Summary
אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.
Abstract
תאים אנושיים לא ללא הגבלת זמן להתרבות. על הרמזים חיצוניים ו / או פנימיים, תאים עלולים למות או להיכנס לעצירת מחזור תא יציב הנקראת הזדקנות. כמה מנגנונים תאיים, כמו התקצרות הטלומרים וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic, הוכחו לגרום להזדקנות. הזדקנות אינה מוגבלת לתאים נורמלים; כבר דיווחו תאים סרטניים גם להזדקן.
תרופות Chemotherapeutical הוכחו לגרום להזדקנות בתאים סרטניים. עם זאת, נותר שנוי במחלוקת בין ההזדקנות מונעת או מקדמת tumorigenesis. כפי שסופו של דבר עשוי להיות מטופל ספציפי, שיטה מהירה ורגישה להערכת הזדקנות בתא סרטני בקרוב תידרש.
לשם כך, assay הסטנדרטי β-גלקטוזידאז, שיטה המשמשת כיום, מציגה חסרונות עיקריים: זה זמן רב ולא רגיש. אנו מציעים כאן assay מבוסס cytometry זרימה ללמוד הזדקנות על live תאים. assay זה מציע את היתרון של להיות מהיר, רגיש, ויכול להיות בשילוב לimmunolabeling של סמנים תאיים שונים.
Introduction
מאז ראשית שנות השישים וגילויו על ידי Hayflick ומורהד, הזדקנות עדיין נשארה סקרנות סלולרית 1. תאים אנושיים לא לזמן בלתי מוגבל ולהתרבות, על ידי הזדקנות, Hayflick ומורהד טבעו את התהליך הסלולרי של הזדקנות. הזדקנות היא עצירת מחזור תא יציב שבו תאים נשארים פעילים מטבולית בניגוד למוות תאי. נכון להיום, ארבעה מנגנונים תאיים הוכחו לגרום להזדקנות: התקצרות הטלומרים, נזק לדנ"א, הפרעות הכרומטין, וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic 2. זה מצביע על כך לא רק תאים נורמלים, אלא גם תאים סרטניים מסוגלים לעבור הזדקנות 3. כעניין של עובדה, תאים סרטניים שעברו הזדקנות הוצגו מהווים מכשול להתקדמות נוספת 4-5 גידול. עם זאת, מספר דוחות החברה ציינו כי, בנסיבות מסוימות, הזדקנות תאית יכולה גם לקדם ממאירות 6-7. לומד הזדקנות של הסרטן celLS עומד להיות דחף בחקר הסרטן המשמש כיום כתרופות כימותרפיות יכולות להוביל להזדקנות של תאים סרטניים במבחנה לא רק, אלא גם in vivo 8.
Assay האדון לחקור את הימצאותם של תאים מזדקנים הוא assay β-גלקטוזידאז ב-pH חומצי. assay histochemical זה משקף את העלייה בbiogenesis lysosomal מתרחש ברוב התאים מזדקנים. בקצרה, אקסוגני X-gal, הוחל לתאים, הוא ביקע ידי β-גלקטוזידאז המועשר בlysosomes של תאים מזדקנים, והוליד צבע כחול 9. לאחר מכן ניתן לכמת את התאים המזדקנים הכחולים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. אמנם פופולרי מאוד, assay β-גלקטוזידאז מציג חסרונות עיקריים. ראשית, assay זה מתבצע בתאים קבועים. שנית, זה זמן רב, משום שמשתמע לכמת את מידת ההזדקנות על ידי ספירת מספר גבוה באופן משמעותי של תאים מזדקנים תחת מיקרוסקופ. שלישית, assay זהאינו רגיש לאפליה בין תאים מזדקנים ואינם senescent לחלוטין מסתמכת על המתבונן.
