Summary
שינויים הנגרמים לדיג דיג סרטנים מנוצל, כגון דיג הלובסטר האמריקאי, שעלולים להשפיע על דינמיקת הרבייה שלהם, מה שמוביל לירידה בהצלחת הזדווגות. מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח שיטה לא פולשנית לבירור ההצלחה ההזדווגות של לובסטרים נשיים שיכול להיות מבחינה פיזיולוגית או תפקודי בוגר.
Abstract
למרות היותו אחד הדיג הפוריים ביותר באוקיינוס האטלנטי מערב, הרבה עדיין לא ידוע על דינמיקת הרבייה הטבעית של לובסטרים אמריקאים. מחקר שנערך לאחרונה באוכלוסיות ניצלו סרטנים (סרטנים ולובסטרים) מצביע על כך שקיימות נסיבות שבי נקבות בוגרות אינן מסוגלות למצות את פוטנציאל הרבייה המלא שלהם בשל מגבלותיהם זרע. כדי לבחון את האפשרות הזאת באזורים שונים של דיג הלובסטרים האמריקאי, שיטה אמינה ולא פולשנית פותחה עבור דגימת מספר גדול של לובסטרים נשיים בים. שיטה זו כרוכה בהחדרת מחט קהה שקצהו לקיבול הזרע של הנקבה כדי לקבוע את נוכחותו או היעדריו של תקע זרע ולסגת מדגם שניתן לבדוק את הימצאותם של תאי זרע. סדרה של מחקרים שנערכו בשליטת המזח ובמעבדה כדי לבדוק את המהימנות של טכניקה זו. מאמצים אלה היו כרוכים בדגימת 294 לובסטרים נקבה כדי לאשר שo הנוכחותתקע זרע fa היה אינדיקטור אמין של זרע בתוך כלי הקיבול ובכך, הזדווגות. מאמר זה מפרט את המתודולוגיה ותוצאות המתקבלות מקבוצת משנה של הנקבות בסך הכל נדגמו. של 230 הלובסטרים הנשיים שנדגמו מהבנק של ג'ורג' וקייפ אן, MA (טווח גודל = 71-145 מ"מ אורך שריון), 90.3% היו חיוביים לזרע. הסברים אפשריים להיעדר זרע בכמה נקבות כוללים: חוסר בגרות (חוסר הבשלות פיזיולוגית), התמוטטות של תקע הזרע לאחר שמשמש לדישון מצמד של ביצים, וחוסר פעילות הזדווגות. הסקרים מצביעים על כך שטכניקה זו לבחינת ההצלחה ההזדווגות של לובסטרים נקבה היא פרוקסי אמין שניתן להשתמש בם בתחום לתעד את פעילות רבייה באוכלוסיות טבעיות.
Introduction
לובסטר אמריקאי (americanus Homarus) הוא אחד מהדיג הפורה ביותר באוקיינוס האטלנטי (~ 56,000 הר ב2011, מוערך על $ 390,000,000) 1 בצפון. עם זאת, יש חוסר הבנה כללי בנוגע לדינמיקת הרבייה של מין זה באוכלוסיות בר. יצירת הערכות מדויקות יותר של תפוקת רבייה, כוללים המספר והגדלים של אנשים באופן פעיל משתתף ברבייה, עשויה לשפר את תהליך הערכת המניות. לדוגמא, נשים שמנועים מלממש את הפוטנציאל המלא שלהם הרבייה עקב מגבלות זרע זוהו כדאגה לכמה סרטנים ימיים מנוצלים באופן מסחרי, כולל: לובסטרים קוצניים 2, סרטנים כחולים 3, סרטני המלך 4, סרטני אבן 5, וסרטני השלג 6. המטרה הכוללת היא לקבוע אם הגבלת זרע עשויה להיות גורם באזורים מסוימים של דיג הלובסטרים האמריקאי גם כן.
