Summary
Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.
Abstract
Las células humanas no proliferan indefinidamente. Al señales externas y / o intrínsecos, las células pueden morir o introduzca un detención del ciclo celular estable llamado senescencia. Varios mecanismos celulares, tales como el acortamiento de los telómeros y la expresión anormal de oncogenes mitógenos, se ha demostrado que causa la senescencia. La senescencia no está restringida a las células normales, las células cancerosas también se ha informado de senescencia.
Fármacos quimioterapéuticos han demostrado inducir la senescencia en células de cáncer. Sin embargo, hay controversia sobre la senescencia previene o promueve la tumorigénesis. Como el tiempo podría ser específica del paciente, un método rápido y sensible para evaluar la senescencia en células de cáncer pronto será necesaria.
Para este fin, el ensayo de β-galactosidasa estándar, el método utilizado actualmente, presenta importantes inconvenientes: es mucho tiempo y no es sensible. Se propone aquí un ensayo de citometría de flujo basada en la senescencia de estudiar en liVE células. Este ensayo ofrece la ventaja de ser rápido, sensible, y puede ser acoplado a la inmunomarcación de diversos marcadores celulares.
Introduction
Desde principios de los años sesenta y su descubrimiento por Hayflick y Moorhead, senescencia sigue siendo una curiosidad celular 1. Las células humanas no proliferan indefinidamente y, por senescencia, Hayflick y Moorhead acuñaron el proceso celular de envejecimiento. La senescencia es una detención del ciclo celular estable en el que las células permanecen metabólicamente activa en oposición a la muerte celular. Hasta la fecha, cuatro mecanismos celulares se han mostrado para inducir la senescencia: acortamiento de los telómeros, daño en el ADN, perturbación de la cromatina, y la expresión anormal de oncogenes mitógenos 2. Esto indica que no sólo las células normales, pero también las células cancerosas son capaces de someterse a la senescencia 3. Como cuestión de hecho, las células de cáncer sometidos a la senescencia, se mostró a constituir una barrera para la progresión del tumor 4-5. Sin embargo, varios informes han señalado que, en determinadas circunstancias, la senescencia celular también puede promover la malignidad 6-7. El estudio de la senescencia de cáncer cells está a punto de convertirse en un impulso en la investigación del cáncer tal como se utilizan actualmente los fármacos quimioterapéuticos pueden conducir a la senescencia de las células cancerosas no sólo in vitro sino también in vivo 8.
El ensayo principal para investigar la presencia de células senescentes es el ensayo de β-galactosidasa a pH ácido. Este ensayo histoquímico refleja el aumento en la biogénesis lisosomal que ocurre en la mayoría de las células senescentes. Brevemente, exógeno X-gal, aplicada a las células, se escinde por la β-galactosidasa enriquecido en los lisosomas de las células senescentes, dando lugar a un color azul 9. Las células senescentes azules a continuación, pueden ser cuantificados con un microscopio de campo brillante. Aunque es muy popular, el ensayo de β-galactosidasa presenta mayores inconvenientes. En primer lugar, este ensayo se lleva a cabo en células fijadas. En segundo lugar, es mucho tiempo, ya que es necesario cuantificar el grado de senescencia contando un número significativamente alto de células senescentes bajo un microscopio. En tercer lugar, este ensayono es sensible como la discriminación entre las células senescentes y no senescentes se basa enteramente en el observador.
Se discuten aquí un ensayo de citometría basada sin explotar, rápida y sensible para evaluar la presencia de células senescentes en vivo. Este ensayo se basa en la hidrólisis de una molécula de membrana permeable, la 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopiranósido (C 12 FDG), por β-galactosidasa enriquecida en células senescentes. Después de la hidrólisis y de excitación láser, el C 12 FDG emite fluorescencia verde y por lo tanto puede ser detectada por citometría de flujo 10, 11. La detección de las células senescentes a través de citometría de flujo ofrece la gran ventaja de ser rápido y sensible. Además, la detección de las células senescentes por citometría de flujo se puede acoplar con la detección de otros marcadores celulares. Este ensayo se puede usar para detectar las células senescentes dentro de una población de células cancerosas tratadas con quimioterapia y se puede ajustar de forma rutinariaarriba en secciones de tejido, después de la disociación celular, en la clínica.
