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Bioengineering

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Abstract

Les propriétés mécaniques des cellules et la matrice extracellulaire (MEC) jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la différenciation des cellules souches, la formation de tumeurs, et la cicatrisation des plaies. Les changements de raideur des cellules et ECM sont souvent des signes de changements dans la physiologie ou de maladies dans les tissus cellulaires. Par conséquent, la rigidité de la cellule est un indice pour évaluer l'état de cultures de cellules. Parmi la multitude de méthodes utilisées pour mesurer la rigidité des tissus et cellules, micro-indentation en utilisant un microscope à force atomique (AFM) fournit un moyen de mesurer de façon fiable la rigidité des cellules vivantes. Cette méthode a été largement appliquée pour caractériser la rigidité micro-échelle pour une variété de matériaux allant des surfaces métalliques dans les tissus et les cellules biologiques mous. Le principe de base de cette méthode est de mettre en retrait une cellule avec une pointe AFM de la géométrie sélectionnée et mesurer la force appliquée à partir de la flexion du cantilever AFM. Montage de la courbe force-indentation sur le mode Hertzl pour la géométrie de la pointe correspondante peut donner des mesures quantitatives de la rigidité du matériau. Cet article démontre la procédure pour caractériser la rigidité des cellules vivantes à l'aide de l'AFM. Les étapes clés, y compris le processus de calibration AFM, l'acquisition de force courbe, et l'analyse de données en utilisant une routine MATLAB sont démontrés. Les limites de cette méthode sont également discutés.

Introduction

Propriétés mécaniques, notamment la raideur, des cellules individuelles et leurs matrices extracellulaires environnantes (ECM) sont essentielles pour de nombreux processus biologiques, y compris la croissance cellulaire, la motilité, la division, la différenciation et l'homéostasie tissulaire. 1 Il a été démontré que les cellules rigidité mécanique est principalement déterminée par le cytosquelette, en particulier les réseaux de filaments d'actine et intermédiaires et d'autres protéines associées. 2 Les résultats des essais mécaniques sur des réseaux in vitro des filaments d'actine et intermédiaires suggèrent que les mécanismes cellulaires est largement dépendante de la structure du cytosquelette et la précontrainte dans le cytosquelette. 3-5 Rigidité de cellules vivantes est alors considéré comme un indice pour évaluer la structure du cytosquelette 6, l'activité myosine 7 et de nombreux autres processus cellulaires. Plus important encore, les changements dans les propriétés mécaniques cellulaires sont également souvent considérés comme étroitement associésATED avec diverses maladies telles que la formation de tumeurs et des métastases 8-10 Contrôle de la rigidité mécanique des cellules vivantes peut donc fournir un nouveau moyen de contrôler la physiologie cellulaire;. pour détecter et diagnostiquer les maladies 8;. et d'évaluer l'efficacité des traitements médicamenteux 11 , 12

