Summary
Que la sénescence empêche ou favorise la tumorigenèse reste controversée. Comme les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des cellules cancéreuses à vieillir, est essentiel à étudier la sénescence de proposer de nouvelles thérapies. Cependant, le test β-galactosidase standard et largement utilisé présente des inconvénients majeurs. Nous vous proposons ici un test basé sur la cytométrie flux rapide et sensible pour quantifier la sénescence.
Abstract
Les cellules humaines ne sont pas indéfiniment prolifèrent. Dès indices externes et / ou intrinsèque, les cellules peuvent mourir ou entrer un arrêt du cycle cellulaire stable appelé sénescence. Plusieurs mécanismes cellulaires tels que le raccourcissement des télomères et une expression anormale d'oncogènes mitogènes, ont été montré pour causer la sénescence. La sénescence n'est pas limitée aux cellules normales, les cellules cancéreuses ont également été signalés à vieillir.
médicaments chimiothérapeutiques ont été montré pour induire la sénescence dans les cellules cancéreuses. Cependant, il reste controversée que la sénescence empêche ou favorise la tumorigenèse. Comme il pourrait éventuellement être spécifique au patient, une méthode rapide et sensible pour évaluer la sénescence des cellules du cancer sera bientôt nécessaire.
À cette fin, le test β-galactosidase standard, la méthode actuellement utilisée, présente des inconvénients majeurs: il est temps et n'est pas sensible. Nous vous proposons ici un test basé sur la cytométrie flux d'étudier la sénescence sur live cellules. Ce test présente l'avantage d'être rapide, sensible et peut être couplé à l'immuno-marquage de différents marqueurs cellulaires.
Introduction
Depuis le début des années soixante et sa découverte par Hayflick et Moorhead, sénescence reste une curiosité cellulaire 1. Les cellules humaines ne sont pas indéfiniment prolifèrent et, par la sénescence, Hayflick et Moorhead a inventé le processus cellulaire de vieillissement. Sénescence est un arrêt du cycle cellulaire stable dans laquelle les cellules restent métaboliquement active, par opposition à la mort cellulaire. À ce jour, quatre mécanismes cellulaires ont été montré pour induire la sénescence: le raccourcissement des télomères, des dommages de l'ADN, la chromatine perturbation, et une expression anormale d'oncogènes mitogènes 2. Cela signifie que non seulement les cellules normales mais également les cellules cancéreuses sont capables de subir la sénescence 3. En fait, les cellules cancéreuses subissent sénescence ont été présentés à constituer un obstacle à la progression tumorale 4-5. Cependant, plusieurs rapports ont souligné que, dans certaines circonstances, la sénescence cellulaire peut également favoriser la malignité 6-7. L'étude de la sénescence du cancer cells est en passe de devenir un besoin en recherche sur le cancer tels qu'ils sont actuellement utilisés médicaments chimiothérapeutiques peuvent conduire à la sénescence des cellules cancéreuses non seulement in vitro mais aussi in vivo 8.
Le dosage de maître pour étudier la présence de cellules sénescentes est le test β-galactosidase à pH acide. Ce test histochimique reflète l'augmentation de la biogenèse des lysosomes se produisant dans la plupart des cellules sénescentes. Brièvement, exogène X-gal, appliqué à des cellules, est clivé par β-galactosidase enrichi dans les lysosomes des cellules sénescentes, donnant lieu à une couleur bleue 9. Les cellules sénescentes bleus peuvent ensuite être quantifiés sous un microscope en champ clair. Bien que très populaire, le dosage de β-galactosidase présente des inconvénients majeurs. En premier lieu, ce test est réalisé sur des cellules fixées. Deuxièmement, il est temps car elle implique de quantifier le degré de sénescence en comptant un nombre significativement plus élevé de cellules sénescentes sous un microscope. Troisièmement, cet essain'est pas aussi sensible que la discrimination entre les cellules sénescentes et non sénescentes repose entièrement sur l'observateur.
Nous discutons ici, un test basé sur la cytométrie rapide et sensible inexploité pour évaluer la présence de cellules sénescentes en direct. Ce dosage est basé sur l'hydrolyse de la molécule de la membrane perméable, la 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C 12 FDG), par β-galactosidase enrichie en cellules sénescentes. Après hydrolyse et une excitation laser, le C 12 FDG émet une fluorescence verte et peut donc être détecté par cytométrie de flux 10, 11. La détection de cellules sénescentes par cytométrie en flux offre le grand avantage d'être rapide et sensible. En outre, la détection de cellules sénescentes par cytométrie de flux peut être couplé avec la détection d'autres marqueurs cellulaires. Ce test peut être utilisé pour détecter les cellules sénescentes sein d'une population de cellules cancéreuses traitées avec la chimiothérapie et peut être régulièrement missur des coupes de tissus, après dissociation cellulaire, dans la clinique.
