Summary
无论是衰老阻止或促进肿瘤的发生仍存在争议。由于化学治疗药物可以诱导癌细胞衰老，衰老研究提出的新疗法是必不可少的。然而，标准的和广泛使用的β-半乳糖苷酶测定的主要缺点。在这里我们提出一种快速，灵敏的基于流式细胞仪检测，以量化衰老。
Abstract
人体细胞不会无限增殖。外部和/或内在线索后，细胞可能会死，或进入一个稳定的细胞周期阻滞，称为衰老。几个细胞的机制，如端粒缩短和有丝分裂原癌基因的异常表达，已被证明是导致衰老。衰老并不局限于对正常细胞也有报道癌细胞衰老。
化学治疗药物已被证明在肿瘤细胞中诱导衰老。但是，它仍然是有争议的衰老是否阻止或促进肿瘤的发生。因为它最终可能特定病人，一种快速，灵敏的方法将很快被要求评估在癌症细胞的衰老。
的是标准的β-半乳糖苷酶的测定中，目前使用的方法，为此，提出了主要的缺点：它是费时和不敏感。在这里我们提出一个基于流式细胞仪检测，以研究衰老对李VE细胞。本试剂盒提供的优点是快速，灵敏，可耦合到各种细胞标记物的免疫标记。
Introduction
海弗利克和穆尔黑德自六十年代初，它的发现，衰老仍然蜂窝的好奇心1。人体细胞不会无限增殖，衰老，海弗利克和穆尔黑德创造了细胞老化过程。衰老是一个稳定的细胞中，细胞周期阻滞保持代谢活跃，而不是细胞死亡。迄今为止，已经示出了4个细胞机制，诱导衰老：端粒缩短，DNA损伤，染色质的扰动，促有丝分裂原癌基因的异常表达2。这表明，不仅是正常的细胞，而且还能够接受衰老3癌细胞。事实上，癌症细胞衰老示出了进一步的肿瘤进展4-5构成障碍。然而，一些报告已经指出，在某些情况下，细胞衰老也可以促进恶性6-7。研究衰老癌症CELls是在癌症研究中，目前使用的化疗药物可导致癌细胞不仅在体外还是在体内 8衰老成为一种冲动。
主站的检测，以探讨衰老细胞的存在下，在酸性pH下的β-半乳糖苷酶测定。该组织化学法反映在溶酶体发生在大多数衰老细胞的生物合成增加。简单地说，外源X-gal的，适用于细胞，由衰老细胞的溶酶体中丰富的β-半乳糖苷酶裂解，从而产生蓝色9。蓝色衰老细胞，然后可以量化明场显微镜下。虽然很受欢迎，β-半乳糖苷酶检测提出了主要的缺点。首先，这对固定的细胞进行测定。第二，它是耗时的，因为它意味着衰老程度的量化，通过计算衰老细胞在显微镜下的一个显着高。第三，该法不敏感，衰老和非衰老细胞之间的歧视完全依赖于观察者。
我们在这里讨论的未开发，快速，敏感的流式细胞仪检测，以评估现场衰老细胞的存在。此法是基于水解的膜渗透分子的5 dodecanoylaminofluorescein的二-β-D-吡喃半乳糖苷（C 12 FDG），β-半乳糖苷酶在衰老细胞中富集。水解和激光激发后，在C 12 FDG发出绿色荧光，因此，可以通过流式细胞仪10，11检测到。衰老的细胞通过流式细胞仪的检测提供了快速，灵敏的巨大优势。此外，通过流式细胞术检测衰老细胞与其他细胞的标记物的检测可以耦合。本试剂盒可用于检测衰老细胞，用化疗治疗的癌细胞内的人口，可以常规设置组织切片，细胞分离后，在诊所。
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Protocol
1。巴弗洛霉素A1，C12FDG和细胞培养制备
- C 12的溶解在二甲亚砜（DMSO）中至最终浓度为20mM的葡萄糖粉。分装和储存在-20°C DMSO应采用适当的安全条件。
- 巴弗洛霉素A1粉溶解在DMSO中，使最终浓度为0.1mM。分装和储存在 - 20°C。巴弗洛霉素应采用适当的安全条件。
- RPMI 8226细胞系，或其他细胞系粘附或不培养，在含有10％小牛血清和1％的抗生素，在37℃，5％CO 2的介质。估计的实验所需的细胞数。在流式细胞仪分析，以便记录了足够数量的事件，5×10 5细胞是必需的。要确定三种细胞衰老细胞的百分比，样品要求：无标签样本，未经处理的细胞与C 12 FDG染色，染色处理过的细胞C 12 FDG。
- 种子细胞前24小时进行的实验，使细胞处于对数生长期的细胞增殖曲线。
2。诱导衰老
- 添加的化学治疗药物，诱导癌细胞衰老。药物浓度和治疗持续时间应适应测试的细胞类型。开始一个48小时处理，在多柔比星的最终浓度为50nM的细胞的浓度为约10 6个细胞/ ml。不要忘了，包括未经处理的样品（阴性对照）。
