Summary
Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.
Abstract
Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren. Bei externen und / oder intrinsische Signale könnten Zellen sterben oder geben Sie einen stabilen Zellzyklus genannt Seneszenz. Mehrere zellulären Mechanismen, wie Telomerverkürzung und abnormale Expression mitogene Onkogene, haben gezeigt, dass Seneszenz bewirken. Seneszenz nicht auf normalen Zellen beschränkt; Krebszellen haben auch berichtet, altern.
Chemotherapeutika wurde gezeigt, Seneszenz in Krebszellen zu induzieren. Es bleibt jedoch umstritten, ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung. Als es schließlich könnte Patienten-spezifischen, wird eine schnelle und empfindliche Methode zur Seneszenz in Krebszelle beurteilen bald erforderlich sein.
Zu diesem Zweck stellt die Standard-β-Galactosidase-Assay wird die aktuell verwendete Methode, wesentliche Nachteile: es ist zeitaufwendig und nicht empfindlich. Wir schlagen hier eine Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Seneszenz auf li studierenve Zellen. Dieser Test hat den Vorteil, dass eine schnelle, empfindliche und können zur Immunmarkierung von verschiedenen zellulären Marker gekoppelt werden.
Introduction
Seit Anfang der sechziger Jahre und seiner Entdeckung durch Hayflick und Moorhead, Seneszenz bleibt eine zelluläre Neugier 1. Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren und durch Seneszenz Hayflick und Moorhead den zellulären Alterungsprozess geprägt. Seneszenz ist eine stabile Arretierung des Zellzyklus in dem Zellen metabolisch aktiv bleiben, um Zelltod entgegen. Bisher wurden vier zellulären Mechanismen gezeigt, Seneszenz induzieren: Verkürzung der Telomere, DNA-Schäden, Chromatin Störung und abnormale Expression von Onkogenen mitogene 2. Dies deutet darauf hin, dass nicht nur normale Zellen, sondern auch Krebszellen sind in der Lage, Seneszenz 3 zu unterziehen. In der Tat wurden Krebszellen unterziehen Seneszenz gezeigt, um eine Barriere zur weiteren Tumorprogression 4-5 darstellen. Allerdings haben einige Berichte nun darauf hin, dass unter bestimmten Umständen, zelluläre Seneszenz kann auch die Förderung Bösartigkeit 6-7 hingewiesen. Studieren Seneszenz von Krebs cells ist im Begriff, ein Drang in der Krebsforschung als derzeit verwendeten Chemotherapeutika können Seneszenz von Krebszellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo 8 führen werden.
Die Master-Assay, um das Vorhandensein von alternden Zellen zu untersuchen ist β-Galactosidase-Assay bei saurem pH-Wert. Diese histochemischen Test spiegelt die in lysosomalen Biogenese vorkommenden in den meisten alternden Zellen erhöht. Kurz gesagt, wird exogene X-gal, die auf Zellen von β-Galactosidase in Lysosomen von alternden Zellen angereichert gespalten, was zu einer blauen Farbe 9. Die blauen alternden Zellen können dann unter einem Hellfeld-Mikroskop quantifiziert werden. Obwohl sehr beliebt, stellt die β-Galactosidase Assay große Nachteile. Zuerst wird dieser Test auf fixierte Zellen durchgeführt. Zweitens ist es sehr zeitaufwendig, weil es um den Grad der Seneszenz durch Zählen eine signifikant hohe Anzahl von alternden Zellen unter einem Mikroskop zu quantifizieren impliziert. Drittens, dieser Testnicht empfindlich ist als die Unterscheidung zwischen alternden und nicht-alternden Zellen ganz auf die Betrachter.