Plusieurs méthodes, y compris microrheologie de traces de particules, 13-16 cytométrie de torsion magnétique, 17 micropipette aspiration 18,19 et microindentation 20-22 ont été développés pour mesurer l'élasticité des cellules. microrheologie de suivi des particules retrace les vibrations thermiques soit des particules fluorescentes submicroniques injectés dans des cellules ou des marqueurs fiduciaires à l'intérieur du cytosquelette de la cellule. 23 propriétés élastiques et visqueuses de cellules sont calculés à partir des déplacements des particules mesurées en utilisant le théorème de fluctuation-dissipation. 14,23 Cette méthode permet mesures simultanées de locauxpropriétés mécaniques à haute résolution spatiale à différents endroits dans une cellule. Cependant, l'injection de particules fluorescentes dans les cellules peut entraîner des changements dans la fonction cellulaire, la structure du cytosquelette, et donc les mécaniciens cellulaires. Procédé d'aspiration par micropipette applique une pression négative dans la micropipette de diamètre allant de 1 à 5 um d'aspirer un petit morceau de membrane de la cellule dans la pipette. la rigidité de la cellule est calculée à partir de la pression négative appliquée et de la déformation de la membrane cellulaire. 18 Cette méthode, cependant, ne peut pas détecter la distribution hétérogène de la rigidité à travers la cellule. La cytométrie en torsion magnétique (MTC) s'applique champ magnétique pour générer un couple sur des billes paramagnétiques super-attachés à la membrane cellulaire. 17 raideur cellulaire est dérivée de cette méthode à partir de la relation entre le couple appliqué et de la déformation de torsion de la membrane cellulaire. Il est difficile de contrôler l'emplacement des billes magnétiques dans la méthode MTC, et il est également challenging pour caractériser la déformation en torsion avec une grande résolution. Microindentation applique une indentation avec une géométrie bien définie de punch dans la cellule. La force de pénétration et le retrait résultant dans des cellules suivent souvent la prédiction du modèle Hertz. Des modules de Young de cellules peut être calculée à partir des courbes force-indentation en les équipant le modèle Hertz. Cette méthode a été largement appliquée pour tester les propriétés mécaniques des tissus et des cellules en dépit de ses limitations telles que l'incertitude dans la détermination du point de contact, l'applicabilité du modèle Hertz, et le potentiel d'endommager physiquement les cellules. Parmi les nombreux dispositifs pour microindentaion 20, le microscope à force atomique (AFM) est disponible dans le commerce et a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules et des tissus vivants 21,24-27.

Cet article démontre la procédure d'utilisation d'un asile MFP3D-Bio AFM pour caractériser les mécanismes cellulaires. AFM pas surment fournit une topographie à haute résolution de cellules, mais aussi a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules des tissus. Le principe de l'AFM indentation est illustrée à la figure 1. Le cantilever AFM se rapproche de la cellule à partir de quelques micromètres ci-dessus; entre en contact avec la cellule; tirets la cellule de sorte que la déviation en porte à faux atteigne une valeur de consigne présélectionnée, et se détache de la cellule. Au cours de ce processus, la déviation du cantilever est enregistrée en fonction de sa position comme indiqué sur la figure 1. Avant de prendre contact avec la cellule, la console se déplace dans le milieu sans aucune déviation apparente. Lorsque l'indentation sur la cellule, les coudes en porte à faux et le signal déviation augmente. Les leviers sont modélisés comme des poutres élastiques de telle sorte que leur déviation est proportionnelle à la force appliquée à la cellule. En réglant la déformation maximale en porte à faux, l'amplitude maximale de la force appliquée à l'échantillon est limitée pour éviter dAmage aux cellules. La portion de la courbe de force du point B au point C de la figure 1, où les tirets de pointe dans la cellule, n'est pas propre au modèle hertz pour extraire la rigidité de la cellule.

Figure 1
Figure 1. Illustration de l'AFM microindentation et l'interprétation de la courbe de force. Le panneau supérieur montre le mouvement de l'AFM cantilever entraîné par le scanner piezo. La position verticale Z du cantilever et la déviation en porte à faux signal D est enregistrée au cours du processus. Le porte à faux commence à partir du point A, de quelques microns au dessus de la cellule. En se rapprochant de la cellule, l'échantillon indentation δ reste nulle jusqu'à ce qu'il atteigne le point B, où la pointe est en contact avec la cellule. Les coordonnées du point B dans le complot sont des valeurs critiquespour l'analyse de données, notée (z 0, n 0>). De B ​​à C, les tirets en porte à faux dans la cellule jusqu'à ce que la déflection du cantilever atteint un point de consigne, qui est défini comme le rapport entre la force de pénétration maximale ciblée et la constante de ressort cantilever. Une fois le signal de déviation atteint la valeur maximale prédéterminée, le cantilever est alors retiré de la cellule à un point d, où elle souvent être tiré vers le bas en raison de pointe-échantillon adhésion, se détache de la cellule et revient à sa position initiale à e. Le panneau de droite illustre la relation entre le retrait et le z enregistrée et le signal d. Dans la partie inférieure gauche est un tracé d'une courbe représentative de la force, l'indentation maximum d'un porte à faux, dont la constante de ressort est mesurée comme étant de 0.07N / m, est réglé pour être 17 nm de telle sorte que la force maximale indentation appliquée à l'échantillon est de 1,2 nn. Les endroits clés au cours de l'indentation sont marquées.