3。巴弗洛霉素A1治疗
- 检查细胞活力通过将细胞用台盼蓝（体积/体积），在先前步骤中所用的化学治疗药物可能会导致细胞凋亡。填写成Malassez室和蓝色细胞（死细胞）和白细胞（活细胞）数一数。生存能力如果百分比低于70％，死细胞，可能会对物已获批准使用适当的工具包，以确保不会死细胞偏置后续分析。
- 取出培养基和更换新鲜培养基预热。治疗的细胞与终浓度为100nM的巴弗洛霉素A1。巴弗洛霉素A1被用于中和酸性pH值的溶酶体。在37℃，5％CO 2中孵育1小时。
4。 C 12 FDG染色
- C 12葡萄糖溶解在预热的新鲜培养基中至终浓度为2mM。
- 的化合物加入到细胞中，使最终浓度为33μM，并孵育2小时，在37℃，5％CO 2。如果使用非粘附细胞，细胞以300×g离心5分钟，在4℃（可能具有的速度进行调整，以所使用的细胞类型），用PBS洗2倍。在500微升冷PBS重悬细胞沉淀。如果使用贴壁细胞，取出纸张，用PBS洗2倍。用胰蛋白酶溶液，离心，收获贴壁细胞细胞以300×g，5分钟，在4℃（可能具有的速度进行调整，以所使用的细胞类型）。在500微升冷PBS重悬细胞沉淀。在这两种情况下，细胞的浓度应为约10 6个细胞/ ml
- 执行合作进一步刻画人口的衰老细胞的免疫标记。
5。流式细胞仪分析
- 校准使用控制由生产商推荐的有孔玻璃珠的流式细胞仪的流式细胞仪。对于所有的步骤，至少10 4个事件被记录下来。
- 运行第一个样本含有未标记的细胞。准备一两个参数的图形显示前向散射信道（FSC）与侧向散射光通道（SSC）。设置在光电倍增管（光电倍增管），并定义一个感兴趣的区域不包括死亡的细胞和细胞碎片，在实验中，有可能出现。门这一地区的利益在一个参数直方图显示FL1日志规模的x轴方向和y轴的数目事件。事件的总数代表分析的细胞数。设置的PMT，使未标记细胞的对数刻度的x轴出现在第一个十年。确定如果有必要的细胞的自体荧光。
- 运行第二个样品含有未经处理的细胞。在单参数直方图显示FL1（荧光FDG C 12），将光标放置后昏暗标记的人口。这的门槛将允许非衰老细胞（昏暗标记细胞）和衰老细胞（明亮标记细胞）之间的歧视。
- 运行第三个样品含有处理过的细胞。明亮的标记的细胞， 即衰老细胞出现在上一步中确定的阈值以上。评估衰老细胞的百分比除以明亮的事件，每个事件的总数的数量。如果需要的话，将β-半乳糖苷酶的活性也可以被估计平均荧光的强度。
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Representative Results
多发性骨髓瘤，血液肿瘤，被用来评估的过程化学治疗诱导的衰老。要做到这一点市售MM细胞株（RPMI 8226）治疗与化学治疗药物阿霉素，2天。然后将细胞进行治疗巴弗洛霉素A1和C 12 FDG进一步培养。细胞，通过流式细胞术分析， 图1说明了不同的步骤和衰老细胞的百分比可确定在一天之内使用的C 12 FDG。首先运行未标记细胞在流式细胞仪。 如图2A中所示，一个感兴趣的区域上设置图形FSC与SSC排除死细胞和细胞碎片。然后在此感兴趣区域的细胞门控，在直方图上显示的荧光12 FDG的C（FL1）上的x轴和y轴的数量上的事件。未经处理的细胞进行分析。一红色光标后昏暗标记的人口描绘图2B：非衰老细胞会出现在区域U，而衰老细胞中存在地区五，后处理的细胞流式细胞仪运行。一个人口的明亮标记细胞出现上面的红色光标先前设置的，在区域V， 图2C（左图）。这个人口占衰老细胞，随后可以计算其百分比。与此同时，在相同的细胞样品染色（右图）所示的β-半乳糖苷酶测定使用。在这种有代表性的画面，完全的蓝色细胞和部分蓝色的细胞被说明的难度，区分真正蓝色衰老细胞。
为了说明C 12的葡萄糖的特异性衰老细胞的百分比的测定，将细胞用各种浓度的阿霉素。的百分比在图2B中被确定为衰老细胞。明亮的细胞的百分比增加作为所使用的多柔比星浓度的函数， 如图3所示。这表明，C 12 FDG标签是针对衰老细胞。
图1。总体方案的实验。细胞接种24小时前，治疗与化学治疗药物的2。在实验当天，细胞与巴弗洛霉素A1 3，然后与C12FDG 4。在流式细胞仪上的细胞，然后分析。