אנו דנים כאן assay בלתי מנוצל, מהיר, ורגיש המבוסס על cytometry להעריך את הימצאותם של תאים מזדקנים חיים. assay זה מבוסס על הידרוליזה של מולקולה חדירה קרום, 5 dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C 12 FDG), על ידי β-גלקטוזידאז מועשר בתאים מזדקנים. לאחר הידרוליזה ועירור לייזר, FDG C 12 פולט הקרינה ירוקה ולכן יכול להיות מזוהה על ידי זרימת cytometry 10, 11. זיהוי של תאים מזדקנים באמצעות cytometry הזרימה מציע את היתרון של להיות מהיר ורגיש מאוד. בנוסף לכך, זיהוי של תאים מזדקנים ידי cytometry הזרימה יכול להיות בשילוב עם זיהוי של סמנים תאיים אחרים. assay זה יכול לשמש כדי לזהות תאים מזדקנים בתוך אוכלוסייה של תאים סרטניים שטופלו בכימותרפיה וניתן להגדיר באופן שגרתיעל סעיפי רקמות, לאחר הניתוק סלולרי, במרפאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת C12FDG, bafilomycin A1 ותא התרבות
- ממיסים את אבקת 12 C FDG בsulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 20 מ"מ. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. DMSO יש להשתמש בתנאי בטיחות מתאימים.
- ממיסים את אבקת bafilomycin A1 ב DMSO לריכוז סופי של 0.1 מ"מ. Aliquot וחנות ב - 20 ° C. Bafilomycin יש להשתמש בתנאי בטיחות מתאימים.
- טפח את קו RPMI 8226 תא, או שורות תאים אחרות חסיד או לא, באמצעי תקשורת המכיל 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה 1%, על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאמוד את מספר התאים הדרושים לצורך הניסוי. כדי להקליט מספר מספיק של אירועים במהלך ניתוח תזרים cytometry, 5 x 10 5 תאים נדרשים. כדי לקבוע את אחוז התאים המזדקנים, שלוש דגימות תאים נדרשות: מדגם ללא תווית, תאים שלא טופלו מוכתמים ב12 C FDG, תאים שטופלו מוכתמיםC 12 FDG.
- זרעי 24 שעות לפני ביצוע תאי הניסוי, כך שתאים נמצאים בשלב של יומן עקומת התרבות התאים.
2. אינדוקציה של הזדקנות
- לגרום להזדקנות של תאים סרטניים על ידי הוספת תרופת chemotherapeutical. ריכוז תרופה ומשך הטיפול צריך להיות מותאם לסוג התא הנבדק. התחל עם טיפול שעה 48 בריכוז הסופי של דוקסורוביצין ננומטר 50 לריכוז של תאים בכ 10 6 תאים / מ"ל. אל תשכח לכלול מדגם מטופל (ביקורת שלילית).
3. טיפול bafilomycin A1
- בדקו כדאיות תא על ידי תאי ערבוב עם trypan הכחול (V / V), כתרופת chemotherapeutical משמשת בשלב הקודם עלולה להוביל לאפופטוזיס התא. מלא לתוך תא Malassez ולספור את מספר התאים הכחולים (תאים מתים) ושל תאים לבנים (תאי חיים). אם אחוז הכדאיות הוא פחות מ -70%, תאים מתים יכולים להיות REMoved באמצעות ערכה מתאימה כדי להבטיח שלא יהיו תאים מתים הטיה הניתוח שלאחר מכן.
- הסר את תקשורת התרבות ולהחליף על ידי תקשורת והתרבות טרי prewarmed. פנק את התאים עם ריכוז סופי של של bafilomycin A1 100 ננומטר. Bafilomycin A1 משמש כדי לנטרל את ה-pH חומצי של lysosomes. דגירה שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
4. מכתים C 12 FDG
- ממיסים C 12 FDG בתקשורת והתרבות טרי prewarmed לריכוז סופי של 2 מ"מ.