Wir diskutieren hier ein ungenutztes, schnell und empfindlich Durchflusszytometrie basierende Assay auf das Vorhandensein von lebenden alternden Zellen beurteilen. Dieser Assay auf der Hydrolyse von einer Membran durchlässig Molekül, das 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG) basiert, durch β-Galactosidase in alternden Zellen angereichert. Nach der Hydrolyse-und Laser-Anregung emittiert der C 12 FDG grüne Fluoreszenz und kann daher mittels Durchflusszytometrie 10, 11 detektiert werden. Der Nachweis von alternden Zellen via Durchflusszytometrie bietet den großen Vorteil, dass sie schneller und empfindlicher. Darüber hinaus kann die Erfassung von alternden Zellen mittels Durchflusszytometrie mit der Detektion von anderen zellulären Marker gekoppelt werden. Dieser Test kann verwendet werden, um alternde Zellen in einer Population von Krebszellen mit einer Chemotherapie behandelt werden, erkennen und kann routinemäßig eingestellt werdenauf Gewebeschnitten nach zellulären Dissoziation, in der Klinik.
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Protocol
1. Herstellung von C12FDG, Bafilomycin A1 und Zellkultur
- Man löst den C 12 FDG Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer Endkonzentration von 20 mM. Aliquot und bei -20 ° C DMSO sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden.
- Man löst den bafilomycin A1 Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 0,1 mM. Aliquot und lagern bei - 20 ° C. Bafilomycin sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden.
- Kultivieren RPMI 8226-Zellinie, oder andere Zelllinien haftende oder nicht, in Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum und 1% Antibiotika, bei 37 ° C, 5% CO 2. Schätzen der Anzahl von Zellen für das Experiment benötigt. Um eine ausreichende Anzahl von Ereignissen in der Durchflusszytometrie aufgezeichnet werden 5 x 10 5 Zellen erforderlich. Um den Prozentsatz der alternden Zellen bestimmen, drei Zellproben erforderlich: für unmarkierte Proben, unbehandelte Zellen, die mit C 12 FDG gefärbt, behandelte Zellen angefärbt mitC 12 FDG.
- Seed die Zellen 24 Stunden vor Durchführung des Experiments so dass die Zellen in der log-Phase der Zellproliferation Kurve sind.
2. Induktion von Seneszenz
- Induce Seneszenz von Krebszellen, indem Sie eine chemotherapeutische Medikament. Drug Konzentration und Dauer der Behandlung sollte der Zelltyp getestet angepasst werden. Beginnen mit einer 48-Stunden-Behandlung in einer Endkonzentration von 50 nM Doxorubicin für eine Konzentration der Zellen bei etwa 10 6 Zellen / ml. Vergessen Sie nicht, unbehandelten Probe sind (negative Kontrolle).
3. Bafilomycin A1 Behandlung
- Überprüfen Zelllebensfähigkeit durch Mischen von Zellen mit Trypanblau (v / v), die chemotherapeutische Medikament in dem vorhergehenden Schritt verwendet werden, um die Apoptose führen könnten. Füllen Sie in eine Kammer Malassez und zählen die Anzahl der blauen Zellen (tote Zellen) und der weißen Blutkörperchen (lebende Zellen). Wenn der Prozentsatz der Lebensfähigkeit ist weniger als 70%, vielleicht toten Zellen rem seinoved Verwendung eines geeigneten Kit, um sicherzustellen, dass tote Zellen nicht beeinflussen die nachfolgende Analyse.
- Entfernen Sie die Kulturmedien und ersetzen durch vorgewärmte frische Kulturmedien. Behandeln der Zellen mit einer Endkonzentration von 100 nM bafilomycin A1. Bafilomycin A1 wird verwendet, um den sauren pH der Lysosomen zu neutralisieren. Inkubieren 1 h bei 37 ° C, 5% CO 2.
4. C 12 FDG Färbung
- Auflösen C 12 FDG in vorgewärmte frische Nährmedien in einer Endkonzentration von 2 mM.
- In der Verbindung zu den Zellen mit einer Endkonzentration von 33 uM und inkubiert 2 h bei 37 ° C, 5% CO 2. Bei der Verwendung von nicht-haftenden Zellen zentrifugiert, die Zellen bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C (die Geschwindigkeit haben könnte, um den verwendeten Zelltyp angepasst werden), 2x mit PBS waschen. Zellpellet in 500 ul kaltem PBS. Bei Verwendung von anhaftenden Zellen, entfernen Sie die Medien und waschen 2x mit PBS. Ernten Sie die anhaftenden Zellen unter Verwendung einer Trypsin-Lösung und ZentrifugeZellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C (die Geschwindigkeit möglicherweise zum verwendeten Zelltyp eingestellt werden). Zellpellet in 500 ul kaltem PBS. In beiden Fällen sollte die Zellkonzentration etwa 10 6 Zellen / ml.
