Summary
渔业引起的变化，以利用甲壳类水产，如美国龙虾捕捞业，有可能影响他们的生育动态，导致交配成功的减少。这项研究的目标是开发以确定女性龙虾，可能是生理上或功能上的成熟的交配成功一种无创性的方法。
Abstract
尽管是在西北大西洋最有生产力的渔场之一，还有许多未知的关于美国龙虾自然繁殖动态。最近在利用甲壳类人群（螃蟹和龙虾）的研究表明，在有些情况下成熟的女性是无法充分实现其生殖潜力，由于精子的限制。为了检验这种可能性在美国龙虾渔业的不同区域，一个可靠的无创方法，在海上采样大批女性龙虾的开发。该方法涉及将一个钝头针头插入女性的精液接受器来确定精子塞的存在或不存在和撤回，可检查精子的存在的样品。一系列控制研究是在码头和在实验室中进行的，以测试该技术的可靠性。这些努力entailed抽样294女龙虾，确认存在Õ发精子插头是精液的容器内的可靠指标，因此，交配。本文详细说明的方法及从采样的总位女性的子集所获得的结果。从乔治的银行和海角安，马取样的230女龙虾（尺寸范围= 71-145毫米，背甲长），90.3％呈阳性的精子。潜在的解释为没有精子在女性的一些包括：不成熟（缺乏生理成熟），精子插件被用来卵子受精的离合器故障后，和缺乏交配活动。调查表明，该技术用于检查雌性龙虾的交配成功是一个可靠的代理，可用于在现场对文件生殖活动中自然种群。
Introduction
美国龙虾（ 美洲螯龙虾 ）是在北大西洋（〜56,000吨，2011年，价值超过390,000,000元）1最有生产力的渔场之一。然而，有关于这个物种的野生种群的繁殖动力学普遍缺乏了解。生成繁殖输出更准确的估计，包括个人的积极参与繁殖的数量和大小，可以提高该股的评估过程。例如，女性是从实现其全部潜能的生殖防止因精子限制已被确定为几个商业开发海洋甲壳类动物，包括一个担忧：多刺龙虾2，蓝蟹3，帝王蟹4，石蟹5，和雪蟹6。总的目标是，以确定是否精子的限制可能是在美国龙虾渔业某些地区的一个因素也是如此。
NT“>，同时进行与产卵雌龙虾无关的标记研究（有明显完好无损，最近挤压蛋）的龙虾潜在的精子限制问题的第一个征象进行观察。夺回渔民报告表明，〜这些动物的15％已下降他们的鸡蛋离合器只有1-2个月后的工作假设是，一些龙虾携带了那些尚未被受精卵，并作为结果，“掉下来”7。从随后的研究的初步数据已经证实的事实，将龙虾挤出鸡蛋即使他们没有成功交配而这些未受精的卵子只携带〜1 第八个月，因此，给出的观测女性携带未受精的卵子在自然种群中，我们试图确定到精子的限制可能会造成程度由性成熟龙虾再现的次最大水平。为了实现这一目标，一种技术被开发，以检测spermato交配过程中phore沉积男性。本文和视频描述为确定女性龙虾交配成功开发出一种无创，简便的方法。该技术可以快速，可靠地使用在海上，无论是乘坐研究或商业渔船。这种抽样方法的细节，以及一些有代表性的研究结果说明了该技术的应用。
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Protocol
A部分：现场抽样技术
1。女性三围
- 对于每个雌性龙虾，测量头胸甲长（CL）和所述第二腹节到使用一对卡尺的最接近1.0毫米的宽度。
注意：第二腹节进行测量，因为腹部（其中女性随身携带的蛋）的宽度是性成熟的一个指标。此外，它可能是有利的，以确定蜕皮阶段以后配合生殖阶段这些数据（参见步骤1.2）。 - 夹一小部分远端关闭腹腔腹足之一（龙虾标准的方法论协议）和腹足清洁海水储存后用解剖显微镜观察9。
注意：此步骤可能也露出水泥腺体对腹肢，这是女性正准备挤出它们的卵10指示的存在。
2。樱雪针rtion
- 将注射器针头（18克， 见表1）〜1厘米的精液接受器，向着尾巴〜45°（ 图1）的角度。
注意：在龙虾与完整的精子塞，针可能会遇到一些阻力插入过程中，因为它是通过精子插头之前将精子的浓度最高的精液容器的底部（ 图1）推压。
注意：插头的存在，本身就是一个可靠的指标，有龙虾交配。在一些动物可能有很小的阻力，这可能是因为没有精囊存在，精囊是小的，它没有硬化成一个插头还，或者它可能已经被用于受精的鸡蛋中的一个或多个离合器。