- הוסף את המתחם לתאים בריכוז סופי של 33 מיקרומטר ודגירת שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אם אתם משתמשים בתאים שאינם חסיד, צנטריפוגה תאי XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C (המהירות אולי צריכה להיות מותאמת לסוג התא בשימוש), לשטוף 2x עם PBS. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS הקר. אם אתם משתמשים בתאים חסיד, להסיר את המדיה ולשטוף 2x עם PBS. לקצור את התאים חסיד באמצעות פתרון טריפסין ו צנטריפוגותתאי XG 300 דקות 5 ב 4 ° C (המהירות אולי צריכה להיות מותאמת לסוג התא בשימוש). Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS הקר. בשני המקרים, ריכוז התא צריך להיות כ 10 6 תאים / מ"ל.
- לבצע שיתוף immunolabeling לאפיין את האוכלוסייה של תאים מזדקנים נוסף.
5. ניתוח cytometry זרימה
- כייל את cytometer הזרימה באמצעות חרוזים הבקרה מומלצים על ידי היצרן של cytometer הזרימה. לכל הצעדים, 10 4 לפחות אירועים צריכים להיות מוקלטים.
- הפעל את המדגם הראשון המכיל תאים ללא תווית. הכן את ערוץ שני פרמטר גרפי המציג פיזור קדימה (FSC) לעומת צד ערוץ פיזור (SSC). הגדר את הצינורות מכפיל (PMTs) ולהגדיר את אזור של עניין לא כולל תאים מתים ופסולת תאיים שאולי הופיעו במהלך הכנת המדגם. אזור זה של שער ריבית ביסטוגרמה חד פרמטר הצגת FL1 בסולם היומןשל ציר ה-x ואת מספר האירועים בציר ה-Y. המספר הכולל של אירועים מייצג את מספר התאים נותחו. הגדר את PMT כך שתאים ללא תווית מופיעים בעשור הראשון בסולם היומן של ציר x. לקבוע autofluorescence של התאים במידת צורך.
- הפעל את המדגם השני המכיל תאים שלא טופלו. על ההיסטוגרמה חד פרמטר הצגת FL1 (הקרינה של 12 C FDG), הצב את הסמן אחרי האוכלוסייה שכותרתו במעומעם. סף זה יאפשר אפליה בין תאים שאינם מזדקנים (תאים שכותרת עמומה) ותאים מזדקנים (תאים שכותרתו במאור פנים).
- הפעל את המדגם השלישי המכיל תאים שטופלו. מאור שכותרתו תאים, תאים מזדקנים כלומר מופיעים מעל הסף שנקבע בשלב הקודם. להעריך את אחוז התאים המזדקנים ידי חלוקת מספר האירועים בהירים במספר הכולל של אירועים. במידת צורך, ניתן גם העריך את הפעילות של β-גלקטוזידאז באמצעות הקרינה הממוצעתאינטנסיביות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיאלומה נפוצה, גידול ממאיר המטולוגיות, שימש כדי להעריך את ההזדקנות נגרמת על ידי הליך chemotherapeutical. כדי לעשות זאת שורת תאי MM זמינה מסחרי (RPMI 8226) טופלה במשך 2 ימים עם דוקסורוביצין, תרופת chemotherapeutical. התאים אז היו נתונים לטיפול A1 bafilomycin וטופחו עוד יותר עם C 12 FDG. תאים נותחו על ידי cytometry הזרימה. איור 1 מדגים את השלבים ותוכניות שונים שאחוז התאים המזדקנים ניתן לקבוע תוך יום עם השימוש של C 12 FDG. תאים ללא תווית הורצו לראשונה בcytometer הזרימה. כפי שמוצג באיור 2 א, אזור של עניין נקבע על FSC הגרפי לעומת SSC להוציא תאים מתים ופסולת תאיים. תאים באזור זה של עניין היו אז מגודר על ההיסטוגרמה מציגה את הקרינה של C 12 FDG (FL1) על ציר ה-x ואת מספר האירועים על ציר ה-Y. בתאים שלא טופלו נותחו.סמן אדום נקבע לאחר שאוכלוסיית שהכותרת עמומה כאיור מתואר 2B: תאים מזדקנים שאינם יופיעו באזור U, ואילו תאים מזדקנים יהיו נוכחים באזור נ 'תאים שטופלו היו לרוץ לאחר מכן בcytometer הזרימה. אוכלוסייה של תאים שכותרתו בהירה הופיעה מעל הסמן האדום נקבע בעבר, באזור V, כפי שניתן לראות איור 2 ג (פנל משמאל). אוכלוסייה זו מייצגת תאים מזדקנים, ולאחר מכן ניתן לחשב את שיעורם. במקביל, באותה דגימת התאים הייתה מוכתמת באמצעות assay β-גלקטוזידאז כמאויר (פנל מימין). בתמונת נציג זה, תאים כחולים לגמרי ותאים באופן חלקי כחולים מוצגים כדי להמחיש את הקושי להבחין תאים מזדקנים באמת כחולים.