- Führen Sie eine Co-Immunmarkierung weiter zu charakterisieren, die Bevölkerung von alternden Zellen.
5. Durchflusszytometrie
- Kalibrieren des Durchflusszytometer unter Verwendung der Steuerung Perlen vom Hersteller des Durchflusszytometer empfohlen. Für alle Schritte müssen mindestens 10 4 Ereignisse aufgezeichnet werden sollen.
- Führen Sie die erste Probe, die unmarkierten Zellen. Bereiten Sie eine Zwei-Parameter-Grafik Anzeige Forward Scatter Channel (FSC) gegen Side Scatter Channel (SSC). Stellen Sie die Photomultiplier Tubes (PMT) und definieren Sie einen Bereich von Interesse außer abgestorbenen Zellen und Zelltrümmer, die während der Probenvorbereitung erschien haben könnte. Tor diese Region von Interesse in einer Ein-Parameter-Histogramm, FL1 auf der logarithmischen Skalader x-Achse und die Anzahl von Ereignissen in der y-Achse. Die Gesamtzahl der Ereignisse die Anzahl der analysierten Zellen. Stellen Sie die PMT so dass unmarkierten Zellen in der ersten Dekade erscheinen auf der logarithmischen Skala der x-Achse. Bestimmen Sie die Autofluoreszenz der Zellen, wenn nötig.
- Führen Sie die zweite Probe, die unbehandelten Zellen. Auf der Ein-Parameter-Histogramm, FL1 (Fluoreszenz von C 12 FDG), platzieren Sie den Cursor nach der schwach markierten Bevölkerung. Diese Schwelle wird es die Unterscheidung zwischen nicht-alternden Zellen (schwach markierten Zellen) und alternden Zellen (hell markierten Zellen).
- Führen Sie die dritte Probe, die behandelten Zellen. Hell markierten Zellen scheinen also alternden Zellen über dem Schwellenwert in dem vorherigen Schritt bestimmt. Bewerten Sie den Prozentsatz der alternden Zellen, indem die Zahl der hellen Ereignisse pro Gesamtzahl der Veranstaltungen. Falls erforderlich, kann die Aktivität der β-Galactosidase auch unter Verwendung der mittleren Fluoreszenz werdenIntensität.
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Representative Results
Multiples Myelom, eine hämatologische Malignität, wurde verwendet, um das Altern von einem chemotherapeutischen Verfahren induziert bewerten. Dazu muss ein handelsübliches MM-Zelllinie (RPMI 8226) für 2 Tage mit Doxorubicin, einem chemotherapeutischen Medikament behandelt wurde. Die Zellen wurden dann bafilomycin A1 unterzogen und weiter mit C 12 FDG inkubiert. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Schritte und zeigt, dass der Prozentsatz der alternden Zellen innerhalb eines Tages bei der Verwendung von C 12 FDG bestimmt werden. Unbeschriftet Zellen wurden zunächst im Durchflusszytometer laufen. Wie in 2A gezeigt, wurde ein Bereich von Interesse auf die Grafik FSC gegen SSC gesetzt, um tote Zellen und Zelltrümmer auszuschließen. Die Zellen in dieser Region des Interesses standen dann gated auf dem Histogramm, das die Fluoreszenz des C 12 FDG (FL1) auf der x-Achse und die Anzahl der Ereignisse auf der y-Achse. Die unbehandelten Zellen wurden analysiert. Arote Cursor wurde nach der schwach markierten Bevölkerung dargestellt Abbildung 2B gesetzt: nicht alternde Zellen werden in der Region U erscheinen, während alternde Zellen werden in Region vorhanden V. Die behandelten Zellen wurden danach in das Durchflusszytometer laufen. Eine Population von hell markierten Zellen erschien über dem roten Cursor zuvor eingestellten, in der Region V, wie gezeigt 2C (linkes Bild). Dieser Teil der Bevölkerung repräsentiert alternden Zellen und deren Prozentsatz kann anschließend berechnet werden. Parallel dazu wurde die gleiche Zelle Probe gefärbt mit der β-Galactosidase Assay wie dargestellt (rechts). In dieser repräsentativen Bild, sind völlig blauen Zellen und teilweise blauen Zellen gezeigt, um die Schwierigkeit, wirklich blau alternden Zellen unterscheiden zu illustrieren.