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Protocol
1. Preparación de C12FDG, bafilomicina A1, y cultivo celular
- Disolver el polvo de C 12 FDG en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 20 mM. Alícuota y almacenar a -20 ° C. DMSO se debe utilizar con las condiciones de seguridad adecuadas.
- Disolver el polvo de bafilomicina A1 en DMSO a una concentración final de 0,1 mM. Alícuota y almacenar a - 20 ° C. Bafilomicina se debe utilizar con las condiciones de seguridad adecuadas.
- Cultivar línea de medio RPMI 8226 celular, u otras líneas celulares adherentes o no, en medios que contienen 10% de suero fetal bovino y 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO 2. Calcular el número de células necesarias para el experimento. Con el fin de grabar un número suficiente de eventos durante el análisis de citometría de flujo, se requieren células de 5 x 10 5. Para determinar el porcentaje de células senescentes, se requieren tres muestras de células: muestra sin etiqueta, las células no tratadas teñidas con C 12 FDG, las células tratadas se tiñeron conC 12 FDG.
- Semilla de la células 24 horas antes de realizar el experimento para que las células se encuentran en la fase logarítmica de la curva de la proliferación celular.
2. La inducción de la senescencia
- Inducir la senescencia de las células cancerosas mediante la adición de un fármaco quimioterapéutico. La concentración de fármaco y la duración del tratamiento deben ser adaptadas al tipo celular probado. Comenzar con un tratamiento de 48 horas a la concentración final de 50 nM doxorrubicina para una concentración de células en alrededor de 10 6 células / ml. No se olvide de incluir la muestra sin tratar (control negativo).
3. Bafilomicina A1 Tratamiento
- Comprobar la viabilidad celular por las células de mezcla con azul de tripano (v / v), como el fármaco quimioterapéutico usado en el paso anterior podría conducir a la apoptosis de las células. Se envasa en una cámara de Malassez y contar el número de células azules (células muertas) y de glóbulos blancos (células vivas). Si el porcentaje de viabilidad es de menos de 70%, las células muertas pueden ser realesoved utilizando un kit adecuado para garantizar que las células muertas no sesga el análisis posterior.
- Retire el medio de cultivo y reemplazarlo por el medio de cultivo fresco precalentado. Se tratan las células con una concentración final de 100 nM de bafilomicina A1. Bafilomicina A1 se utiliza para neutralizar el pH ácido de los lisosomas. Incubar 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2.
4. C 12 FDG tinción
- Disolver C 12 FDG en el medio de cultivo fresco precalentado a una concentración final de 2 mM.
- Añadir el compuesto a las células a una concentración final de 33 mM y se incuba 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Si el uso de las células no adherentes, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (la velocidad podría tener que ser ajustado para el tipo de célula utilizada), se lava 2 veces con PBS. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS frío. Si el uso de células adherentes, retire el papel y lavar 2 veces con PBS. Recoger las células adherentes utilizando una solución de tripsina y se centrifugalas células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (la velocidad podría tener que ser ajustado para el tipo de célula utilizado). Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS frío. En ambos casos, la concentración celular debe ser de aproximadamente 10 6 células / ml.
- Realizar un co-inmunomarcaje para caracterizar aún más la población de células senescentes.
5. Análisis de citometría de flujo
- Calibrar el citómetro de flujo utilizando las bolas de control recomendadas por el fabricante del citómetro de flujo. Para todas las medidas, por lo menos 10 4 eventos tienen que ser registrados.
- Ejecute la primera muestra que contiene células no marcadas. Prepare una visualización Canal dispersión frontal de dos parámetros gráficos (FSC) frente a Canal dispersión lateral (SSC). Ajuste los tubos fotomultiplicadores (PMT) y definir una región de interés excluyendo las células muertas y los desechos celulares que podrían haber aparecido durante la preparación de la muestra. Puerta de esta región de interés en un histograma de un parámetro FL1 mostrar en la escala logarítmicadel eje de las x y el número de eventos en el eje y. El número total de eventos representa el número de células analizadas. Ajuste el PMT para que las células no marcadas aparecen en la primera década en la escala logarítmica de el eje x. Determinar la autofluorescencia de las células si es necesario.
- Ejecutar la segunda muestra que contiene células no tratadas. En el histograma de un parámetro que muestra FL1 (fluorescencia de C 12 FDG), coloque el cursor después de la población con poca etiqueta. Este límite permitirá discriminación entre células no senescentes (células débilmente marcadas) y las células senescentes (células intensamente marcadas).