כדי להמחיש את הספציפיות של C 12 FDG בקביעת אחוז התאים מזדקנים, טופלו בתאים עם ריכוז שונים של דוקסורוביצין. אחוזתאים מזדקנים היה נחוש כמו באיור 2. אחוז של עליות תאים בהירות כפונקציה של ריכוז דוקסורוביצין משמש כמוצג באיור 3. זה מוכיח כי C 12 FDG תיוג ספציפי לתאים מזדקנים.
איור 1. תאים הכוללים ערכה של הניסוי. היו זורעים 1 24 שעות לפני הטיפול בתרופת chemotherapeutical 2. ביום של הניסוי, תאים הודגרו עם bafilomycin A1 3 ולאחר מכן עם C12FDG 4. תאים ולאחר מכן נותחו בcytometer הזרימה 5.
איור 2. ניתוח cytometry זרימה. () אזור של wa הענייןים נקבע על FSC העלילה לעומת SSC להוציא תאים מתים ופסולת תאיים. (ב) בתאים שלא טופלו נוהלו בcytometer את הזרימה ואת הסמן האדום נקבע. (ג) התאים שטופלו היו לרוץ בcytometer הזרימה. את התאים המזדקנים הופיעו מעל הסמן האדום. U ו-V מייצגים את האזורים של עניין, תאים מזדקנים ואינו senescent כלומר, בהתאמה. (ד ') במקביל (מדגם זהה, אותו טיפול), התאים היו מוכתמים באמצעות assay β-גלקטוזידאז. שים לב למידה השונות של הצביעה של התאים (תאים כחולים לחלוטין, תאים באופן חלקי כחולים), הממחישה את הקושי לקבוע סף המאפשר אפליה של תאים מזדקנים. קדימה ערוץ פיזור (FSC), סייד ערוץ פיזור (SSC), 1 פלואורסצנטי (FL1).
איור 3. סגוליות של 12 CFDG תיוג. תאים שטופלו 5 (היסטוגרמה אפור כהה), 25 (היסטוגרמה אפורה בהירה) ו50 ננומטר (היסטוגרמה לבנה) של דוקסורוביצין. U מייצג את האזור המכיל תאים שאינם מזדקנים. אחוז התאים המזדקנים מוערך על ידי חלוקת מספר האירועים בהירים למספר הכולל של אירועים. את האחוזים של תאים מזדקנים הם 0.8%, 15.78%, 26.31% למינון של 5, 25, 50 ודוקסורוביצין ננומטר, בהתאמה.