图1。针插入和视图的龙虾精液插座。插入钝头针头插入龙虾的精液接受器中提取精子样本。针的角度和深度都在取得一致的样品是至关重要的。右：查看已解剖和垂直分割的一个开创性的插座。精子塞占据了容器的顶部或最外部分，而精子位于所述容器的底部（最深点）。需要注意的是低于这个深度取样可能刺破插座，并导致血液污染的样品中是很重要的。 点击这里查看大图 。
3。穿透精子插件
- 最初的插入后，陡针头至接近垂直的角度（垂直于身体轴），并非常缓慢地开始工作，它向下插入插座。
- 保持倾斜一个角度针，使针尖朝向尾部略尖。在这种情况下，针尖压缩所述插头的顶部，直到它最终渗透到基质中。
- 继续针头慢慢往下压，直到感觉到阻力再一次 - 这是插座的底部，并在那里被抽取的样品。
4。去除精子
- 从容器的底部取出的样品（通常固体插塞材料，液体精子和其它流体）和采样存入一个标记2.0毫升塑料管。
- 冲洗容器用〜0.1-0.5毫升冷海水。
- 在同一管除去约0.3ml的流体和地点。
- 冰商店精子样本，直到他们可以在实验室进行检查。
B部分：精子样本在实验室考试
注：从个人的升精液的容器取出样品 obsters进行检查，以确定是否精子细胞存在或不存在。 - 从每个塑料管，地方与盖玻片载玻片上，并认为在100X有一个复式显微镜取出〜50微升的液体。
- 分数的样本为：精子稀少，众多的，或不存在（此研究没有实际的量化精子数， 图2）。
图2。龙虾的精子样本图像。从女性的精液接受器取，作为观察与复合式显微镜放大40倍龙虾精子样本图像。图像上的左显示，含有大量的精子，而另一（右）示出了一个稀疏样本（比例尺= 10μm）的一个样本。jpg“格式目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Representative Results
这里报道的数据是针对源于近岸和近海地区的女性龙虾的一个子集。近岸组包括被抓获的近海角安，马萨诸塞州沿海水域及运送冷却器实验室检查44龙虾。共有186近海龙虾被抓获乔治银行和采样在新罕布什尔州举行的商业设施。
精子样品是从所有的动物中，根据上述方法获得的，并立即检查精子的存在与否。总共在这个子集的所有女性90.3％有精子在他们的精液的容器。出人意料的是，那些缺乏精子不一定在尺寸范围较小的一端（ 图3）。
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图3。抽检结果精子的龙虾存在。％的女性龙虾以5 mm CL大小类垃圾桶里有精子在精液的容器（百分比阳性）作为交配的一个指标。女性被抓获从附近海域海角安，马（71-83毫米发光）和佐治银行（89-154毫米CL）。酒吧里面的数字代表总样本大小的纸槽。 点击这里查看大图 。
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Discussion
这部影片和纸提纲，并展示用于确定雌性龙虾已经成功交配的方法。这种方法是很简单的，它可以由多种用户用于龙虾海上大规模抽样。该方法是基于检测精荚的传递从男女龙虾交配时精液容器的存在。这些精荚局部变硬成精子塞它们存放在容器后不久，因此，精子塞的存在也表明交配成功。在这项研究中，以及一个随后的更大的研究，已确定，大部分精子插头已精子与它们相关联11。然而，在一个插头的存在交配行为的一个可靠的指标，它的缺失是没有的。
虽然我们不能完全肯定，如果这个抽样的方法招致对女性龙虾的能力产生不利影响产卵的ð成功受精的卵子离合器，有问题到这个精子取样协议表明，受损也很少要么精囊或插座。有数据（从正在进行的实验室研究），表明一些龙虾，后期精子取样，仍然挤出鸡蛋（N = 3）受精离合器和能够受精的鸡蛋超过一个离合器使用相同的精荚的。这些卵发育和孵化类似于那些尚未被取样龙虾。此外，这种采样技术仅用于样品的总精子的一小部分。它并不旨在定量样品的容器的全部内容。由于插座12,13的复杂的物理体系结构，不同的技术（ 如剥离）将需要获得这些类型的结果。
精子中发现了一些采样的动物，缺乏精子塞的，可能是因为精囊相对ÑEW，并且尚未硬化成一个插件，或精囊以前被用来受精的鸡蛋中的一个或多个离合器和已经恶化。因此，为了获得交配成功的最准确的索引是很重要的两个核的精子插头和样品精液。
