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Medicine

Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

Published: August 2, 2013 doi: 10.3791/50494

Summary

Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.

Abstract

As células humanas não proliferar indefinidamente. Após a estímulos externos e / ou intrínseco, as células podem morrer ou entrar em uma parada do ciclo celular estável chamado de senescência. Vários mecanismos celulares, tais como o encurtamento dos telómeros e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos, têm sido mostrados para causar a senescência. A senescência não está restrita às células normais, as células cancerígenas têm também sido relatada a senescência.

Agentes quimioterápicos têm demonstrado induzir a senescência das células cancerosas. No entanto, permanece controverso se a senescência impede ou promove a carcinogênese. Como se pode, eventualmente, ser específico para cada paciente, um método rápido e sensível para avaliar a senescência celular no cancro logo será necessária.

Para este fim, o ensaio padrão β-galactosidase, o método utilizado correntemente, apresenta inconvenientes importantes: é demorado e não é sensível. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria de estudar senescência em live células. Este ensaio tem a vantagem de ser rápido, sensível e pode ser acoplada ao imunomarcação de vários marcadores celulares.

Introduction

Desde o início dos anos sessenta e sua descoberta por Hayflick e Moorhead, senescência ainda permanece uma curiosidade celular 1. As células humanas não indefinidamente proliferar e, por senescência, Hayflick e Moorhead cunhou o processo de envelhecimento celular. A senescência é uma paragem do ciclo celular estável em que as células permanecem metabolicamente activa em oposição à morte celular. Até à data, quatro mecanismos celulares têm sido mostrados para induzir a senescência: encurtamento dos telómeros, danos no ADN, perturbação da cromatina e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos 2. Isto indica que não só as células normais, mas também as células cancerígenas são capazes de sofrer a senescência 3. Por uma questão de facto, as células de cancro sujeitos a senescência foram mostradas para constituir uma barreira para a progressão do tumor 4-5. No entanto, vários relatórios já apontou que, em determinadas circunstâncias, a senescência celular também pode promover malignidade 6-7. Estudar senescência de câncer cells está prestes a tornar-se um impulso na pesquisa do câncer, como atualmente utilizado medicamentos quimioterápicos podem levar a senescência das células cancerosas não apenas in vitro, mas também in vivo 8.

O ensaio principal para investigar quanto à presença de células senescentes, é o ensaio de β-galactosidase a um pH ácido. Este ensaio histoquímico reflecte o aumento na biogénese lisossómica ocorrendo na maioria das células senescentes. Resumidamente, exógena de X-gal, aplicada às células, é clivada pela β-galactosidase enriquecido em lisossomas de células senescentes, dando origem a uma cor azul 9. As células senescentes azul podem então ser quantificado num microscópio de campo claro. Embora muito popular, o ensaio β-galactosidase apresenta grandes inconvenientes. Em primeiro lugar, este ensaio é efectuado em células fixadas. Em segundo lugar, é demorado porque implica para quantificar o grau de senescência por contagem de um número significativamente maior de células senescentes, sob um microscópio. Terceiro, este testeNão é tão sensível a discriminação entre as células senescentes e não senescentes inteiramente depende do observador.

Discute-se aqui, um ensaio baseado em citometria rápido e sensível para avaliar inexplorado para a presença de células senescentes vivos. Este ensaio baseia-se na hidrólise de uma molécula da membrana permeável, o 5-di-dodecanoylaminofluorescein β-D-galactopiranósido (C 12 FDG), por β-galactosidase enriquecida em células senescentes. Depois da hidrólise e da excitação do laser, a 12 C FDG emite fluorescência verde e pode, portanto, ser detectada por citometria de fluxo 10, 11. A detecção de células senescentes através de citometria de fluxo tem a grande vantagem de ser rápida e sensível. Além disso, a detecção de células senescentes, por citometria de fluxo pode ser combinada com a detecção de outros marcadores celulares. Este ensaio pode ser usado para detectar células senescentes dentro de uma população de células cancerígenas tratadas com quimioterapia, e pode ser rotineiramente ajustadose em cortes de tecidos, após a dissociação celular, na clínica.

