Summary
Ли старение предотвращает или способствует туморогенез остается спорным. Поскольку химиотерапевтические препараты могут вызывать раковые клетки стареть, изучая старение имеет важное значение для предложения новых методов лечения. Однако, стандартный и широко используется β-галактозидазы анализа представлены основные недостатки. Мы предлагаем здесь Быстрый и чувствительный проточной цитометрии на основе анализа для количественной старения.
Abstract
Клетки человека не бесконечно размножаться. От внешних и / или внутренних сигналов, клетки могут погибнуть или введите стабильной арест клеточного цикла называется старением. Несколько клеточные механизмы, такие, как укорочение теломер и аномальной экспрессии онкогенов митогенных, было показано, что причиной старения. Старение не ограничивается нормальными клетками; раковые клетки Сообщалось также, что стареют.
Химиотерапевтические препараты индуцируют старение в раковых клетках. Однако остается спорным ли старение предотвращает или способствует туморогенез. Как это в конечном итоге может быть конкретного пациента, Быстрый и чувствительный метод оценки старение в раковой клетке вскоре будет необходимо.
Для этого, стандартные β-галактозидазы анализа, используемые в настоящее время методы представлены основные недостатки: она занимает много времени и не чувствительна. Мы предлагаем здесь проточной цитометрии анализа на основе изучения старения на Ливе клеток. Этот тест дает преимущество в том, быстрый, чувствительный, и может быть соединен с иммунного различных клеточных маркеров.
Introduction
С начала шестидесятых годов и его открытия и Хейфликом Moorhead, старение остается сотовая любопытства 1. Клетки человека не бесконечно размножаться и, по старению, Хейфликом и Мурхеде придумал клеточный процесс старения. Старение является стабильным клеточного цикла, в котором клетки остаются метаболически активными по сравнению с клеточной смерти. На сегодняшний день четыре клеточные механизмы, как было показано, чтобы вызвать старение: укорочение теломер, повреждение ДНК, хроматин возмущение, и аномальной экспрессии онкогенов митогенных 2. Это означает, что не только нормальные клетки, но и раковые клетки могут подвергаться старению 3. В самом деле, раковые клетки проходит старение было показано, представляет собой барьер для дальнейшего прогрессирования опухоли 4-5. Тем не менее, в нескольких докладах уже отметили, что, при определенных обстоятельствах, клеточное старение может также способствовать злокачественной 6-7. Изучение старения рака челLs собирается стать желание в исследовании рака в настоящее время используется в качестве химиотерапевтических препаратов может привести к старению раковых клеток не только в пробирке, но и в естественных условиях 8.
Мастер анализа исследовать на наличие стареющих клеток является β-галактозидазы анализа при кислом рН. Это гистохимическую анализа отражает возросшую в лизосомальных биогенеза, происходящих в самых стареющих клеток. Вкратце, экзогенный X-гал, применительно к клеткам, расщепляется с помощью β-галактозидазы, обогащенный лизосомах стареющие клетки, что приводит к синим цветом 9. Синий стареющие клетки могут быть количественно под ярким поле микроскопа. Хотя очень популярны, β-галактозидазы анализа представлены основные недостатки. Во-первых, этот анализ проводят на фиксированных клеток. Во-вторых, это отнимает много времени, потому что оно подразумевает Для количественной оценки степени старения путем подсчета значительно большим числом стареющие клетки под микроскопом. В-третьих, этот анализне чувствительна как дискриминацию между стареющими и не стареющие клетки полностью зависит от наблюдателя.
Здесь мы обсудим неиспользованными, быстрый и чувствительный цитометрии на основе анализа на предмет наличия живых стареющие клетки. Этот анализ основан на гидролизе проницаемые мембраны молекул 5-dodecanoylaminofluorescein ди-β-D-галактопиранозида (C 12-ФДГ), на β-галактозидазы, обогащенный стареющих клеток. После гидролиза и лазерным возбуждением, C 12 ФДГ испускает зеленую флуоресценцию и поэтому могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, 10, 11. Обнаружение стареющие клетки через проточной цитометрии предлагает большое преимущество, что быстрого и чувствительного. Кроме того, обнаружение стареющих клеток методом проточной цитометрии могут быть связаны с обнаружением других клеточных маркеров. Этот анализ может быть использован для обнаружения стареющих клеток в популяции раковых клетках, обработанных с химиотерапией и может быть обычно установленна срезах тканей, после сотовые диссоциации, в клинике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка C12FDG, Bafilomycin A1, и в клеточной культуре
- Растворить С 12 ФДГ порошок в диметилсульфоксиде (DMSO) до конечной концентрации 20 мМ. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С. ДМСО следует использовать с соответствующих безопасных условиях.