在采样过程中，所述针的准确定位是非常重要的几个原因。第一，保证针头平行于车身的横向平面阻止它穿透精液接受器的薄边。当被正确地执行的技术中，虽然没有对死亡率，当针实际上从未穿过体腔中。第二，在45°角插入，随后将针的变陡，有助于确保针头到达容器，其中精子都集中而未穿过精囊的壁并进入相邻的体窦的底部（ 图1） 。
13的结果。一旦精子有反应，就开始分解样品中，成为难以鉴别。出于这个原因，在样品瓶的搅拌应保持在最低限度。保持样品酷似乎也有助于保持精子的完整性。最后，建议当样本处理用灭菌海水。这可能会采取行动，最大限度地减少细菌和其他微生物的生长（超过36-48小时），可能损害精子。
采样女性龙虾大部分（90.3％）已成功交配的基础上，精子在他们的精液的容器的存在。该动物的其余部分可能不会有精子积极的，因为他们要么是性不成熟，他们的精子插头已经恶化随着时间的推移，或有可恩充分利用受精蛋中的一个或多个离合器，或者他们从来没有交配，可能是因为他们从来没有在他们的蜕皮周期11遇到一个合适的男人在适当的时间。在乔治的银行区女龙虾有一个比较大的规模，在到期日，只有50％的女性的成熟，处于100毫米14。 Cape Ann的成熟女性在做比近海龙虾，与女性的50％为90mm成熟CL 15略小的尺寸。因此，考虑到最小的雌性71毫米CL，这是不是不合理的建议，一些缺乏精子塞的女性很可能不成熟，因此，也不会交配。许多大型女性龙虾，如采样离岸子集，可能会产生连续多年无蜕皮和remating 16。
使用相同的精囊多个施肥，最终可能导致插塞材料的细目和最多可以使用包含在接收已精子ACLE，得到一个否定的结果。然而，精子插头随时间的机械故障还没有，就我们所知，已有描述。最终，有可能，那些雌性无精子在其贮器无法找到一个同伴。倾斜的女性性别比例已经记录在乔治的银行龙虾股票17，并认为这会导致精子限制的可能性值得进一步关注，由于对龙虾人口的生殖产量的潜在后果。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
笔者想感谢所有的新英格兰商业lobstermen的船，我们被允许从品尝 - 他们的合作是非常赞赏。此外，我们要感谢小龙虾湾公司（纽因顿，NH）和Champlin的的海鲜（点朱迪思，RI）谁允许我们在他们的设施进行采样。下面UNH学生在本研究提供了宝贵的援助：海利白色，弗朗索瓦·莫里森，莎拉Havener，奥德拉Chaput的，和五月格罗斯。该项目由赠款从新罕布什尔州SeaGrant到WHW（项目＃R/CFR-11）和UNH海洋项目资助，以联合研究小组的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calipers | Mitutoyo Digimatic | 500-196-20 | http://www.globalindustrial.com |
| 3 ml Luer-Lok syringe | Beckton-Dickinson | 309585 | www.bd.com |
| Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 | Webster Veterinary | 8881202348 | www.mywebstervet.com |
| 2.0 ml Plastic storage tubes | Eppendorf | wu-06333-72 | http://www.coleparmer.com |
| Styrofoam cooler with ice | |||
| Compound light microscope | Olympus | BH System | http://www.olympusamerica.com |
| Glass sides with cover slip | 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness | ||
| Pipettor with disposable tips |
References
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