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Protocol

1. Preparação de C12FDG, bafilomicina A1 e Cultura de Células

  1. Dissolve-se o pó C 12 FDG em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 20 mM. Alíquota e armazenar a -20 ° C. DMSO deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas.
  2. Dissolve-se o pó A1 bafilomicina em DMSO para uma concentração final de 0,1 mM. Alíquota e armazenar a - 20 ° C. Bafilomicina deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas.
  3. Cultivar a linha de células RPMI 8226, ou outras linhas de células aderentes ou não, em meios contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO 2. Estimar o número de células necessárias para o experimento. A fim de registar um número suficiente de eventos durante a análise de citometria de fluxo, 5 x 10 5 células são necessários. Para determinar a porcentagem de células senescentes, são necessárias três amostras de células: Amostra sem rótulo, as células não tratadas marcadas com C 12 FDG, células tratadas corados comC 12 FDG.
  4. Sementes das células 24 h antes do experimento de realização de modo a que as células estão na fase de log da curva de proliferação celular.

2. A indução da senescência

  1. Induzir a senescência das células cancerosas, adicionando um medicamento quimioterápico. Concentração da droga e da duração do tratamento deve ser adaptado ao tipo de célula testada. Comece com um tratamento de 48 horas com a concentração final de 50 nM para a doxorrubicina numa concentração de células de cerca de 10 6 células / ml. Não se esqueça de incluir amostra não tratada (controle negativo).

3. Bafilomicina A1 Tratamento

  1. Verificar a viabilidade celular em células de mistura com azul de tripano (v / v), com o medicamento quimioterápico utilizado no passo anterior pode levar à apoptose celular. Encher uma câmara de Malassez e contar o número de células azuis (células mortas) e de glóbulos brancos (células vivas). Se a percentagem de viabilidade for inferior a 70%, as células mortas pode ser removed usando um kit adequado para assegurar que as células mortas não influenciará a análise subsequente.
  2. Remova os meios de cultura e substituir por novos meios de cultura pré-aquecido. Tratar as células com uma concentração final de 100 nM de bafilomicina A1. Bafilomicina A1 é utilizado para neutralizar o pH ácido dos lisossomos. Incubar 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2.

4. C 12 FDG Coloração

  1. Dissolve-se 12 C FDG em meios de cultura fresco pré-aquecido, a uma concentração final de 2 mM.
  2. Adicionar o composto às células na concentração final de 33 uM e incubar 2 h a 37 ° C, 5% de CO 2. Se utilizar as células não aderentes, centrifugar as células a 300 xg por 5 min a 4 ° C (a velocidade pode ter que ser ajustada para o tipo de célula utilizado), lavar 2x com PBS. Ressuspender o sedimento celular em 500 uL de PBS frio. Se estiver usando células aderentes, remova a mídia e lavar 2x com PBS. Colher as células aderentes utilizando uma solução de tripsina e centrifugaras células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (a velocidade pode ter que ser ajustada para o tipo de célula utilizado). Ressuspender o sedimento celular em 500 uL de PBS frio. Em ambos os casos, a concentração de células deve ser de cerca de 10 6 células / ml.
  3. Realizar um co-imunomarcação para caracterizar ainda mais a população de células senescentes.

5. Análise de Citometria de Fluxo

  1. Calibrar o citómetro de fluxo, utilizando os grânulos de controlo recomendadas pelo fabricante do citómetro de fluxo. Para todas as etapas de, pelo menos, 10 eventos de 4 têm de ser registadas.
  2. Executar a primeira amostra contendo células não marcadas. Prepare a dois parâmetros gráfico exibindo Canal Forward Scatter (FSC) versus Side Canal Scatter (SSC). Defina os tubos fotomultiplicadores (PMT) e definir uma região de interesse excluindo as células mortas e restos celulares que poderiam ter aparecido durante a preparação da amostra. Portão esta região de interesse de um histograma de um parâmetro FL1 exibindo na escala de logdo eixo x e o número de eventos no eixo y. O número total de eventos representa o número de células analisadas. Definir a PMT de modo que as células não marcadas aparecem na primeira década na escala de log do eixo x. Determinar a autofluorescência das células, se necessário.
  3. Executar a segunda amostra contendo células não tratadas. No histograma um parâmetro exibindo FL1 (fluorescência de C 12 FDG), coloque o cursor após a população mal rotulados. Este limite vai permitir a discriminação entre células não senescentes (células mal rotulados) e células senescentes (células vivas rotulados).
  4. Executar a terceira amostra contendo células tratadas. Brilhantemente células rotuladas, ou seja, células senescentes aparecem acima do limite determinado na etapa anterior. Avaliar a percentagem de células senescentes, dividindo-se o número de eventos brilhantes por o número total de eventos. Se necessário, a actividade de a-galactosidase β também pode ser estimada utilizando a média de fluorescênciaintensidade.