- Растворить порошок bafilomycin A1 в ДМСО до конечной концентрации 0,1 мМ. Алиготе и хранить при температуре - 20 ° С. Bafilomycin должны использоваться с соответствующими условиями безопасности.
- Культивируйте RPMI 8226 клеточной линии или другие клеточные линии, прилипшие или нет, в среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотиков, при 37 ° С, 5% СО 2. Оценить количество клеток, необходимых для эксперимента. Чтобы записать достаточное количество событий во время анализа проточной цитометрии, 5 × 10 5 клеток не требуется. Чтобы определить процент стареющие клетки, клетки трех образцов необходимо: немеченого образец, необработанные клетки окрашивали С 12 ФДГ, обработанные клетки окрашивалиС 12 ФДГ.
- Семенной элементы 24 ч до проведения эксперимента, так что клетки находятся в лог-фазе клеточного кривой пролиферации.
2. Индукционные старения
- Индуцируют старение раковых клеток путем добавления химиотерапевтического препарата. Концентрация наркотиков и продолжительность лечения должна быть адаптирована к типа клеток испытания. Начало с 48 ч обработки при конечной концентрации 50 нМ доксорубицин при концентрации клеток примерно 10 6 клеток / мл. Не забудьте включить необработанном образце (отрицательный контроль).
3. Bafilomycin A1 Лечение
- Проверка жизнеспособности клеток путем смешивания клеток с трипановым синим (об / об) в качестве химиотерапевтических препаратов, используемых в предыдущем шаге может привести к апоптоз клеток. Заполните в камеру Malassez и подсчитать количество голубые клетки (мертвые клетки) и белых клеток (живые клетки). Если процент жизнеспособности составляет менее 70%, мертвые клетки могут быть бэрОведа помощью соответствующего комплекта для обеспечения, что мертвые клетки не будет смещения последующего анализа.
- Снимите питательных сред и заменить свежей среде нагретого культуры. Лечение клеток с конечной концентрации 100 нМ bafilomycin A1. Bafilomycin A1 используется для нейтрализации кислых рН лизосом. Инкубируют 1 ч при 37 ° С, 5% СО 2.
4. С 12 ФДГ Окрашивание
- Растворить С 12 ФДГ в предварительно нагретой свежую культуральную среду до конечной концентрации 2 мМ.
- Добавить соединение с клетками, в конечной концентрации 33 мкМ и инкубируют 2 ч при 37 ° С, 5% СО 2. При использовании неприлипшие клетки, Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С (скорость, возможно, придется быть настроен на тип клеток использовали), промывают 2 раза с PBS. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл холодного PBS. При использовании прилипшие клетки, извлекайте носитель и мыть 2x с PBS. Урожай прилипшие клетки с использованием раствора трипсина и центрифугиКлетки при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С (скорость может должны быть скорректированы в клетку типа используется). Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл холодного PBS. В обоих случаях концентрации клеток должно быть около 10 6 клеток / мл.
- Выполнить совместно иммунного для дальнейшей характеризации населения стареющих клеток.
5. Анализ проточной цитометрии
- Калибровка проточной цитометрии с помощью элемента управления бусы рекомендованных производителем проточном цитометре. Для всех шагов, по крайней мере 10 4 события должны быть записаны.
- Запуск первого образца, содержащего немеченой клеток. Подготовьте двухпараметрическое графического отображения прямого канала рассеяния (FSC) против бокового рассеяния Channel (SSC). Установка фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и определить области, представляющей интерес исключением мертвых клеток и клеточных остатков, которые могли бы появились в пробоподготовки. Ворота этой области интереса в однопараметрическим отображения гистограммы FL1 на логарифмической шкалена оси абсцисс, а число событий в оси у. Общее количество событий представляет собой количество клеток анализируют. Установите PMT, чтобы немеченой клетки появляются в первой декаде на бревне масштаб оси абсцисс. Определение флуоресценции клеток, если это необходимо.