| C12FDG assay | assay β-גלקטוזידאז | |
| רגישות | + | - |
| עלות | = | = |
| תפוקה | + | - |
| משך assay | - | + |
| תחולה על סוג התא | = | = |
| תאים | תא חי | תא קבוע |
| דרישה לציוד מיוחד | cytometer הזרימה | מיקרוסקופ שדה הבהיר |
טבלת מס '1. . יתרונות וחסרונות של assay 12 C FDG cytometry מבוסס וβ-גלקטוזידאז assay) + (מקבילים לדרגה גבוהה יותר בזמן (-) ו( =) מתאים למעלות קלות ומקבילות, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצגנו כאן שיטה המבוססת על זרימת cytometry לכמת הזדקנות תאית בתאי סרטן חיים. שיטה זו מבוססת על השימוש במתחם החדיר הקרום, FDG C 12, ולכן יכולה לשמש בכל סוגי תאים, ולאחר טיפולים שונים, כל עוד המתחם הוא נלקח על ידי התאים. על ספיגת הסלולר, FDG C 12 הוא הידרוליזה על ידי β-גלקטוזידאז, מועשר בlysosomes של תאים מזדקנים. לאחר עירור לייזר, המתחם פולט הקרינה ירוקה, המאפשר כימות של תאים מזדקנים. כימות זה של הקרינה הירוקה יכול להיעשות על ידי cytometry זרימה או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, במקרה זה, תאי ניאון יצטרכו לסמוך על ידי הצופה, שדורשים זמן. מאז FDG C 12 הוא הידרוליזה על ידי β-גלקטוזידאז, שיטה זו מאפשרת, בנוסף לכימות של תאים מזדקנים, לכמת את הפעילות של β-גלקטוזידאזוהלוקליזציה של האנזים, בעיקר מציגה בשלפוחית lysosomal. למרות שהשיטה היא פשוטה, תשומת לב צריכה להיות נמשך בשלב 3. זיהוי המוצלח של תאים מזדקנים בעיקר מסתמך על pH של lysosomes הנכון. כדי לעשות זאת, השתמשנו bafilomycin A1 לנטרל את ה-pH חומצי של lysosomes. בהתאם לסוג התא בשימוש, ייתכן שלא יהיה צורך בצעד זה. אם ההזדקנות צפויה ולא מכתים מזוהה, אנו ממליצים לכלול ביקורת שלילית לbafilomycin A1 (לא bafilomycin) וכדי להגדיל את הריכוז של bafilomycin A1. אם כך, יש לוודא כי גידול זה אינו לגרום למוות של תאים. לחלופין, ניתן להחליף bafilomycin A1 עם chloroquine או כל תרכובות אחרות כי הם מסוגלים להגדיל את ה-pH של lysosomes.
באמצעות הפרוטוקול המתואר, אנו לכמת בהצלחה את אחוז התאים המזדקנים בתאי מיאלומה נפוצות לאחר טיפול דוקסורוביצין תוך יום. פרוטוקול זה יכול לשמש בothסוגי תאים סרטניים ER, אלא גם בסוגי תאים שאינם סרטניים. Assay β-גלקטוזידאז פופולרי יתר על המידה, שעבורו גם חייב להיות מבוקר pH הסלולרי, דורש לפחות 2 ימים. ואכן הצבע הכחול מרבית, המתקבל לאחר המחשוף של X-gal על ידי β-גלקטוזידאז, מושגת לאחר 12-16 שעות של דגירה 9. assay זה הוא אפוא זמן רב יותר מאשר assay מבוסס cytometry המוצעת. יתר על כן, assay זה אינו רגיש משום שתא כחלחל עלול להיחשב כתא senescent בעת היותו לא באמת senescent. את טבלת 1 מסכם את היתרונות וחסרונות לשני השיטות.
היתרון השני של שיטה זו הוא שהיא יכולה להיות בשילוב עם immunostaining של מקבלי פני שטח תא. במקרה של מיאלומה נפוצה, זה אפשר לנו להראות שתאי גזע סרטניים מיאלומה נפוצה לא להזדקן טיפול דוקסורוביצין הבא, בעוד שתאי גזע שאינם סרטניים לעשות 12. הזדקנות הוכח להיות אנטי סרטני פרו ו. מאז תרופות יכולות לגרום להזדקנות chemotherapeutical, לומד הזדקנות עשויה להיות חשוב במרפאה. לשם כך, מבחני מהירים ורגישים צריכים להיות בשימוש, כגון assay שתארנו כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים SF 4206 ICORE (אוניברסיטת דה קאן) עבור השימוש במתקן cytometry. JC קיבל מלגות לפוסט דוקטורט מConseil d'דה Radioprotection EDF וConseil האזורי של נורמנדי התחתי. נתונים אלה היו חלק מפרויקטים שמומנו על ידי Ligue Nationale contre le הסרטן - Comités de l'אורן et du קלבדוס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