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Protocol

1. Calibrer la constante de ressort cantilever

  1. Chargez le cantilever dans le AFM conformément aux instructions du fabricant. Il est nécessaire de nettoyer le support en porte à faux avec de l'éthanol avant toute expérimentation. Cela permettra de limiter la contamination bactérienne de la culture au cours des mesures AFM.
  2. Calibrer InvOLS (Inverse Sensibilité de levier optique). Ce paramètre décrit la quantité de réponse de la photodiode (Volts) par nanomètre de déflection du cantilever.
  3. Charger une lame de verre propre sur la scène de l'échantillon, puis installez la tête AFM et régler le faisceau laser et l'alignement conformément aux instructions du fabricant. Engager la pointe de l'AFM sur la lame de verre.
  4. Avec l'élément piézo retirée, réaligner le miroir à une lecture de la photodiode de -2 V. effectuer une mesure de spectroscopie de force avec un seuil de déclenchement (réponse maximale de photodiodes) de 2 V.
  5. Avec le piezo retirée, réaligner le miroir à une lecture de la photodiode de -2 V. Effectuez une force mesure spectroscopie avec un seuil de déclenchement (maximum de réponse de la photodiode) de +2 V. Remarque: Les valeurs de tension ici sont spécifiques à l'asile AFM. Cette valeur doit être définie selon les spécifications fournies par le fabricant.
    Après l'acquisition des données est terminée, un zoom sur la région firme contact de la courbe de force. Effectuez un ajustement linéaire dans cette région pour trouver la pente, qui sera en V / nm. La réciproque de cette valeur décrit la sensibilité optique de l'ensemble cantilever-photodiode.
  6. Rétablir l'alignement du miroir à une déviation libre de 0 V.
  7. Calibrer la constante de ressort en porte à faux. Procédé thermique air est utilisé pour déterminer la constante de ressort en porte à faux 28.
  8. Après avoir calibré le InvOLS, élever le scanner loin de la scène de l'échantillon tel qu'il n'y a pas d'interactions entre la pointe et l'échantillon.
  9. Commencez la capture des données thermiques. Au cours de ce processus, la vibration thermique de la poutre en porte à faux est Recorded. Le logiciel AFM analyse un spectre de puissance d'une telle vibration thermique et parcelles dans une fenêtre de données.
  10. Après quelques secondes d'acquisition de données, effectuer un ajustement pour le segment de données centrée sur le bas-fréquence (résonance fondamentale) de pointe pour déterminer la constante de rappel.

2. Chargement de l'échantillon

  1. Installez l'accessoire de chauffe-plat sur la scène AFM, si ce n'est pas déjà équipé.
  2. Réglez la température à 37 ° C, et d'attendre 20 min pour que le système atteigne un équilibre thermique stable.
  3. Placez la boîte de culture sur la scène AFM et le fixer à l'aide de la pince fournie avec le chauffe-plat. Il est important de réduire au minimum le délai entre le retrait de l'antenne de l'incubateur et le placer sur la scène, afin d'éviter un traumatisme pour les cellules. Pour des mesures de plus de 30 min, média indépendant CO 2 devrait être utilisé pour remplacer le milieu de culture normal.
  4. Appliquez une petite goutte de 37 ° C le milieu de culture à la pointe du til AFM cantilever, et baisser la tête AFM jusqu'à ce que la pointe est juste immergé dans un liquide.
  5. Utilisation du haut-vue de la caméra CCD, réaligner le faisceau laser sur le cantilever (l'alignement dans un liquide sera différente de celle de l'air, à cause de la variation de l'indice de réfraction du milieu).
  6. Engager la pointe de l'AFM sur une zone propre de la boîte de culture.
  7. Effectuer le calibrage des InvOLS tel que décrit ci-dessus, pour la sensibilité en porte à faux dans le milieu liquide.