NT "> הסימנים הראשונים של בעיה הגבלת זרע פוטנציאלית בלובסטרים נצפו בעת ביצוע מחקר שאינו קשור תיוג עם לובסטרים נקבת ovigerous (עם ביצים בעליל שלמות, נמתחים לאחרונה). לשחזר דיווחים מדייגים ציין כי ~ 15% מבעלי החיים אלה ירדו ציפורני הביצה שלהם לאחר רק 1-2 חודשים. נחת העבודה הייתה כי כמה לובסטרים נושאים את הביצים שלא היה מופרים, וכתוצאה מכך, 'נפלו' 7. נתונים ראשוניים ממחקר שלאחר מכן אישרו את העובדה שלובסטרים יהיו extrude ביצים גם אם הם לא הזדווגו בהצלחה וביצים מופרה אלה מתבצעות רק ל~ 1 חודש 8. לכן, בהתחשב בתצפית של נקבות נושאת ביצים מופרה באוכלוסיות טבעיות, אנחנו ביקשנו לקבוע שלהגבלת זרע עשויה לתרום למידה רמת submaximal של רבייה על ידי לובסטרים לבגרות מינית. כדי להשיג מטרה זו, טכניקה פותחה כדי לזהות spermatophore שהופקד על ידי גברים בעת ההזדווגות.נייר וסרט וידאו הזה מתארים שיטה לא פולשנית, פשוטה שפותחה לבירור ההצלחה ההזדווגות של לובסטרים ממין נקבה. הטכניקה יכולה להיות מנוצל במהירות ובאופן אמין בים, או על סיפון מחקר או ספינות דיג מסחריות. הפרטים של שיטת דגימה זו, כמו גם כמה ממצאי נציג מוצגים כדי להמחיש את היישום של הטכניקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
חלק א ': טכניקת שדה דגימה
1. מדידות נקבה
- לכל נקבת לובסטר, למדוד את אורך השריון (CL) ורוחבו של קטע הבטן השני ל1.0 מ"מ הקרוב ביותר בעזרת זוג מחוגה.
הערה: קטע הבטן השני נמדד בגלל הרוחב של הבטן (שבו נקבות נושאות את ביציהן) הוא אינדיקטור של בגרות מינית. בנוסף, זה יכול להיות יתרון לברר את שלב הנשירה מאוחר יותר כדי להתאים את הנתונים הללו עם שלב רבייה (ראה שלב 1.2). - קליפ חלק הדיסטלי קטן מאחד pleopods הבטן (פרוטוקול מתודולוגיים סטנדרטי בלובסטרים) ולאחסן את pleopod במי ים נקי לשימוש מאוחר יותר צפייה עם מיקרוסקופ לנתח 9.
הערה: צעד זה עשוי גם לחשוף את הנוכחות של בלוטות מלט על pleopods, שהם אינדיקציה לכך שנשים מתכוננים extrude ביציהם 10.
2. מחט insertion
- הכנס את מחט המזרק (18 G, ראה טבלה 1) ~ 1 סנטימטר לתוך כלי קיבול הזרע, בזווית לכיוון הזנב ב ~ 45 ° (איור 1).
הערה: בלובסטרים עם תקעי זרע שלמים, המחט עשויה לפגוש התנגדות מסוימת במהלך החדרה, כפי שהוא נדחף דרך תקע הזרע לפני שהגיע לריכוז הגבוה ביותר של זרע בתחתית כלי קיבול הזרע (איור 1).
הערה: הנוכחות של התקע, בעצמו, היא אינדיקטור אמין שלובסטרים שהזדווגו. אצל בעלי חיים מסוימים ייתכן שיש מעט התנגדות, ואולי משום שאיש לא spermatophore הוא הווה, spermatophore הוא קטן, זה לא התקשה לתקע עדיין, או שהוא עשוי כבר משמש לדישון מצמד אחד או יותר של ביצים.