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Protocol
1. Préparation de C12FDG, bafilomycine A1 et de la culture cellulaire
- Dissoudre la poudre C 12 FDG dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 20 mM. Aliquote et conserver à -20 ° C. DMSO doit être utilisé avec des conditions de sécurité appropriées.
- Dissoudre la poudre bafilomycine A1 dans le DMSO à une concentration finale de 0,1 mM. Aliquote et conserver à - 20 ° C. Bafilomycine doit être utilisé avec des conditions de sécurité appropriées.
- Cultiver RPMI ligne 8226 de la cellule, ou d'autres lignées de cellules adhérentes ou non, dans un milieu contenant 10% de sérum de veau fœtal et 1% d'antibiotiques, à 37 ° C, 5% de CO 2. Estimer le nombre de cellules nécessaires pour l'expérience. Afin d'enregistrer un nombre suffisant d'événements au cours de l'analyse de cytométrie en flux, 5 x 10 5 cellules sont nécessaires. Pour déterminer le pourcentage de cellules sénescentes, trois échantillons de cellules sont nécessaires: échantillon non étiqueté, les cellules non traitées colorées avec C 12 FDG, les cellules traitées colorées avecC 12 FDG.
- Seed les cellules 24 heures effectue avant l'expérience afin que les cellules sont en phase logarithmique de la courbe de la prolifération cellulaire.
2. Induction de la sénescence
- Induire la sénescence des cellules cancéreuses par l'ajout d'un médicament chimiothérapeutique. la concentration du médicament et de la durée du traitement doivent être adaptés au type cellulaire testé. Commencer avec un traitement de 48 heures à la concentration finale de 50 nM de doxorubicine pour une concentration de cellules à environ 10 6 cellules / ml. Ne pas oublier d'inclure échantillon non traité (témoin négatif).
3. Bafilomycine traitement A1
- Vérifier la viabilité cellulaire de cellules de mélange avec du bleu trypan (v / v), en tant que médicament chimiothérapeutique utilisé dans l'étape précédente pourrait conduire à l'apoptose des cellules. Verser dans une chambre Malassez et compter le nombre de cellules bleues (cellules mortes) et des globules blancs (cellules vivantes). Si le pourcentage de viabilité est inférieur à 70%, les cellules mortes pourraient être removed l'aide d'un kit approprié pour s'assurer que les cellules mortes ne sera pas biaiser l'analyse ultérieure.
- Retirez les milieux de culture et les remplacer par un milieu de culture frais préchauffé. Traiter les cellules avec une concentration finale de 100 nM de la bafilomycine A1. Bafilomycine A1 est utilisée pour neutraliser le pH acide des lysosomes. Incuber 1 heure à 37 ° C, 5% de CO 2.
4. C 12 FDG coloration
- Dissoudre C 12 FDG dans préchauffé milieu de culture frais à une concentration finale de 2 mM.
- Ajouter le composé de cellules à une concentration finale de 33 uM et incuber 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Si l'utilisation de cellules non-adhérentes, centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C (la vitesse peut être ajustée au type de cellule utilisée), laver 2x avec PBS. Reprendre le culot cellulaire dans 500 pi de PBS froid. Si vous utilisez des cellules adhérentes, retirez le support et laver 2x avec PBS. Récolter les cellules adhérentes à l'aide d'une solution de trypsine et la centrifugeusecellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C (la vitesse peut être ajustée au type de cellule utilisée). Reprendre le culot cellulaire dans 500 pi de PBS froid. Dans les deux cas, la concentration cellulaire devrait être d'environ 10 6 cellules / ml.
- Effectuez une co-immuno-marquage pour mieux caractériser la population des cellules sénescentes.
5. L'analyse de cytométrie en flux
- Calibrer le cytomètre en flux à l'aide des billes de contrôle recommandées par le fabricant du cytomètre en flux. Pour toutes les mesures, au moins 10 4 événements doivent être enregistrés.
- Exécutez le premier échantillon contenant des cellules non marquées. Préparer un graphique à deux paramètres affichage Channel Forward Scatter (FSC) par rapport à canal latéral Scatter (SSC). Réglez les tubes photomultiplicateurs (PMT) et de définir une zone d'intérêt à l'exclusion des cellules mortes et les débris cellulaires qui auraient pu apparaître au cours de la préparation des échantillons. Porte de cette région d'intérêt dans un histogramme à un paramètre affichage FL1 sur l'échelle logarithmiquede l'axe des x et le nombre d'événements dans l'axe des y. Le nombre total d'événements représente le nombre de cellules analysées. Régler le PMT afin que les cellules non marquées apparaissent dans la première décennie sur l'échelle logarithmique de l'axe des x. Déterminer l'auto-fluorescence des cellules si nécessaire.