Remarque: a) Lorsque les cellules sont mises en culture sur des hydrogels, l'étalonnage de InvOLS doivent être effectués à l'avance sur la surface de fond d'une boîte de culture remplie de milieu de culture de cellules. Lors du passage à des échantillons de cellules, une attention particulière doit être portée à ne pas modifier l'alignement du faisceau laser avec la console. b) InvOLS doit être recalibré à chaque fois qu'il ya un changement dans l'alignement laser. c) Il est également recommandé de prendre InvOLS que la moyenne de la valeur à partir de plusieurs courbes d'étalonnage, sepuis chaque calibrage génère un autre InvOLS. La variation de InvOLS est, cependant, comparé à la valeur moyenne de petite taille. Par exemple, l'étalonnage d'un Bruker DNP-10 en porte à faux avec une constante de 0,06 N / m en liquide de 100 fois au printemps produire une valeur de InvOLS moyenne de 66,3 nm / V, avec un écart type de seulement 0,5 nm / V.

3. Collecte courbes de force d'indentation Cell

  1. Sélectionnez une cellule pour l'indentation. A l'aide d'un microscope optique, déplacer la platine pour positionner le porte à faux au-dessus de la cellule de telle sorte que la pointe se situe dans la région péri-noyaux. Le réglage précis de la position en porte à faux peut être réalisée en appliquant des compensations à l'X et Y scanners.
    Remarque: Le cantilever AFM doit être retirée de la surface de l'échantillon tout en déplaçant la platine porte-échantillon pour sélectionner une cellule cible. Cela protège le cantilever de frapper dans l'échantillon, puisque la surface de l'échantillon ne peut être plat.
  2. Commute en mode de spectroscopie. Réglez l'indentationtaux dans la plage de 1 à 10 um / sec, assez faible pour éviter des effets hydrodynamiques.
  3. Réglez le point de déclenchement de déviation, ce qui limite l'effort maximal en retrait pour éviter d'endommager les cellules. Sélectionner l'option de déclenchement relative, ce qui permettra de corriger toute dérive dans le signal de déviation. A force maximale de 2 nn est un bon point de départ pour la plupart des échantillons. Cette valeur doit cependant être ajustée en fonction de la rigidité de l'échantillon. Pour les échantillons mous une valeur inférieure devrait être utilisé pour éviter indentation excessive de l'échantillon. Pour les échantillons raides une grande valeur doit être utilisée pour générer indentation mesurable.
  4. De régler la distance de la force suffisamment grande pour que la pointe sera complètement détachée de la cellule entre la mesure de force. Habituellement, la distance de la force est fixé à 5 um.
  5. Commander l'AFM de prendre une courbe de force unique.
  6. Recueillir au moins trois courbes de force à différents endroits dans la région péri-noyaux de chaque cellule. Bien qu'il soit avantageux de prendre multiplecourbes sur chaque cellule de données statistiques fiables, en prenant trop de courbes de force peuvent conduire à des changements dans la rigidité de la cellule due au stress de la sonde AFM.
  7. Lorsque la collecte des données est terminée, retirer la pointe, et répétez les étapes 3.1-3.6 pour autant de cellules que nécessaire pour de bonnes données statistiques sur la rigidité de la cellule sous une certaine condition de l'échantillon. Habituellement, les 30 cellules sont mesurées pour chaque condition.

Pour caractériser la répartition de rigidité dans une cellule unique, le mode de la carte de force est appliquée. Dans le mode Force-carte, définissez une taille de numérisation afin d'inclure la région d'intérêt; définir une résolution appropriée; définir les paramètres d'indentation que ceux choisis pour les courbes de force mono; l'AFM sera alors raster dans la zone de l'échantillon défini et de prendre des courbes de force mono au niveau de chaque pixel dans la région de l'échantillon.