- Ejecute la tercera muestra que contiene células tratadas. Con mucha células marcadas, es decir, células senescentes aparecen por encima del umbral determinado en el paso anterior. Evaluar el porcentaje de células senescentes dividiendo el número de eventos brillantes por el número total de eventos. Si es necesario, la actividad de la β-galactosidasa también se puede estimar usando la media de fluorescenciaintensidad.
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Representative Results
Mieloma múltiple, un tumor maligno hematológico, se utilizó para evaluar la senescencia inducida por un procedimiento quimioterapéutico. Para ello una línea de células MM disponible en el mercado (RPMI 8226) fue tratado durante 2 días con doxorrubicina, un medicamento quimioterapéutico. Las células se sometieron luego a tratamiento bafilomicina A1 y se incubaron adicionalmente con C 12 FDG. Las células se analizaron por citometría de flujo. Figura 1 ilustra los diferentes pasos y muestra que el porcentaje de células senescentes se puede determinar dentro de un día con el uso de C 12 FDG. Células no marcadas se llevaron a cabo por primera vez en el citómetro de flujo. Como se muestra en la Figura 2A, una región de interés se estableció en el gráfico de FSC frente a SSC para excluir las células muertas y restos celulares. Las células en esta región de interés fueron entonces cerrada en el histograma que muestra la fluorescencia de C 12 FDG (FL1) en el eje x y el número de eventos en el eje y. Se analizaron las células no tratadas. Lacursor rojo se establece después de la población débilmente marcado como se muestra la Figura 2B: células senescentes no aparecerán en la región de U, mientras que las células senescentes estarán presentes en la región V. Las células tratadas se ejecute a partir de entonces en el citómetro de flujo. Una población de células intensamente marcadas apareció sobre el cursor rojo establecido previamente, en la región V, como se muestra la figura 2C (panel izquierdo). Esta población representa células senescentes y su porcentaje posteriormente se puede calcular. En paralelo, la misma muestra de células se tiñó usando el ensayo de β-galactosidasa como se ilustra (panel derecho). En este cuadro representativo, las células completamente azules y células parcialmente azules se muestran para ilustrar la dificultad para discriminar las células senescentes realmente azules.
Para ilustrar la especificidad de C 12 FDG en la determinación del porcentaje de células senescentes, las células se trataron con diversas concentraciones de doxorubicina. El porcentaje decélulas senescentes se determinó como en la Figura 2B. El porcentaje de células brillantes aumenta como una función de la concentración de doxorubicina que se usó tal como se muestra en la Figura 3. Esto demuestra que C 12 FDG etiquetado es específico para las células senescentes.
Figura 1. Las células esquema del experimento generales. 1 fueron sembradas 24 horas antes del tratamiento con el fármaco quimioterapéutico 2. En el día del experimento, las células se incubaron con bafilomicina A1 3 y luego con C12FDG 4. Las células fueron luego analizadas en el citómetro de flujo 5.
Figura 2. El análisis de citometría de flujo. (A) Una región de interés was determinado en la parcela FSC frente a SSC para excluir las células muertas y restos celulares. (B) Las células no tratadas se llevaron a cabo en el citómetro de flujo y se fijó el cursor rojo. (C) Las células tratadas se ejecutan en el citómetro de flujo. Las células senescentes aparecieron por encima del cursor rojo. U y V representan las regiones de interés, es decir, las células no senescentes y senescentes, respectivamente. (D) En paralelo (misma muestra, mismo tratamiento), las células se tiñeron utilizando el ensayo de β-galactosidasa. Tenga en cuenta los diversos grados de la tinción de las células (células totalmente azules, células parcialmente azul), que ilustra la dificultad para establecer un umbral que permite la discriminación de las células senescentes. Canal dispersión frontal (FSC), Canal de dispersión lateral (SSC), Fluorescencia 1 (FL1).