图2。 （A）地区的利益娃流式细胞仪分析。FSC与SSC的情节下定决心排除死细胞和细胞碎片，（B）的未经处理的细胞在流式细胞仪运行和红色光标设置（C）将处理过的细胞在流式细胞仪中的运行。衰老细胞出现上面的红色光标。 U和V分别代表感兴趣的区域， 即非衰老和衰老细胞，（D）在平行（同一个样品，相同的处理），将细胞染色，使用β-半乳糖苷酶的测定。注意：不同程度的细胞染色（完全蓝色的细胞，部分蓝色细胞），其示出的难度设置的阈值，使衰老细胞的歧视。前向散射信道（FSC），侧向散射光通道（SSC），荧光1（FL1）。
图3。特异性的C 12FDG标签。细胞经5（暗灰色的柱状图），25（浅灰色的柱状图），阿霉素和50纳米（白色直方图）。 U代表该地区包含非衰老细胞。衰老细胞的百分比进行评估除以数明亮的事件，每个事件的总数。衰老细胞的百分比是0.8％，15.78％，26.31％，剂量为5，25，和50纳米阿霉素。
| C12FDG检测 | β-半乳糖苷酶测定 | |
| 感性 | + | - |
| 成本 | = | = |
| 吞吐量 | + | - |
| 含量持续时间 | - | + |
| 细胞类型的适用性 | = | = |
| 细胞 | 活细胞 | 固定细胞 |
| 专用设备的要求 | 流式细胞仪 | 明视场显微镜 |
表1中。的优点和缺点的C 12 FDG的流式细胞仪为基础的检测和（+）β-半乳糖苷酶检测。更高的程度相对应，而（ - ）和（=）的通讯到轻微和等效度分别。
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Discussion
这里，我们介绍一个基于流式细胞仪的方法来量化在肝癌细胞中的细胞衰老。这种方法是基于使用的膜透过性化合物中，C 12 FDG，因此，可以使用任何类型的细胞，并经过各种治疗方法，只要是采取了由细胞的化合物。细胞摄取后，C 12 FDG是由β-半乳糖苷酶，富含衰老细胞的溶酶体水解。激光激发后，化合物发出绿色荧光，使衰老细胞的定量。这种量化的绿色荧光可以通过流式细胞仪或荧光显微镜。然而，在这种情况下，将有荧光的细胞计数观察者，需要时间。由于C 12 FDG水解的β-半乳糖苷酶，此方法允许，除了衰老细胞的量化，量化的β-半乳糖苷酶的活性和本地化的酶，主要存在于溶酶体囊泡。虽然方法简单，应提请注意第3步。衰老细胞的成功侦破，主要是依赖溶酶体的pH值在右边。要做到这一点，我们使用巴弗洛霉素A1的溶酶体中和酸性pH值。根据所使用的细胞类型上，这一步可能并非必需。如果衰老是意料中的未检测到染色，我们建议包括巴弗洛霉素A1的阴性对照（没有巴弗洛霉素）和巴弗洛霉素A1的浓度增加。如果这样做，确保这种增加不会导致细胞死亡。或者，可以被取代的巴弗洛霉素A1与氯喹或任何其他的化合物，能够增加溶酶体的pH值。
使用所描述的协议，我们成功地量化衰老细胞在多发性骨髓瘤细胞在一天之内阿霉素治疗后的百分比。这个协议可以使用在超视距呃肿瘤细胞类型，而且在非癌症的细胞类型。流行和过度使用的β-半乳糖苷酶的测定，细胞内pH等也必须控制，需要至少2天。事实上，X-gal的β-半乳糖苷酶裂解后得到的，最大的蓝色实现后12 - 16小时，温育9。因此，此法是耗费更多的时间比建议基于流式细胞仪检测。此外，该法是不敏感的，因为也可能被算作一个蓝色的细胞衰老的细胞，而不是真正意义上的衰老。 表1概括了这两种技术的优点和缺点。
这种方法的另一个优点是，它可以与细胞表面的免疫染色器耦合。在多发性骨髓瘤的情况下，这使我们能够表明，多发性骨髓瘤肿瘤干细胞不衰老以下阿霉素治疗非癌症干细胞，而做12。 衰老已被证明是亲和抗致瘤性的。由于化学治疗药物可诱发衰老，衰老研究有可能成为重要的临床。为此，快速和灵敏的检测方法已被使用，如我们这里所描述的测定。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢ICORE SF 4206（卡昂大学）为利用流式细胞设施。 JC收到博士后奖学金委员会辐射防护EDF和下诺曼底地区行政法院。这些数据国家法甲抗癌症 - ComitésDE L'奥恩等卡尔瓦多斯资助项目的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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