Summary
Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.
Abstract
Le cellule umane non proliferano indefinitamente. Su indicazioni esterne e / o intrinseca, le cellule potrebbero morire o entrare in un arresto del ciclo cellulare stabile chiamato senescenza. Diversi meccanismi cellulari, come accorciamento dei telomeri e anormale espressione di oncogeni mitogeni, hanno dimostrato di causare senescenza. La senescenza non è limitato alle cellule normali, sono state riportate anche le cellule tumorali a senesce.
Farmaci chemioterapici hanno dimostrato di indurre la senescenza nelle cellule tumorali. Tuttavia, resta controverso se la senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi. Come potrebbe eventualmente essere paziente-specifico, sarà presto necessario un metodo rapido e sensibile per valutare senescenza in cellule di cancro.
A tal fine, il saggio β-galattosidasi standard, il metodo attualmente utilizzato, presenta notevoli svantaggi: è tempo e non è sensibile. Proponiamo qui un saggio di citometria a base di flusso per studiare senescenza su Live cellule. Questo saggio offre il vantaggio di essere rapida, sensibile, e può essere accoppiato al immunomarcatura dei diversi marcatori cellulari.
Introduction
Poiché primi anni Sessanta e la sua scoperta da Hayflick e Moorhead, senescenza rimane una curiosità cellulare 1. Le cellule umane non proliferano indefinitamente e, da senescenza, Hayflick e Moorhead coniato il processo di invecchiamento cellulare. Senescenza è un arresto del ciclo cellulare stabile in cui le cellule rimangono metabolicamente attive in contrapposizione alla morte cellulare. Ad oggi, quattro meccanismi cellulari hanno mostrato di indurre senescenza: telomeri, danno al DNA, cromatina perturbazione, e anormale espressione di oncogeni mitogenico 2. Ciò indica che non solo le cellule normali, ma anche le cellule tumorali sono in grado di sottoporsi a senescenza 3. È un dato di fatto, le cellule di cancro sottoposti senescenza hanno mostrato di costituire una barriera ulteriore progressione tumorale 4-5. Tuttavia, diversi studi hanno ormai evidenziato che, in determinate circostanze, la senescenza cellulare può anche promuovere malignità 6-7. Studiare la senescenza di cancro celLS sta per diventare uno stimolo nella ricerca sul cancro come attualmente utilizzati farmaci chemioterapici possono portare alla senescenza delle cellule tumorali non solo in vitro ma anche in vivo 8.
Il saggio maestro di indagare per la presenza di cellule senescenti è il saggio β-galattosidasi a pH acido. Questo saggio istochimico riflette l'aumento nella biogenesi lisosomiale che si verificano nella maggior parte delle cellule senescenti. Brevemente, esogeno X-gal, applicato alle celle, è tagliata da β-galattosidasi arricchito in lisosomi delle cellule senescenti, dando origine ad un colore blu 9. Le cellule senescenti blu possono quindi essere quantificati al microscopio in campo chiaro. Anche se molto popolare, il saggio di β-galattosidasi presenta grossi inconvenienti. Prima, questa prova viene eseguita su cellule fissate. Secondo, è molto tempo perché implica per quantificare il grado di senescenza contando un significativamente elevato numero di cellule senescenti al microscopio. Terzo, questo dosaggionon è sensibile come la discriminazione tra cellule senescenti e non senescenti si basa interamente sul osservatore.
Discutiamo qui un, analisi di citometria a base di veloce, sensibile e non sfruttato per valutare la presenza di cellule senescenti dal vivo. Questo saggio è basato sulla idrolisi di una membrana permeabile molecola, il 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galattopiranoside (C 12 FDG), da β-galattosidasi arricchita in cellule senescenti. Dopo idrolisi e eccitazione laser, il C 12 FDG emette fluorescenza verde e può quindi essere rilevata mediante citometria di flusso 10, 11. Il rilevamento di cellule senescenti tramite citofluorimetria offre il grande vantaggio di essere rapido e sensibile. Inoltre, la rilevazione di cellule senescenti mediante citometria di flusso può essere accoppiato con il rilevamento di altri marcatori cellulari. Questo test può essere utilizzato per rilevare le cellule senescenti all'interno di una popolazione di cellule cancerose trattati con chemioterapia e può essere impostato routinariamentesu su sezioni di tessuto, dopo la dissociazione cellulare, in clinica.
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Protocol
1. Preparazione di C12FDG, bafilomicina A1, e Cell Culture
- Sciogliere la polvere C 12 FDG in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 20 mM. Aliquota e conservare a -20 ° C. DMSO deve essere usato con adeguate condizioni di sicurezza.