- Запуск второго образца, содержащего необработанными клетками. С одной параметров отображения гистограммы FL1 (флуоресценция C 12 ФДГ), поместите курсор после смутно помечены населения. Этот порог позволит дискриминации между не-стареющих клеток (тускло меченых клеток) и стареющих клеток (ярко меченых клеток).
- Выполнить третий образец, содержащий обработанные клетки. Ярко меченых клеток, то есть стареющие клетки появляются выше порога, определенного на предыдущем шаге. Вычислить процент стареющих клеток путем деления количества ярких событий на общее количество событий. Если необходимо, активность β-галактозидазы также может быть оценена с использованием средней флуоресценцииинтенсивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Множественная миелома, гематологические злокачественные опухоли, был использован для оценки старение индуцированного химиотерапевтические процедуры. Для этого коммерчески доступные линии клетки ММ (RPMI 8226) лечился в течение 2 дней с доксорубицином, химиотерапевтических препаратов. Затем клетки подвергают обработке bafilomycin A1 и дополнительно инкубировали с С12 FDG. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. 1 иллюстрирует различные этапы и показывает, что процент стареющих клеток может быть определена в течение одного дня с использованием C 12 FDG. Немеченому клетки запустить первый в проточной цитометрии. Как показано на рисунке 2А, область интереса был установлен на графическом ФСБ против SSC, чтобы исключить мертвые клетки и продукты распада клеток. Клетки в этой области, представляющей интерес были затем закрытого на гистограмме отображения флуоресценции C 12 ФДГ (FL1) на оси х, а число событий на оси у. Необработанные клетки анализировали.красный курсор был установлен после того, как население смутно помечены как изображено Рисунок 2B: не стареющие клетки появятся в области U, в то время как стареющие клетки будут присутствовать в регионе В. Обработанные клетки после этого работать в проточной цитометрии. Население ярко меченых клеток появились над красный курсор установлен ранее, в регионе V, как показано рис 2С (левая панель). Это население представляет стареющие клетки и в каком процентном впоследствии может быть рассчитан. Параллельно же кювету окрашивали с использованием β-галактозидазы анализа, как на рисунке (правая панель). В этом представителя картины, полностью синие клетки и частично голубые клетки приведены для иллюстрации сложности различать действительно синий стареющих клеток.
Для иллюстрации специфичности С 12 ФДГ в определении процента стареющие клетки, клетки обрабатывали различными концентрациями доксорубицина. Процентстареющих клеток было определено как на фиг.2В. Процент ярко увеличивается клетки в зависимости от используемой концентрации доксорубицина, как показано на рисунке 3. Это показывает, что C 12 ФДГ маркировка является специфическим для стареющих клеток.
Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Клетки высевали 1 24 ч до обработки химиотерапевтического препарата 2. В день эксперимента клетки инкубировали с Bafilomycin A1 3, а затем с C12FDG 4. Затем клетки анализировали на проточном цитометре 5.
Рисунок 2. Проточная цитометрия анализа. (A) области, представляющей интерес вас определяется на участок ФСБ против SSC исключить мертвых клеток и клеточного дебриса. (B) необработанных клеток проводили в проточном цитометре и красный курсор был установлен. (C) обработанных клеток проводили в проточном цитометре. Стареющие клетки появились над красным курсором. U и V представляют собой зоны интереса, т.е. не стареющей и стареющих клеток соответственно. (D) параллельно (тот же образец, такой же режим), клетки окрашивали с использованием β-галактозидазы анализа. Обратите внимание на различную степень окрашивания клеток (полностью голубые клетки, частично голубой клетки), которые иллюстрирует трудность для установки порогового значения позволяет дискриминации стареющих клеток. Прямой канал рассеяния (FSC), боковое рассеяние Channel (SSC), флуоресцентный 1 (FL1).