4. Analyse des données

Les courbes de force enregistrées sont analysées à l'aide d'une procédure MATLAB coutume de calculer la rigidité de la cellule. Ce qui suit est une brève description de la procédure MATLAB:

  1. Le programme MATLAB identifie le point de contact coordonne z0 et d0 (voir la figure 1) en utilisant un algorithme adopté d'une méthode publiée par Lin et al 29.:
  2. Pour chaque point de données dans la courbe de force, effectuer un ajustement linéaire des données vers la gauche du point d'intérêt, et un modèle Hertz correspond à la droite (à l'aide du point sélectionné en tant que premier point de contact), jusqu'à l'ensemble indentation maximale (200-300 nm recommandé).
  3. Pour chaque point, calculer l'erreur RMS relative des deux crises et additionner ces valeurs.
  4. Le point qui atteint l'erreur de montage totale minimum est sélectionné comme premier point de contact.
    Note: Le temps de calcul peut être réduit par la mise en œuvre d'une recherche-section d'or plutôt que linéaire balayage de la courbe de force entière.
  5. Exemple de déformation δ et l'indentation force F sont calculés comme suit:
    Équation 1
  6. Ferrure des moindres carrés est appliqué pour s'adapter à la F c données δ dans la région après le contact, z ≥ z 0, le modèle Hertz pour extraire le module d'Young, E de la cellule:
    Équation 2
    , Où v est le coefficient de Poisson.
    Remarque: lorsque δ est supérieur à 10% de l'épaisseur de l'échantillon (hauteur de la cellule), la rigidité de la cellule de mesure est influencée par la rigidité du substrat. L'épaisseur de la région péri-nucléaire est habituellement de l'ordre de quelques micromètres. Par conséquent, seuls les premiers 200-300 nm de courbe δ F est apte au modèle Hertz.

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Representative Results

Figure 2a montre trois courbes de force représentatifs prélevés à partir de fibroblastes 3T3 cultivées sur une surface en plastique, gel de polyacrylamide des modules 3000 Pa de Young et 17.000 Pa, respectivement. Après identifiant soigneusement les points de contact dans les courbes, la force de pénétration en fonction de la déformation de la cellule est représentée sur la figure 2b. Sous une force de magnitude inférieure à 0,3 nN, une pyramide pleine forme, alinéas 3 micromètres dans une cellule en culture sur une kPa gel de polyacrylamide 3. En revanche, une force de plus de 1,6 nN est nécessaire pour mettre en retrait à 500 nanomètres dans la cellule cultivée sur boîte de Pétri plaine utilisant le même embout. Il ressort clairement de ce graphique que la cellule cultivée sur un gel de polyacrylamide douce est plus doux que la cellule en culture sur le plat de culture raide. Mise en place du premier segment (δ <30 nm) des courbes force-δ au modèle Hertz donne des modules de Young de ces trois cellules de 10 kPa, 1,2 kPa et 1,10 kPa, respectivement. Cellules de la culture plat sont 100 fois plus rigide que des cellules cultivées sur des gels de polyacrylamide. Solon et al. Ont rapporté des résultats similaires 25. Ils ont constaté que les fibroblastes se raidissent activement leurs cytosquelettes pour correspondre à la rigidité des substrats ils adhérer. Beaucoup d'autres types de cellules ont également été signalés à devenir plus rigides lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats rigides 30.

Il est important de noter que le retrait peut provoquer une déformation plastique dans les cellules, ce qui entraîne Kinks comme illustré dans la courbe violette. Normalement, ces courbes doivent être exclus de l'analyse des données. Cependant, la courbe peut toujours être utilisé pour calculer la rigidité de la cellule si le pli est au-delà de la gamme des données ajustées. Par exemple, le point d'inflexion de la courbe mauve se produit à environ 400 nm. Cette courbe peut encore être analysé en ajustant les données uniquement jusqu'à δ = 30 nm pour le modèle de Hertz pour donner une valeur de rigidité de 1,2 kPa. Il est également important d'ajuster le "point de déclenchement", selon èmee échantillon rigidité. Par exemple, la courbe bleue est prise à partir d'une cellule doux cultivé sur une kPa gel de polyacrylamide 3. Réglage du point de déclenchement de déviation par rapport à 5 nm, la pointe retraits AFM 3 micromètres dans la cellule. Une telle grande échancrure doit être évitée pendant les mesures de rigidité de la cellule, car elle pourrait entraîner une rupture de la membrane cellulaire et de tuer la cellule. Beaucoup d'autres facteurs, notamment le taux d'acquisition de la vitesse et de données pointe lors de l'acquisition de la courbe de force peuvent affecter la qualité des courbes de force acquises et donc la rigidité des cellules 31 qui en résulte. Pour effectuer des mesures fiables, il est nécessaire d'ajuster les tous ces paramètres pour acquérir des courbes de force «propre» que la courbe rouge montre la figure 2a, qui a un rôle pré-contact plane suivie d'une augmentation de partie après le contact non linéaire.