- Sciogliere la bafilomicina A1 polvere in DMSO ad una concentrazione finale di 0,1 mM. Aliquota e conservare a - 20 ° C. Bafilomicina deve essere usato con adeguate condizioni di sicurezza.
- Coltivare RPMI 8226 linea cellulare, o altre linee cellulari aderenti o meno, in terreni contenenti 10% di siero fetale bovino e antibiotici 1%, a 37 ° C, 5% di CO 2. Stimare il numero di cellule necessarie per l'esperimento. Per registrare un numero sufficiente di eventi durante l'analisi di citometria di flusso, sono richiesti 5 x 10 5 cellule. Per determinare la percentuale di cellule senescenti, sono necessari tre campioni di cellule: campione senza etichetta, cellule non trattate colorate con C 12 FDG, cellule trattate colorate conC 12 FDG.
- Il seme cellule 24 ore prima eseguendo l'esperimento in modo che le cellule sono nel log-fase della curva di proliferazione cellulare.
2. L'induzione di senescenza
- Indurre la senescenza delle cellule tumorali con l'aggiunta di un farmaco chemioterapico. Concentrazione del farmaco e la durata del trattamento devono essere adattate al tipo di cellula testato. Iniziare con un trattamento di 48 ore alla concentrazione finale di 50 nM doxorubicina per una concentrazione di cellule a circa 10 6 cellule / ml. Non dimenticare di includere campione non trattato (controllo negativo).
3. Bafilomicina A1 Trattamento
- Controllare vitalità cellulare dalle cellule mescolando con trypan blue (v / v), come il farmaco chemioterapico utilizzato nel passaggio precedente potrebbe portare ad apoptosi. Riempire in una camera di Malassez e contare il numero di cellule blu (cellule morte) e di cellule bianche (cellule viventi). Se la percentuale di vitalità è inferiore al 70%, le cellule morte potrebbero essere removed utilizzando un kit appropriato per garantire che le cellule morte non sarà di preferenza la successiva analisi.
- Rimuovere i terreni di coltura e di sostituire dai terreni di coltura fresca preriscaldata. Trattare le cellule con una concentrazione finale di 100 nM di bafilomicina A1. Bafilomicina A1 è usata per neutralizzare il pH acido dei lisosomi. Incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2.
4. C 12 FDG colorazione
- Sciogliere C 12 FDG preriscaldata in terreni di coltura fresco ad una concentrazione finale di 2 mm.
- Aggiungere il composto di cellule ad una concentrazione finale di 33 mM e incubare 2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Se utilizza cellule non aderenti, centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C (la velocità potrebbe dover essere adattato al tipo cellulare utilizzato), lavare 2x con PBS. Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di PBS freddo. Se si utilizza cellule aderenti, rimuovere il supporto e lavare 2x con PBS. Raccogliere le cellule aderenti utilizzando una soluzione di tripsina e centrifugarecellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C (la velocità potrebbe dover essere adattato al tipo cellulare utilizzato). Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di PBS freddo. In entrambi i casi, la concentrazione cellulare dovrebbe essere di circa 10 6 cellule / ml.
- Eseguire un co-immunomarcatura per caratterizzare ulteriormente la popolazione di cellule senescenti.
5. Citometria a Flusso Analisi
- Calibrare il citofluorimetro utilizzando le sfere di controllo raccomandate dal produttore del citometro a flusso. Per tutti i passi, almeno 10 4 eventi devono essere registrati.
- Eseguire il primo campione contenente cellule senza etichetta. Preparare una a due parametri grafico visualizzazione Canale Forward Scatter (FSC) rispetto a canale laterale Scatter (SSC). Impostare i tubi fotomoltiplicatori (PMT) e definire una regione di interesse escludendo le cellule morte e detriti cellulari che potrebbero apparsi durante la preparazione del campione. Cancello questa regione di interesse in un istogramma a un parametro visualizza FL1 sulla scala logaritmicadella asse x ed il numero di eventi nel y. Il numero totale di eventi rappresenta il numero di cellule analizzate. Impostare il PMT in modo che le cellule senza etichetta compaiono nella prima decade su scala log del l'asse x. Determinare l'autofluorescenza delle celle, se necessario.
- Eseguire il secondo campione contenente cellule non trattate. Sul istogramma a un parametro visualizzazione FL1 (fluorescenza di C 12 FDG), posizionare il cursore dopo la popolazione scarsamente etichettati. Questa soglia consente la discriminazione tra cellule non senescenti (cellule scarsamente etichettati) e le cellule senescenti (cellule brillantemente etichettati).
