kaynak gayet |
| Grace Böcek Media | Lonza | 04-457F | |
| Isı ile inaktive edilmiş fetal Sığır Serumu | Atlanta Biyolojik | S11050H | Herhangi Isı İnaktive FBS çalışması gerekir |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises ve İğneler | Ted Pella, Inc | 13561-10 | |
| Nokta Tabak, Dokuz Şey | Corning | 7220-85 | |
| 5. Dumont forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | |
| 24, çok-yuvalı plakalar | Becton Dickinson | 35 3226 | Herhangi 24-yuvalı doku kültürü çanağı çalışmalıdır |
| Alt Yemekleri Coverslip (35 mm) | MatTek A.Ş. | P35G-1.0-14 C | Lamel kalınlığı mikroskop / nesnel kullanılan bağlıdır |
| Cam pipetler | Corning | 7095B-5x (köklerinin aktarmak için) 7095B-9 (çekti pipetler üretmek için) | |
| Numune pestle (1.5 ul; Rnaz / DNaz) | Araştırma Ürünleri Uluslararası | 199228 | 1.5 ul mikrofuge'de tüpleri uyan herhangi bir plastik tokmak kullanılabilir |
| Trizol | Invıtrogen | 15596-018 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz reaktifler için Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: GFP hattı), Bloomington Stok Merkezi'ni ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası'na teşekkür etmek istiyorum. Biz daha yazının yararlı tartışmalar ve eleştiriler için Tootle Lab tüm üyelerini teşekkür ederim. Dan fon Ulusal Bilim Vakfı MCB-1158527, ve Anatomi ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nden start-up fonları, Iowa Üniversitesi bu çalışmaları destekledi. Farmakolojik Bilimler T32GM067795 Sağlık predoctoral Eğitim Grant National Institutes AJS desteklenmektedir. Veri depolama desteği Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Grant UL1RR024979 yoluyla Translational Bilimler, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen CTSA yoluyla finanse edilmektedir ICTS tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