Figure 3a montre une image de fluorescence à partir d'un fibroblaste 3T3 sur une boîte de culture cellulaire. La cellule est transfectées avec GFP vimentine,un type de filaments intermédiaires. AFM travail de cartographie a été réalisée dans ce 80 um par 80 zone de um, avec une résolution de 32 x 32 pixels. La carte de rigidité obtenue est représentée sur la figure 3b. La raideur varie à travers la cellule. Et, dans la région de lamellipode est plus rigide et plus hétérogènes que la région péri-nucléaire, qui entoure le noyau rigide.

Figure 2
Figure 2. données de la courbe de la force et de la courbe force-indentation analysé. a) Un ensemble de trois données de la courbe de la force de représentation acquis pour les fibroblastes 3T3 cultivées sur verre (rouge), 17 kPa gel de polyacrylamide (violet), et 3 kPa gel de polyacrylamide (bleu). Les courbes sont décalées de sorte que le point de contact (Z 0, n 0) est situé à l'origine (0,0) de la coordonnéesystème. b) Les courbes indentation de force calculée à partir de a) et de mise en place des données d'indentation au modèle de Hertz en utilisant seulement les 300 premiers nm de l'indentation. Encart dans b) montre la qualité de l'ajustement du modèle Hertz pour les premiers 300 nm d'indentation, les cercles sont des données expérimentales, les lignes représentent les données d'ajustement. La constante de ressort cantilever est 0,062 N / m dans ce cas.

Figure 3
Figure 3. a) image de fluorescence d'un fibroblaste 3T3 transfectées avec GFP vimentine. Seule une partie de la cellule est montré dans l'image. Barre d'échelle représente 20 um. b) A 32 x 32 pixels de la carte de la raideur de la même zone. Chaque pixel représente 2,5 um.

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Discussion

La méthode d'indentation AFM a des avantages pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes. Quoique moins sensible que la cytométrie de torsion magnétique et pinces optiques, qui peuvent mesurer des forces sur le plan piconewton 32, l'AFM permet de détecter la force de résistance à partir d'échantillons allant de quelques dizaines de pico-Newton à des centaines de nano-Newton, comparables à aller de force peut être appliqué à des cellules à l'aide d'une micropipette 19. Cette gamme de vigueur s'adapte aux besoins de créer des déformations mesurables dans tous les types de cellules 19. La haute résolution spatiale, il est possible de caractériser au niveau sub-micronique les hétérogénéités dans les tissus et dans les cellules individuelles 33. Il permet également de mesures de cellules vivantes en temps réel. Plusieurs modèles AFM conçus pour les échantillons biologiques peuvent fonctionner dans un environnement fluide et sont équipées avec des étapes de prélèvement chauffées, qui permettent un contrôle précis de la température, ce qui permet de maintenir un environnement physiologiquenement pour les cellules vivantes pendant les mesures. AFM indentation a été appliquée avec succès pour mesurer les propriétés mécaniques d'un éventail de types de cellules, 25,34-36 et a été largement utilisé pour évaluer les changements dans les propriétés mécaniques des cellules associées à la différenciation cellulaire et dans des contextes différents malades. 30,37