- Esegui il terzo campione contenente cellule trattate. Brillantemente etichettato cellule, cioè le cellule senescenti appaiono sopra la soglia determinata nel passaggio precedente. Valutare la percentuale di cellule senescenti dividendo il numero di eventi luminosi per il numero totale di eventi. Se necessario, l'attività della β-galattosidasi può anche essere stimata utilizzando la fluorescenza mediaintensità.
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Representative Results
Mieloma multiplo, un tumore ematologico, è stato utilizzato per valutare la senescenza indotta da una procedura di chemioterapici. Per fare così un linea cellulare MM commercialmente disponibile (RPMI 8226) è stato trattato per 2 giorni con doxorubicina, un farmaco chemioterapico. Le cellule sono state poi sottoposte a trattamento bafilomicina A1 e ulteriormente incubati con C 12 FDG. Le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Figura 1 illustra le diverse fasi e mostra che la percentuale di cellule senescenti può essere determinato entro un giorno con l'uso di C 12 FDG. Cellule senza etichetta sono stati eseguiti prima del citofluorimetro. Come mostrato in Figura 2A, una regione di interesse è stato fissato sulla FSC grafico contro SSC per escludere cellule morte e detriti cellulari. Cellule in questa regione di interesse sono stati poi gated dell'istogramma visualizzazione della fluorescenza di C 12 FDG (FL1) sul asse x ed il numero di eventi sul asse y. Le cellule non trattate sono state analizzate. Acursore rosso è stato fissato dopo che la popolazione scarsamente etichettati come Figura raffigurato 2B: le cellule senescenti non appariranno nella regione di U, mentre le cellule senescenti saranno presenti in regione V. Le cellule trattate sono state poi correre nel citofluorimetro. Una popolazione di cellule marcate brillantemente apparve sopra il cursore rosso precedentemente impostato, nella regione V, come mostrato Figura 2C (pannello di sinistra). Questa popolazione rappresenta cellule senescenti e la loro percentuale può essere successivamente calcolato. In parallelo, la stessa cella campione è stato colorato utilizzando il saggio β-galattosidasi come illustrato (pannello destro). In questo quadro rappresentativo, le cellule del tutto blu e le cellule parzialmente blu sono mostrati per illustrare la difficoltà di distinguere le cellule senescenti veramente blu.
Per illustrare la specificità di C 12 FDG nella determinazione della percentuale di cellule senescenti, le cellule sono state trattate con varie concentrazioni di doxorubicina. La percentuale dicellule senescenti è stato determinato come in Figura 2B. Aumenta la percentuale di cellule luminoso come una funzione della concentrazione di doxorubicina utilizzato come illustrato nella Figura 3. Questo dimostra che C 12 FDG etichettatura è specifico per le cellule senescenti.
Figura 1. Cellule schema dell'esperimento ingombro. 1 sono state seminate 24 ore prima del trattamento con il farmaco chemioterapico 2. Il giorno dell'esperimento, le cellule sono state incubate con bafilomicina A1 3 e poi con C12FDG 4. Le cellule sono state poi analizzate sul citometro di flusso 5.
Figura 2. Analisi di citometria a flusso. (A), una regione di interesse was determinato sulla trama FSC rispetto SSC per escludere cellule morte e detriti cellulari. (B) Le cellule non trattate venivano eseguiti citometro di flusso e il cursore rosso è stato impostato. (C) Le cellule trattate venivano eseguiti citometro a flusso. Le cellule senescenti apparvero sopra il cursore rosso. U e V rappresentano le regioni di interesse, vale a dire cellule non senescenti e senescente, rispettivamente. (D) In parallelo (stesso campione, stesso trattamento), le cellule sono state colorate utilizzando il saggio di β-galattosidasi. Notare il grado variabile della colorazione delle cellule (cellule interamente blu, cellule parzialmente blu), che illustra la difficoltà di impostare una soglia che permette la discriminazione delle cellule senescenti. Forward Canale Scatter (FSC), a canale laterale Scatter (SSC), fluorescenza 1 (FL1).