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Representative Results

Mieloma múltiplo, uma malignidade hematológica, foi utilizado para avaliar a senescência induzida por um procedimento quimioterápico. Para fazê-lo numa linha de células MM comercialmente disponível (RPMI 8226) foi tratado durante 2 dias com doxorubicina, um fármaco quimioterápico. As células foram então submetidas a um tratamento bafilomicina A1 e ainda incubadas com 12 C FDG. As células foram analisadas por citometria de fluxo. Figura 1 ilustra as diferentes etapas, e mostra que a percentagem de células senescentes podem ser determinadas dentro de um dia, com a utilização de 12 C FDG. Células não marcadas foram executados pela primeira vez no citômetro de fluxo. Como mostrado na figura 2A, uma região de interesse foi fixado no FSC vs SSC gráfico para excluir as células mortas e detritos celulares. As células nesta região de interesse foram, em seguida, fechado no histograma indica a fluorescência de 12 C FDG (FL1) no eixo x e o número de eventos no eixo y. As células não tratadas foram analisadas. Acursor vermelho foi criado depois que a população mal rotulado como figura retratada 2B: células senescentes não aparecerá na região U, enquanto que as células senescentes estará presente na região V. As células tratadas foram depois executados no citômetro de fluxo. Uma população de células intensamente marcadas apareceu vermelho por cima do cursor anteriormente definido, na região V, tal como mostrado na Figura 2C (painel da esquerda). Esta população representa células senescentes e sua porcentagem pode, posteriormente, ser calculado. Em paralelo, a mesma amostra de células foi corada usando o ensaio β-galactosidase, tal como ilustrado (painel da direita). Neste quadro representativo, as células totalmente azuis e células parcialmente azuis são apresentados para ilustrar a dificuldade de discriminar células senescentes verdadeiramente azuis.

Para ilustrar a especificidade de 12 C FDG na determinação da percentagem de células senescentes, as células foram tratadas com várias concentrações de doxorrubicina. A percentagem deAs células senescentes, foi determinada tal como na Figura 2B. A percentagem de células vivas aumenta como uma função da concentração de doxorrubicina utilizados como mostrado na Figura 3. Isto demonstra que a C 12 FDG rotulagem é específico para as células senescentes.

Figura 1
Figura 1. Células esquema geral do experimento. Foram semeados 24 1 h antes do tratamento com o fármaco quimioterápico 2. No dia da experiência, as células foram incubadas com bafilomicina A1 3 e, em seguida, com C12FDG 4. As células foram então analisadas no citómetro de fluxo 5.

Figura 2
Figura 2. A análise de citometria de fluxo. (A) uma região de interesse was determinado no lote FSC vs SSC para excluir as células mortas e detritos celulares. (B) As células não tratadas foram executados no citômetro de fluxo eo cursor vermelho foi definida. (C) As células tratadas foram executados no citômetro de fluxo. As células senescentes apareceu vermelho por cima do cursor. U e V representam as regiões de interesse, isto é, células que não senescentes e senescentes, respectivamente. (D) Em paralelo (a mesma amostra, o mesmo tratamento), as células foram coradas utilizando o ensaio β-galactosidase. Note-se a vários graus de coloração de células (células completamente azuis, células parcialmente azul), o que ilustra a dificuldade de se estabelecer um limiar permitindo a discriminação de células senescentes. Canal frente Scatter (FSC), Side Canal Scatter (SSC), fluorescência 1 (FL1).

Figura 3
Figura 3. Especificidade da C 12FDG rotulagem. As células foram tratadas com 5 (histograma cinzento escuro), 25 (luz histograma cinzento) e 50 nM (histograma branco) de doxorrubicina. L representa a região que contém as células não senescentes. A percentagem de células senescentes é avaliada através da divisão do número de eventos brilhantes por o número total de eventos. As percentagens de células senescentes são de 0,8%, 15,78%, 26,31%, para uma dose de 5, 25 e 50 nM de doxorrubicina, respectivamente.

C12FDG ensaio ensaio β-galactosidase
Sensibilidade + -
Custo = =
Vazão + -
Duração do ensaio - +
Aplicabilidade ao tipo de célula = =
Células Celular Vivo Fixo célula
Exigência de equipamento especializado Citômetro de fluxo Microscópio de campo luminoso

Tabela 1. . Vantagens e desvantagens do C 12 FDG ensaio baseado em citometria eo β-galactosidase de ensaio (+), corresponde a um grau maior ao mesmo tempo (-) e (=) correspondem aos graus menores e equivalentes, respectivamente.