Une étape importante pour le calcul de la rigidité de la force de la courbe est d'identifier le point où la pointe d'abord en contact avec la cellule. L'incertitude au point de contact peut affecter le module d'élasticité 31. Pour les matériaux rigides, le signal de déviation augmente brusquement après le contact pointe-échantillon, et le point de contact est facilement identifié comme point tournant dans les courbes. Un tel tournant forte, cependant, souvent n'apparaît pas dans les courbes en vigueur à partir de cellules, en raison de la faible rigidité de la cellule (voir figure 2). Un code MATLAB est développé pour trouver avec précision les points de contact dans les courbes de forceà partir d'échantillons mous à l'aide de l'algorithme proposé par Lin et al. 29 Le code peut manipuler les courbes de force à partir d'échantillons mous, ce qui nous permet d'automatiser le processus d'analyse des données en recherchant automatiquement le point de contact et ajustant les données de l'indentation pour modèle Hertz. Le code MATLAB est appliquée pour déterminer les points de contact dans les 60 courbes de force prises au même endroit d'un gel de polyacrylamide, dont la rigidité a été mesurée à 7,2 kPa par des mesures de rhéologie. Le code détecté points de contact dans ces courbes. La plage de variation en contact emplacement de point est plus petit que 15 nm. Sur la base de ces points de contact, la rigidité moyenne calculée est de 6,9 ​​kPa, l'écart type est de 0,2 kPa, et la portée maximale de variation de 0,6 kPa. Les résultats de cette expérience fournissent une mesure pour évaluer l'incertitude de la rigidité mesurée. L'incertitude de 15 nm dans les résultats de point de contact en une incertitude sur la raideur qui est inférieure à 10% de la moyenne précieuxe. Pour les gels doux à très faible niveau de signal de déviation, l'incertitude au point de contact peut être aussi élevé que 30 nm, ce qui conduit à une incertitude dans la rigidité aussi élevée que 30%. Le code est disponible en complément de cet article.

AFM peut mesurer de façon fiable la rigidité allant de moins de 100 Pa à 10 6 Pa, couvrant toute la gamme de rigidité pour la plupart des tissus et des cellules. Pour des mesures fiables, il est important de sélectionner les cantilevers AFM avec des constantes de printemps bien adapté à la rigidité de l'échantillon. Lorsque la console est trop raide, sa déviation est trop faible pour détecter et cela pourrait endommager la cellule, si la console est trop mou, il ne sera pas tiret de la cellule suffisamment pour obtenir des propriétés physiques fiables et de ses vibrations thermiques peut dominer la courbe de force. Cantilevers de 0,06 N / m avec une pointe de pyramide sont applicables à la plupart des types de cellules cultivées sur des boîtes de culture raides. Ces encorbellements, cependant, ne sont pas applicables à mesurer des cellules cultivées sursubstrats souples. Comme le montre la figure 2, la cellule cultivées sur un gel de polyacrylamide Pa 3000 est si doux que um indentation 3 est nécessaire pour générer une déviation de 5 nm dans la console. La courbe de force est si plat qu'il ya très peu de différence entre le pré-contact et région post-contacts. Cela conduit à une grande incertitude sur le point de contact et donc les valeurs de rigidité résultant. L'utilisation d'un cantilever douce améliore seulement légèrement le contraste entre le pré-contact et les régions post-contact. À la mesure de tels matériaux souples, cantilevers avec une grande pointe sphérique sont recommandés. A 0,06 N / m en porte à faux avec une pointe sphérique de 10 micromètres de diamètre peut être appliquée pour mesurer les échantillons avec une rigidité inférieure à 100 Pa. Cantilevers avec embout sphérique sont disponibles dans le commerce auprès de nombreux fournisseurs. Ils peuvent également être fabriqués sur mesure par les microsphères de collage de cantilevers sans pointe. Les conseils sphériques fournissent plus signal de déviation et éviter d'endommager la membrane cellulaire. Houtefois, ils ne sont pas applicables pour la cartographie de la rigidité à haute résolution en raison de leur grande surface de contact avec les cellules. Tableau 1 fournit une liste des sondes AFM recommandées pour les mesures de rigidité de la cellule.

Modèle constante de ressort (N / m) Type de panne rayon de pointe (nm)
Bruker DNP10-D 0,06 Pyramide 20
Bruker MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 Pyramide 20
NovaScan PT.GS 0.01/0.03/0.06 sphère de verre 2.000 / 5.000 / 10.000
NovaScan PT.PS 0.01/0.03/0.06 Sphère de polystyrène 1.000 / 4.500 / 10.000

Tableau 1. Un soilection des sondes AFM avec la constante de rappel applicable et la géométrie de pointe pour l'indentation de la cellule.