- Exécutez le second échantillon contenant des cellules non traitées. D'un paramètre histogramme affichant FL1 (fluorescence de C 12 FDG), placez le curseur après la population faiblement marqué. Ce seuil va permettre la discrimination entre les cellules non-sénescentes (cellules faiblement marquées) et les cellules sénescentes (cellules brillamment marqués).
- Exécutez le troisième échantillon contenant des cellules traitées. Cellules brillamment marqué, c'est à dire les cellules sénescentes apparaissent au-dessus du seuil déterminé à l'étape précédente. Évaluer le pourcentage de cellules sénescentes en divisant le nombre d'événements lumineux par le nombre total d'événements. Si nécessaire, l'activité de la β-galactosidase peut également être estimée en utilisant la fluorescence moyenneintensité.
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Representative Results
Myélome multiple, un cancer hématologique a été utilisé pour évaluer la sénescence induite par une procédure chimiothérapeutique. Pour ce faire, une lignée de cellules de MM disponibles dans le commerce (RPMI 8226) a été traitée pendant 2 jours avec la doxorubicine, un médicament chimiothérapeutique. Les cellules ont ensuite été soumis à un traitement bafilomycine A1 et encore incubées avec C 12 FDG. Les cellules ont été analysées par cytométrie de flux. Figure 1 illustre les différentes étapes et montre que le pourcentage de cellules sénescentes peut être déterminée dans un jour avec l'utilisation de C 12 FDG. Cellules non marquées ont été effectués d'abord dans le cytomètre en flux. Comme le montre la figure 2A, une région d'intérêt a été fixé sur la FSC graphique par rapport à la SSC pour exclure les cellules mortes et les débris cellulaires. Les cellules de cette région d'intérêt ont ensuite été fermée sur l'histogramme affichant la fluorescence de C 12 FDG (LV1) sur l'axe des x et le nombre d'événements sur l'axe des ordonnées. Les cellules non traitées ont été analysées. Acurseur rouge a été créée après que la population faiblement étiqueté comme le montre la figure 2B: cellules non sénescentes apparaîtront dans la région de U, tandis que les cellules sénescentes seront présents dans la région V. Les cellules traitées ont ensuite été courir dans le cytomètre de flux. Une population de cellules brillamment marqués apparu au-dessus du curseur rouge précédemment défini, dans la région V, comme le montre la figure 2C (panneau de gauche). Cette population représente des cellules sénescentes et leur pourcentage peut ensuite être calculé. En parallèle, le même échantillon de cellules est coloré en utilisant le test β-galactosidase comme illustré (à droite). Dans ce tableau représentatif, les cellules entièrement bleu et les cellules partiellement bleus sont présentés pour illustrer la difficulté de distinguer les cellules sénescentes vraiment bleu.
Pour illustrer la spécificité de C 12 FDG dans la détermination du pourcentage de cellules sénescentes, les cellules ont été traitées par différentes concentrations de la doxorubicine. Le pourcentage d'cellules sénescentes a été déterminé comme à la figure 2B. Le pourcentage de cellules lumineuses augmente en fonction de la concentration de doxorubicine utilisée comme le montre la figure 3. Cela démontre que C 12 FDG étiquetage spécifique des cellules sénescentes.
Figure 1. Cellules schéma de l'expérience globale. Ont été ensemencées 1 24 heures avant le traitement avec le médicament chimiothérapeutique 2. Le jour de l'expérience, les cellules ont été incubées avec bafilomycine A1 3, puis avec C12FDG 4. Les cellules ont ensuite été analysés sur le cytomètre de flux 5.
Figure 2. l'analyse par cytométrie de flux. (A), une région de wa d'intérêts déterminé sur le terrain contre FSC SSC pour exclure les cellules mortes et les débris cellulaires. (B) Les cellules non traitées ont été exécutés dans le cytomètre en flux et le curseur rouge a été créé. (C) Les cellules traitées ont été exécutés dans le cytomètre de flux. Les cellules sénescentes sont apparus au-dessus du curseur rouge. U et V représentent les régions d'intérêt, à savoir les cellules sénescentes et non sénescentes, respectivement. (D) en parallèle (même échantillon, même traitement), les cellules ont été colorées en utilisant le test β-galactosidase. Notez les différents degrés de la coloration des cellules (cellules entièrement bleus, des cellules partiellement bleu), ce qui illustre la difficulté de fixer un seuil permettant la discrimination des cellules sénescentes. Canal Forward Scatter (FSC), à canal latéral Scatter (SSC), Fluorescence 1 (LV1).