Um die Spezifität der C 12 FDG bei der Bestimmung des Anteils an alternde Zellen veranschaulichen, wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin behandelt. Der Anteil deralternden Zellen wurde, wie in 2B bestimmt. Der Anteil der hellen Zellen erhöht sich in Abhängigkeit von der Doxorubicin-Konzentration verwendet, wie in Abbildung 3 dargestellt. Dies zeigt, dass C 12 FDG Kennzeichnung spezifisch für alternde Zellen ist.
Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Zellen wurden 1 h 24 vor der Behandlung mit dem chemotherapeutischen Wirkstoff 2 ausgesät. Am Tag des Experiments wurden die Zellen mit Bafilomycin A1 3 und dann mit C12FDG 4 inkubiert. Die Zellen wurden dann auf dem Durchflusszytometer 5 analysiert.
Abbildung 2. Durchflusszytometrie. (A) ein interessierender Bereich was bestimmt auf dem Grundstück FSC gegen SSC um tote Zellen und Zelltrümmer auszuschließen. (B) Die unbehandelten Zellen im Durchflusszytometer wurden durchgeführt und der rote Cursor gesetzt wurde. (C) Die behandelten Zellen im Durchflusszytometer wurden ausgeführt. Die alternden Zellen erschien über dem roten Cursor. U und V repräsentieren die Regionen von Interesse, dh nicht seneszenten und alternden Zellen. (D) Parallel (dieselbe Probe, derselbe Behandlung) wurden die Zellen angefärbt mit der β-Galactosidase-Assay. Beachten Sie die unterschiedlichen Grad der Färbung der Zellen (blaue Zellen vollständig, teilweise blaue Zellen), die die Schwierigkeit, einen Schwellenwert ermöglicht die Unterscheidung von alternden Zellen eingestellt veranschaulicht. Forward Scatter Channel (FSC), Side Scatter Channel (SSC), Fluoreszenz 1 (FL1).
Abbildung 3. Besonderheit des C 12FDG Kennzeichnung. Die Zellen wurden mit 5 (dunkelgrau Histogramm), 25 (hellgrau Histogramm) und 50 nm (weiß Histogramm) von Doxorubicin behandelt. U steht für die Region, die nicht-alternden Zellen. Der Anteil der alternden Zellen wird ermittelt, indem die Anzahl der Ereignisse pro hell die Gesamtzahl der Ereignisse bewertet. Die Prozentsätze der alternden Zellen sind 0,8%, 15,78%, 26,31% bei einer Dosis von 5, 25 und 50 nM Doxorubicin sind.
| C12FDG Assay | β-Galactosidase Assay | |
| Empfindlichkeit | + | - |
| Kosten | = | = |
| Durchsatz | + | - |
| Assay Dauer | - | + |
| Anwendbarkeit auf Zelltyp | = | = |
| Cells | Live-Zelle | Feste Zelle |
| Voraussetzung für die spezielle Ausrüstung | Durchflusszytometer | Hellfeld-Mikroskop |
Tabelle 1. . Vor-und Nachteile des C 12 FDG Durchflusszytometrie basierende Assay und der β-Galactosidase-Assay (+) entspricht höheren while (-) und (=), um kleinere und gleichwertigen Grad entsprechen.