Figura 3. La especificidad de la C 12FDG etiquetado. Las células fueron tratadas con 5 (histograma gris oscuro), 25 (luz histograma gris) y 50 nM (histograma blanco) de doxorrubicina. U representa la región que contiene las células no senescentes. El porcentaje de células senescentes se evaluó dividiendo el número de eventos brillantes por el número total de eventos. Los porcentajes de células senescentes son 0,8%, 15,78%, 26,31% para una dosis de 5, 25, y 50 nM de doxorrubicina, respectivamente.
| C12FDG ensayo | ensayo de β-galactosidasa | |
| Sensibilidad | + | - |
| Costo | = | = |
| Rendimiento | + | - |
| Duración del ensayo | - | + |
| Aplicabilidad al tipo de célula | = | = |
| Células | Células vivas | Celular fijo |
| Requerimiento de equipo especializado | Citómetro de flujo | Microscopio de campo brillante |
Tabla 1. . Ventajas y desventajas de la C 12 ensayo basado en citometría de FDG y la β-galactosidasa de ensayo (+) corresponde al mayor grado, mientras que (-) y (=) corresponden a grados menores y equivalente, respectivamente.
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Discussion
Presentamos aquí un método basado en citometría de flujo para cuantificar la senescencia celular en las células cancerosas vivas. Este método se basa en el uso del compuesto permeable a la membrana, el C 12 FDG, y por lo tanto se puede utilizar en cualquier tipo de células y después de varios tratamientos, siempre y cuando el compuesto es absorbido por las células. Tras la captación celular, el C 12 FDG es hidrolizado por la β-galactosidasa, enriquecido en los lisosomas de las células senescentes. Después de excitación láser, el compuesto emite fluorescencia verde, lo que permite la cuantificación de células senescentes. Esta cuantificación de la fluorescencia verde o bien se puede realizar por citometría de flujo o por microscopía de fluorescencia. Sin embargo, en este caso, las células fluorescentes tendrán que ser contados por el observador, lo que requiere tiempo. Puesto que el C 12 FDG es hidrolizado por la β-galactosidasa, este método permite, además de la cuantificación de células senescentes, para cuantificar la actividad de la β-galactosidasay la localización de la enzima, presente principalmente en vesículas lisosomales. Aunque el método es simple, debe prestarse atención en el paso 3. La detección exitosa de las células senescentes se basa principalmente en el pH adecuado de los lisosomas. Para ello, hemos utilizado bafilomicina A1 para neutralizar el pH ácido de los lisosomas. Dependiendo del tipo de células empleadas, podría no ser necesario este paso. Si se espera que la senescencia y no se detecta tinción, se sugiere incluir un control negativo para la bafilomicina A1 (sin bafilomicina) y para aumentar la concentración de bafilomicina A1. Si al hacerlo, asegúrese de que este aumento no induce la muerte celular. Alternativamente, bafilomicina A1 puede estar sustituido con cloroquina o cualquier otros compuestos que son capaces de aumentar el pH de los lisosomas.
Utilizando el protocolo descrito, se cuantificó con éxito el porcentaje de células senescentes en células de mieloma múltiple después del tratamiento con doxorrubicina dentro de un día. Este protocolo se puede utilizar en OTHer tipos de células cancerosas, sino también en tipos de células no cancerosas. El ensayo de β-galactosidasa popular y usado en exceso, por lo que también se debe controlar el pH celular, requiere al menos 2 días. De hecho el color azul máxima, obtenida después de la escisión de X-gal por la β-galactosidasa, se consigue después de 12-16 horas de incubación 9. Por tanto, este ensayo es más tiempo que el ensayo basado en citometría de propuesta. Por otra parte, este ensayo no es sensible, porque una célula azulado puede ser contado como células senescentes que, sin ser verdaderamente senescentes. La Tabla 1 recapitula las ventajas y desventajas de las dos técnicas.
La otra ventaja de este método es que puede ser acoplado con la inmunotinción de los responsables de la superficie celular. En el caso del mieloma múltiple, esto nos ha permitido demostrar que las múltiples células madre del cáncer de mieloma no envejecen siguiente tratamiento con doxorrubicina, mientras que las células madre no cancerosas hacen 12. La senescencia se ha demostrado que es pro-y anti-tumorigénicos. Dado que los medicamentos quimioterapéuticos pueden inducir la senescencia, el estudio de la senescencia podría ser importante en la clínica. Para este fin, los ensayos rápidos y sensibles tienen que ser utilizados, tal como el ensayo que hemos descrito aquí.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a la SF 4206 ICORE (Université de Caen) para el uso de la instalación citometría. JC recibió becas post-doctorales del Consejo de Radioprotección d'EDF y Conseil Régional de Basse-Normandie. Estos datos forman parte de los proyectos financiados por la Ligue Nationale Contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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