איור 1. החדרת מחט ותצוגה של כלי קיבול זרע לובסטר. החדרת המחט הקהה שקצהו לתוך כלי קיבול הזרע של הלובסטר לחלץ דגימת זרע. הזווית והעומק של המחט שניהם קריטיים לקבלת דגימות עקביות. מימין: תצוגה של כלי קיבול זרע שכבר גזורים ולפצל בצורה אנכית. תקע הזרע תופס את החלק העליון או חיצוני של כלי הקיבול, ואילו תאי הזרע נמצאים בתחתית (הנקודה העמוקה ביותר) של כלי הקיבול. חשוב לציין כי דגימה מתחת לעומק זה עלולה לנקב את הקיבול והתוצאה במדגם מזוהם בדם. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
3. חודר Plug הזרע
- לאחר הכניסה הראשונית, תלול הזווית של המחט לכמעט אנכי (בניצב לציר הגוף), ומאוד להתחיל לאט לעבוד אותוכלפי מטה לתוך כלי הקיבול.
- שמור את המחט הנטויה בזווית, כך שקצו מחודד מעט לכיוון הזנב. במקרה זה קצה מחט דחיסה העליון של התקע, עד שסופו של דבר חודר לתוך המטריצה.
- ממשיך לדחוף את המחט באיטיות כלפי מטה עד שההתנגדות מורגשת פעם נוספת - זה החלק התחתון של המכל ובו המדגם נלקח.
4. הסרת זרע
- הסר מדגם (לעתים קרובות בחומרי התוספת מוצקים, נוזל זרע ונוזלים אחרים) מהחלק התחתון של המכל ולהפקיד את הדגימה לתוך צינור פלסטיק 2.0 מיליליטר שכותרתו.
- לשטוף את השקע עם ~ 0.1-0.5 מיליליטר של מי ים קר.
- הסר כ 0.3 מיליליטר של נוזל ומקום באותו הצינור.
- דגימות זרע חנות על קרח עד שהם יכולים להיבחן במעבדה.
חלק ב ': בדיקה של דגימות זרע במעבדה
הערה: דוגמאות הוסרו מקיבול הזרע של ליטר בודד obsters יש לבחון כדי לקבוע אם תאי זרע היו נוכחים או תיעדר. - הסר ~ 50 μl של נוזל מצינור פלסטיק, מקום בשקופית זכוכית עם להחליק את מכסה, ולהציג ב100X עם מיקרוסקופ מתחם.
- ציון דוגמאות כמו: זרע מועט, רב, או נעדר (מחקר זה לא לכמת מספרים בפועל זרע, איור 2).
איור 2. דגימת זרע Lobster תמונות. תמונות של דגימות זרע שנלקחו מלובסטר קיבול הזרע של נקבה, כפי שנצפו במיקרוסקופ מתחם ב40X ההגדלה. תמונה משמאל מציגה מדגם שהכיל זרע רב ואילו השני (מימין) ממחיש מדגם דליל (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר)."Target =". Jpg _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים שדווחו כאן היו לקבוצת משנה של לובסטרים נשיים שמקורו בשני הסמוכות לחוף ומקומות מהחוף. הקבוצה הסמוכות לחוף כללה 44 לובסטרים שנתפסו במימי החופים ליד קייפ אן, מסצ'וסטס ומועברים בקירור למעבדה לבדיקה. כולל של 186 לובסטרים מהחוף נתפסו על הבנק של ג'ורג' וידגם במתקן החזקה מסחרי בניו המפשייר.
דגימות זרע שמתקבלות מכל בעלי החיים ובדקה באופן מיידי לנוכחות או עדר הזרע על פי שיטות שתוארו לעיל. כולל של 90.3% מכלל הנשים בקבוצת משנה זה היה זרע בקיבול הזרע שלהם. באופן מפתיע, אלה שהיו חסרי זרע לא היו בהכרח בקצה הקטן יותר של טווח הגודל (איור 3).