Рисунок 3. Специфика C 12ФДГ маркировки. Клетки обрабатывали 5 (темно-серые гистограммы), 25 (светло-серый гистограмма) и 50 нМ (белая гистограмма) доксорубицина. U представляет области, содержащей не-стареющие клетки. Процент стареющих клеток оценивали путем деления количества ярких событий на общее количество событий. Проценты стареющей клетки на 0,8%, 15,78%, 26,31% при дозе 5, 25 и 50 нМ доксорубицин, соответственно.
| C12FDG анализа | β-галактозидазы анализа | |
| Чувствительность | + | - |
| Стоить | = | = |
| Пропускная способность | + | - |
| Анализ продолжительности | - | + |
| Соответствие типа клеток | = | = |
| Клетки | Живых клеток | Фиксированные клетки |
| Требования к специализированным оборудованием | Проточный цитометр | Яркий поле микроскопа |
Таблица 1. . Преимущества и недостатки С 12 ФДГ цитометрии на основе анализа и β-галактозидазы анализа (+) соответствует высокой степени в то время как (-) и (=) соответствуют незначительными и эквивалентные градусов, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили здесь проточной цитометрии на основе количественного метода определения клеточного старения в живых клетках рака. Этот метод основан на использовании мембраны проницаемой соединения, C 12 ФДГ, и поэтому может быть использован в любом типов клеток и после различных обработок тех пор, пока соединение поглощается клетками. После поглощения клетками, C 12 ФДГ гидролизуют β-галактозидазы, обогащенная лизосомах стареющие клетки. После лазерного возбуждения, соединение испускает зеленое свечение, что позволяет количественно стареющих клеток. Это количественное определение зеленой флуоресценции может быть сделано с помощью проточной цитометрии или с помощью флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, в этом случае флуоресцирующих клеток должны считаться наблюдателем, требующие времени. Так как C 12-ФДГ гидролизуют β-галактозидазы, этот метод позволяет, в дополнение к количественному стареющих клеток, для количественного определения активности β-галактозидазыи локализации фермента, в основном присутствуют в лизосомных пузырьков. Хотя этот метод прост, внимание должно быть обращено на шаге 3. Успешного обнаружения стареющие клетки зависит главным образом от правой рН лизосом. Для этого мы использовали bafilomycin A1 для нейтрализации кислого рН лизосом. В зависимости от типа клеток использовали, этот шаг может и не потребоваться. Если старение, как ожидается, и ни окрашивание не обнаружено, мы предлагаем включать отрицательный контроль за bafilomycin A1 (не bafilomycin) и увеличить концентрацию bafilomycin A1. Если делать это так, убедитесь, что это увеличение не приводит к гибели клеток. Кроме того, bafilomycin A1 может быть замещена хлорохин или любые другие соединения, которые способны повысить рН лизосом.
Используя описанный протокол, мы успешно количественно процент стареющие клетки в множественной миеломой клетки доксорубицина после лечения в течение дня. Этот протокол может быть использован в противномэ типов раковых клеток, но и в нераковых типов клеток. Популярная и злоупотреблять β-галактозидазы анализа, для которых сотовая рН также должны быть под контролем, требуется не менее 2 дней. Действительно максимальной синий цвет, полученный после расщепления X-гал на β-галактозидазу, достигается через 12 - 16 ч инкубации 9. Этот анализ, следовательно, больше времени, чем предлагаемый цитометрии на основе анализа. Кроме того, этот анализ не чувствительна, потому что клетка может голубовато считаться стареющие клетки, будучи на самом деле не стареющие. Таблица 1 резюмирует преимущества и недостатки этих двух методов.
Другим преимуществом этого метода является то, что она может быть соединена с иммуноокрашивание производители клеточной поверхности. В случае множественной миеломы, это позволило нам показать, что несколько раковых клеток миеломы стволовых не стареть после лечения доксорубицин, в то время как не-раковые клетки стволовые сделать 12. Старение было показано, что про-и анти-онкогенными. Поскольку химиотерапевтические препараты могут вызвать старение, старение изучения может стать важным в клинике. С этой целью быстрого и чувствительного анализа должны быть использованы, например, анализ мы описали здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим SF 4206 ICORE (Университет Кана) для использования цитометрии объекта. JC получил пост-докторские стипендии Conseil d'де радиационной EDF и советом областного Нижней Нормандии. Эти данные, как часть проектов, финансируемых Ligue Nationale Contre Le Рак - Comités де л'Орн э дю кальвадоса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