Figure 3. Spécificité du C 12FDG étiquetage. Les cellules ont été traitées avec 5 (histogramme gris foncé), 25 (histogramme gris clair) et 50 nm (histogramme blanc) de la doxorubicine. U représente la région contenant des cellules non-sénescentes. Le pourcentage de cellules sénescentes est évaluée en divisant le nombre d'événements lumineux par le nombre total d'événements. Les pourcentages de cellules sénescentes sont de 0,8%, 15,78%, 26,31% pour une dose de 5, 25 et 50 nM doxorubicine, respectivement.
| C12FDG essai | dosage de β-galactosidase | |
| Sensibilité | + | - |
| Coût | = | = |
| Débit | + | - |
| durée de dosage | - | + |
| Application type de cellule | = | = |
| Cellules | Vivre cellule | Cellule fixe |
| Exigence d'un équipement spécialisé | cytomètre de flux | Microscope à champ lumineux |
Tableau 1. . Avantages et inconvénients de la C 12 FDG dosage à base de cytométrie et la β-galactosidase test (+) correspond à un degré plus élevé tandis que (-) et (=) correspondent à des degrés mineurs et assimilés, respectivement.
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Discussion
Nous avons présenté ici une méthode cytométrie en flux offre de quantifier la sénescence cellulaire dans les cellules cancéreuses vivantes. Cette méthode est basée sur l'utilisation du composé perméable de la membrane, la C 12 FDG, et peut donc être utilisé dans tous les types de cellules et après divers traitements aussi longtemps que le composé est absorbé par les cellules. Après l'absorption cellulaire, la C 12 FDG est hydrolysé par la β-galactosidase, enrichi en lysosomes des cellules sénescentes. Après excitation laser, le composé émet de la fluorescence verte, ce qui permet la quantification des cellules sénescentes. Cette quantification de la fluorescence verte peut être fait soit par cytométrie de flux ou par microscopie à fluorescence. Toutefois, dans ce cas, les cellules fluorescentes devront être compté par l'observateur, ce qui nécessite du temps. Depuis le C 12 FDG est hydrolysé par la β-galactosidase, cette méthode permet, en plus de la quantification des cellules sénescentes, de quantifier l'activité de la β-galactosidaseet la localisation de l'enzyme, présente surtout dans la vésicule lysosomale. Bien que la méthode est simple, l'attention devrait être attirée sur l'étape 3. La détection réussie de cellules sénescentes repose principalement sur le droit pH des lysosomes. Pour ce faire, nous avons utilisé bafilomycine A1 pour neutraliser le pH acide des lysosomes. En fonction du type cellulaire utilisé, cette étape peut ne pas être nécessaire. Si la sénescence est attendu et aucune coloration est détectée, il est conseillé d'inclure un contrôle négatif pour bafilomycine A1 (pas bafilomycine) et d'augmenter la concentration de bafilomycine A1. Si ce faisant, veiller à ce que cette augmentation ne provoque pas la mort cellulaire. Sinon, bafilomycine A1 peut être substitué à la chloroquine ou d'autres composés qui sont en mesure d'augmenter le pH des lysosomes.
Selon le protocole décrit, nous avons réussi à quantifier le pourcentage de cellules sénescentes en cellules du myélome multiple après le traitement de la doxorubicine dans la journée. Ce protocole peut être utilisé dans OTHtypes de cellules cancéreuses er, mais aussi dans les types de cellules non-cancéreuses. Le dosage de β-galactosidase populaire et galvaudé, dont le pH cellulaire doit également être contrôlé, nécessite au moins 2 jours. En effet, la couleur bleue maximal, obtenu après le clivage de X-gal par la β-galactosidase, est atteinte après 12 à 16 h d'incubation 9. Ce test est donc plus de temps que le test basé sur la cytométrie proposé. En outre, ce test n'est pas sensible car une cellule bleuâtre pourrait être considéré comme cellule sénescente tout en étant pas vraiment sénescent. Les Tableau 1 récapitule les avantages et les inconvénients des deux techniques.
L'autre avantage de cette méthode est qu'elle peut être couplé avec l'immunomarquage des décideurs de la surface cellulaire. Dans le cas de myélome multiple, cela nous a permis de montrer que plusieurs cellules souches du cancer de myélome ne dégénèrent traitement de doxorubicine suivante, tandis que les cellules souches non cancéreuses font 12. Sénescence a été montré pour être pro-et anti-tumorigènes. Comme les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire la sénescence, l'étude de la sénescence pourrait devenir important dans la clinique. À cette fin, les tests rapides et sensibles doivent être utilisés, tels que l'essai que nous avons décrit ici.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions le SF 4206 ICORE (Université de Caen) pour l'utilisation de la facilité de cytométrie. JC reçu des bourses post-doctorales du Conseil de Radioprotection d'EDF et le Conseil Régional de Basse-Normandie. Ces données font partie des projets financés par la Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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