Les limites de la méthode présentée doivent être également indiqués. Le modèle Hertz qui a été appliquée pour ajuster les données d'indentation est un modèle simpliste. Il prédit la relation force-indentation pour indentations infinitésimales de matériaux purement élastiques par des pénétrateurs axisymétriques. Certaines des hypothèses du modèle Hertz ne s'appliquent pas à l'échancrure de la cellule.

Le modèle Hertz suppose matériau homogène et élastique linéaire, tandis qu'une cellule est hétérogène (voir Figure 3) et non linéaire élastique. Dans la région de lamellipode, il est plutôt hétérogène en raison de la structure hétérogène du cytosquelette d'actine. La rigidité mécanique de la cellule est rapporté que la rigidité moyenne à partir des trois ou plusieurs courbes de force acquises à partir de la région périnucléaire relativement homogène. 25,36 Reconstitué networks de l'actine et intermédiaire filament sont des matériaux souche raidissement, c'est à dire qu'ils sont plus rigides à de plus grandes déformations. 38,39 Une telle élasticité non linéaire a été observée pour les cellules vivantes, mais pas pris en compte dans le modèle Hertz. Pour limiter l'effet de l'élasticité non linéaire de la rigidité de la cellule rapporté, seuls les 300 premiers nm de l'indentation de données est intègre dans le modèle de Hertz.

Il est également supposé dans le modèle Hertz que les matériaux sont purement élastique. Cependant, les cellules et leur cytosquelette sont des matériaux visco-élastiques à raideur dépend de l'échelle de temps des mesures. A l'échelle de temps plus courte, la déflection du cantilever provient principalement de la réponse élastique des cellules. A l'échelle de temps longue, cependant, l'échantillon se glisse et donne plus de souplesse. L'échelle de temps de l'AFM indentation est contrôlée par la vitesse de pointe. Ainsi, la différence observée dans la rigidité de la cellule n'a de sens que lorsque les courbes de force sont acquises avec le même velo d'indentationville. Pour extraire quantitativement la visco-élasticité dépendant de la fréquence des cellules, la méthode AFM "modulation de force» a été développé en appliquant fréquence petites oscillations de forte amplitude sur une plus grande empreinte 21,27.

L'hypothèse d'une épaisseur de l'échantillon infini dans le modèle Hertz ne s'applique pas pour les cellules. Les cellules sont généralement de quelques micromètres d'épaisseur dans la région périnucléaire, et à quelques centaines de nanomètres d'épaisseur dans la région lamelles. Des corrections ont été apportées pour tenir compte de l'épaisseur de l'échantillon fini. 31,40 Les données acquises par la force de cartographie contient à la fois des données d'indentation et les données de la hauteur de la cellule. Épaisseur de l'échantillon local peut être calculée à partir des données de hauteur. Autres travaux seront nécessaires pour mettre en œuvre les échantillons corrections d'épaisseur dans l'analyse de données sur la population de cartographie.

En résumé, cet article présente un protocole pour caractériser la rigidité mécanique des cellules vivantes en utilisant un asile MFP3D-Bio MICR à force atomiqueoscope. Les principes de fonctionnement AFM et la procédure d'analyse des données MATLAB sont applicables à tous les autres modèles AFM. Au cours des dernières années, les techniques de microscopie optique, y compris champ lumineux, la microscopie confocale et la microscopie totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) ont été combinés avec l'AFM pour l'imagerie en temps réel des cellules à des stimuli mécaniques. 41,42 Ces configurations permettent également des mesures simultanées de mécanique des cellules et l'imagerie des composants du cytosquelette. Corréler les données de rigidité locale à la distribution des composants du cytosquelette fournira des informations locales bien comment les composantes du cytosquelette contribuent à la mécanique des cellules.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Paul Janmey à l'Université de Pennsylvanie pour fournir des lignées cellulaires utilisées dans le présent document. QW reconnaît également JF Byfield et Evan Anderson pour leurs discussions éclairées sur les techniques AFM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

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