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Discussion

Apresentamos aqui um método baseado em citometria de fluxo para quantificar a senescência celular em células cancerosas vivas. Este método baseia-se na utilização do composto membrana permeável, a 12 C FDG, e pode, portanto, ser utilizado em qualquer tipo de célula e depois de vários tratamentos, desde que o composto é absorvido pelas células. Após a absorção celular, a 12 C FDG é hidrolisado pela β-galactosidase, enriquecido em lisossomas de células senescentes. Após excitação laser, o composto emite fluorescência verde, permitindo a quantificação de células senescentes. Esta quantificação da fluorescência verde pode ser feita através de citometria de fluxo ou por microscopia de fluorescência. No entanto, neste caso, as células fluorescentes terá que ser contado por um observador, que exige tempo. Uma vez que a C 12 FDG é hidrolisado pela β-galactosidase, este método permite, para além da quantificação das células senescentes, para quantificar a actividade da β-galactosidasee a localização da enzima, presentes na maioria das vesículas lisossomais. Embora o método é simples, a atenção deve ser desenhado no passo 3. O êxito da detecção de células senescentes se baseia principalmente no pH correto dos lisossomos. Para isso, utilizou-se bafilomicina A1 para neutralizar o pH ácido dos lisossomos. Dependendo do tipo de célula utilizada, este passo pode não ser necessária. Se senescência é esperado e sem coloração é detectado, sugerimos a incluir um controlo negativo para a bafilomicina A1 (sem bafilomicina) e para aumentar a concentração de bafilomicina A1. Se fazê-lo, certifique-se que este aumento não induz a morte celular. Alternativamente, bafilomicina A1 pode ser substituo com cloroquina ou quaisquer outros compostos que são capazes de aumentar o pH dos lisossomos.

Utilizando o protocolo descrito, foi quantificada com sucesso a percentagem de células senescentes, em células de mieloma múltiplo após tratamento doxorrubicina dentro de um dia. Este protocolo pode ser utilizado em other tipos de células cancerosas, mas também em tipos de células não-cancerosas. O ensaio β-galactosidase populares em demasia e, para o qual o pH celular também tem de ser controlado, requer, pelo menos, 2 dias. Com efeito, a cor azul máxima, obtida após a clivagem de X-gal pela β-galactosidase, é alcançada após 12 - 16 horas de incubação 9. Este teste é, portanto, mais demorada do que o ensaio baseado em citometria proposto. Além disso, este ensaio não é sensível, pois uma célula azulado pode ser considerado como de células senescentes, não sendo verdadeiramente senescente. Tabela 1 recapitula as vantagens e desvantagens para as duas técnicas.

A outra vantagem deste método é que ele pode ser acoplado com a imunomarcação de fabricantes de superfície celular. No caso do mieloma múltiplo, isso permitiu-nos mostrar que várias células-tronco do câncer mieloma não senesce seguinte tratamento doxorrubicina, enquanto as células-tronco não-cancerosas fazer 12. A senescência tem sido mostrado para ser pró-e anti-tumorigénica. Desde agentes quimioterápicos podem induzir a senescência, estudando a senescência pode se tornar importante na clínica. Para este efeito, os ensaios rápidos e sensíveis têm de ser utilizados, tal como o ensaio foi descrito aqui.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos ao SF 4206 Icore (Université de Caen) para o uso da facilidade de citometria. JC recebeu bolsas de pós-doutorado do Conseil de Radioproteção d'EDF e Conseil Régional de Basse-Normandie. Esses dados fazem parte de projetos financiados pelo Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside Invitrogen D-2893
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Bafilomycin A1 Sigma B1793
Doxorubicin Sandoz
Trypan blue Sigma T8154
RPMI 1640 cell culture medium Lonza BE12-702
Fetal calf serum PAA Laboratories GmBH A15 101
Antibiotics Gibco 5290-018
Gallios flow cytometer Beckman Coulter A94291

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References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
  4. Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
  5. Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
  6. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
  7. Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
  8. Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  9. Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
  10. Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
  11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  12. Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).

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Cahu, J., Sola, B. A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells. J. Vis. Exp. (78), e50494, doi:10.3791/50494 (2013).

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