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Discussion
Wir präsentierten hier eine Durchflusszytometrie basierende Methode, um zelluläre Seneszenz in lebenden Krebszellen zu quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Verwendung der Membran durchlässig Verbindung, die C 12-FDG Basis und kann daher in allen Zelltypen und nach verschiedenen Behandlungen verwendet werden, solange die Verbindung von den Zellen aufgenommen. Nach Aufnahme in die Zelle ist die C 12 FDG hydrolysiert durch die β-Galactosidase, in Lysosomen von alternden Zellen angereichert. Nach Laseranregung emittiert die Verbindung grüne Fluoreszenz, so dass für die Quantifizierung von alternden Zellen. Diese Quantifizierung der grünen Fluoreszenz kann entweder durch Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. In diesem Fall wird fluoreszierenden Zellen von dem Beobachter gezählt werden und erfordert Zeit. Da die C 12 FDG hydrolysiert wird durch die β-Galactosidase, ermöglicht diese Methode, neben der Quantifizierung von alternden Zellen, um die Aktivität der β-Galactosidase quantifizierenund die Lokalisierung des Enzyms, meist in lysosomale Vesikel zu präsentieren. Obwohl das Verfahren ist einfach, sollten ihr Augenmerk auf Schritt 3 gezogen werden. Die erfolgreiche Erkennung von alternden Zellen meist beruht auf der richtigen pH der Lysosomen. Um dies zu tun, haben wir Bafilomycin A1, um den sauren pH-Wert von Lysosomen zu neutralisieren. Je nach Zelltyp, dieser Schritt nicht erforderlich. Wenn Seneszenz erwartet wird und keine Färbung festgestellt wird, schlagen wir vor, eine negative Kontrolle für Bafilomycin A1 (kein Bafilomycin) umfassen und die Konzentration von Bafilomycin A1 erhöhen. Wenn Dabei darauf achten, dass diese Erhöhung nicht induziert Zelltod. Alternativ kann bafilomycin A1 mit Chloroquin oder andere Verbindungen, die in der Lage, den pH-Wert erhöhen Lysosomen substituiert sein können.
Mit dem beschriebenen Protokoll haben wir erfolgreich den Prozentsatz der alternden Zellen beim multiplen Myelom-Zellen nach Behandlung mit Doxorubicin innerhalb eines Tages quantifiziert. Dieses Protokoll kann in oth verwendet werdener Krebszelltypen, sondern auch in Nicht-Krebs-Zelltypen. Die beliebte und überstrapaziert β-Galactosidase Assay, für die die zelluläre pH auch kontrolliert werden müssen, erfordert mindestens 2 Tage. In der Tat die maximale blaue Farbe, nach der Spaltung von X-gal durch die β-Galactosidase erhalten wird, wird nach 12 erreicht - 16 h Inkubation 9. Dieser Assay ist daher mehr Zeit in Anspruch als die vorgeschlagene Durchflusszytometrie basierende Assays. Außerdem ist dieser Test nicht empfindlich, weil eine bläuliche Zelle Alterungszellenantigen gezählt werden könnten, während sie nicht wirklich senescent. Die Tabelle 1 faßt die Vorteile und Nachteile der beiden Techniken.
Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es mit der Immunfärbung von Zelloberflächen-Hersteller verbunden werden kann. Im Fall von multiplem Myelom, hat dies erlaubt uns zu zeigen, dass multiple Myelom Krebsstammzellen nicht altern folgende Behandlung mit Doxorubicin, während Nicht-Krebs-Stammzellen 12 zu tun. Seneszenz hat sich gezeigt, dass pro-und anti-tumorigenen. Da Chemotherapeutika Seneszenz induzieren kann, könnte das Studium Seneszenz werden in der Klinik wichtig. Zu diesem Zweck müssen schnelle und empfindliche Tests verwendet, wie der Assay wir hier beschrieben werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken dem SF 4206 ICORE (Université de Caen) für die Nutzung der Durchflusszytometrie Anlage. JC erhielt Post-Doc-Stipendien aus Conseil de Strahlenschutz d'EDF und Conseil Régional der Basse-Normandie. Diese Daten wurden im Rahmen von Projekten von der Ligue Nationale contre le Cancer finanziert - Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