Figura 3. Specificità del C 12FDG etichettatura. Le cellule sono state trattate con 5 (istogramma grigio scuro), 25 (luce istogramma grigio) e 50 nM (istogramma bianco) della doxorubicina. U rappresenta la regione che contiene le cellule non senescenti. La percentuale di cellule senescenti viene valutata dividendo il numero di eventi luminosi per il numero totale di eventi. Le percentuali di cellule senescenti sono 0,8%, 15,78%, 26,31% per una dose di 5, 25, e 50 nM doxorubicina, rispettivamente.
| C12FDG test | saggio β-galattosidasi | |
| Sensibilità | + | - |
| Costo | = | = |
| Throughput | + | - |
| Durata del test | - | + |
| Applicabilità per tipo di cellula | = | = |
| Cellule | Vivere cella | Cella fissa |
| Obbligo di attrezzature specializzate | Citofluorimetro | Campo chiaro microscopio |
Tabella 1. . Vantaggi e svantaggi del C 12 FDG saggio basato citometria e la β-galattosidasi saggio (+) corrisponde al più alto grado, mentre (-) e (=) corrispondono a gradi minori e equivalenti, rispettivamente.
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Discussion
Abbiamo presentato qui un metodo di citometria a base di flusso per quantificare la senescenza cellulare in cellule tumorali dal vivo. Questo metodo si basa sull'uso del composto membrana permeabile, il C 12 FDG, e può quindi essere utilizzato in qualsiasi tipi cellulari e dopo vari trattamenti finché il composto viene assorbito dalle cellule. Dopo l'assorbimento cellulare, il C 12 FDG viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, arricchito nei lisosomi delle cellule senescenti. Dopo eccitazione laser, il composto emette fluorescenza verde, consentendo quantificazione delle cellule senescenti. Questa quantificazione della fluorescenza verde può essere fatta sia in citofluorimetria o mediante microscopia a fluorescenza. Tuttavia, in questo caso, le cellule fluorescenti dovranno essere contato dall'osservatore, che richiede tempo. Poiché la C 12 FDG viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, questo metodo consente, oltre alla quantificazione di cellule senescenti, per quantificare l'attività della β-galattosidasie la localizzazione dell'enzima, presente principalmente in vescicola lisosomiale. Anche se il metodo è semplice, occorre richiamare l'attenzione sul punto 3. L'individuazione delle cellule senescenti si basa principalmente sulla destra pH dei lisosomi. Per farlo, abbiamo utilizzato bafilomicina A1 per neutralizzare il pH acido dei lisosomi. A seconda del tipo cellulare utilizzato, potrebbe non essere richiesta questo passaggio. Se senescenza è previsto e viene rilevata nessuna colorazione, si consiglia di includere un controllo negativo per bafilomicina A1 (nessuna bafilomicina) e di aumentare la concentrazione di bafilomicina A1. Se così facendo, garantire che questo aumento non induce la morte delle cellule. Alternativamente, bafilomicina A1 può essere sostituito con clorochina o altri composti che sono in grado di aumentare il pH dei lisosomi.
Utilizzando il protocollo descritto, abbiamo quantificato successo la percentuale di cellule senescenti in più celle di mieloma dopo il trattamento con doxorubicina entro un giorno. Questo protocollo può essere utilizzato in OTHer tipi di cellule tumorali, ma anche nei tipi di cellule non tumorali. Il saggio di β-galattosidasi popolare e abusato, per i quali deve essere controllato anche il pH cellulare, necessita di almeno 2 giorni. Effetti il colore blu massimale, ottenuto dopo la scissione di X-gal dal β-galattosidasi, si ottiene dopo 12 - 16 h di incubazione 9. Questo dosaggio è quindi più tempo rispetto alla proposta saggio basato citometria. Inoltre, questo test non è sensibile perché una cellula bluastro potrebbe essere considerato come cellule senescenti, pur non essendo veramente senescenti. La tabella 1 ricapitola i vantaggi e gli svantaggi per le due tecniche.
L'altro vantaggio di questo metodo è che può essere accoppiato con l'immunocolorazione creatori di superficie cellulare. Nel caso del mieloma multiplo, questo ci ha permesso di dimostrare che più le cellule staminali tumorali di mieloma non senesce seguito di trattamento con doxorubicina, mentre le cellule staminali non tumorali fanno 12. La senescenza è stato indicato per essere pro-e anti-cancerogeno. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre la senescenza, studiando la senescenza potrebbe diventare importante in clinica. A tal fine, saggi veloci e sensibili devono essere utilizzati, quali il test abbiamo descritto qui.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il SF 4206 ICORE (Université de Caen) per l'utilizzo della struttura di citometria. JC ha ricevuto borse di studio post-dottorato dal Conseil de Radioprotezione d'EDF e Conseil Régional della Bassa Normandia. Tali dati erano parte di progetti finanziati dalla Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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