"Width =" ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "/> 600px
איור 3. תוצאות דגימה לנוכחות של זרע בלובסטרים. אחוז מלובסטרים נקבה ב5 פחי מ"מ גודל CL כיתה שהיה זרע בקיבול הזרע שלהם (אחוזים חיוביים) כמדד להזדווגות. נקבות נלכדו ממים ליד קייפ אן, MA (71-83 מ"מ CL) ומהבנק של ג'ורג' (89-154 מ"מ CL). מספרים בתוך סורגים לייצג את גודל מדגם לפח זה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתווה זה וידאו ונייר ולהדגים שיטה לקביעה אם לובסטרים נקבה שהזדווגו בהצלחה. גישה זו היא פשוטה מספיק שזה יכול לשמש לדגימה בקנה מידה גדולה של לובסטרים בים על ידי מגוון רחב של משתמשים. השיטה מבוססת על זיהוי הנוכחות של spermatophore בקיבול הזרע שהוא עבר מזכר לנקבת לובסטרים בעת ההזדווגות. spermatophores אלה להקשיח באופן חלקי לתוספת זרע זמן קצר לאחר שהם מופקדים בקיבול, ולכן, הנוכחות של תקע זרע היא גם מעיד על הצלחה הזדווגות. במחקר זה, כמו גם מחקר גדול יותר שלאחר מכן, בו נקבע כי רוב תקעי הזרע שזרע הקשורים בם 11. עם זאת, בעוד שהנוכחות של תוסף היא מדד אמין לפעילות הזדווגות, ההיעדרות שלו היא לא.
למרות שאנחנו לא יכולים להיות בטוחים לחלוטין אם המתודולוגיה דגימה זו כרוכה השפעה שלילית על יכולתה של לובסטרים נקבה כדי להשריץd לדשן מצמד הביצה שלהם בהצלחה, יש היבטים לפרוטוקול דגימת הזרע הזה שמצביעים על כך שהניזק יהיה מינימאלי או spermatophore או כלי הקיבול. ישנם נתונים (ממחקרי מעבדה מתמשכים) המצביעים על כמה לובסטרים, דגימת הודעה זרע, עדיין extrude ציפורניים מופרה של ביצים (n = 3) ומסוגלים להפרות מצמד אחד או יותר של ביצים תוך שימוש באותה spermatophore. ביצים אלה להתפתח ולבקוע באופן דומה ללובסטרים שלא היה שנדגמו. בנוסף, טכניקת דגימה זו משמשת רק כדי לטעום חלק קטן מהזרע המוחלט. זה לא נועד כדי לדגום כמותית את התוכן המלא של כלי קיבול. בשל הארכיטקטורה המורכבת הפיסית של הקיבול 12,13, טכניקה שונה (לדוגמא: לנתיחה) תהיה צורך לקבל אותם סוגים של תוצאות.
זרע נמצא במספר בעלי החיים שנדגמו שחסרו תקע זרע, אולי בגלל spermatophore היה יחסית n ew, ועדיין לא התגבש לתקע, או spermatophore היה בשימוש בעבר כדי להפרות מצמד אחד או יותר של ביצים ומידרדים. לכן, על מנת לקבל המדד מדויק ביותר של הצלחה הזדווגות חשוב גם הסימון עבור התוספת זרע ודגימת זרע.
כיוון מדויק של המחט במהלך הליך הדגימה הוא קריטי מכמה סיבות. ראשון, והבטיח כי המחט היא מקבילה למישור הגוף לרוחב מונע ממנו לחדור לצד הדק של קיבול הזרע. כאשר הטכניקה מבוצעת בצורה נכונה, זה לא גורם לתמותה, כמחט חודרת את חלל הגוף אף פעם לא באמת. שנית, זווית הכניסה 45 מעלות, ואחריו steepening של המחט, מסייעת להבטיח שהמחט מגיעה לתחתית של כלי הקיבול שבו תאי הזרע מרוכזים בלי לחדור לקיר של spermatophore והזנת גוף בסינוסים הסמוכים (איור 1) .
ss> היה = "jove_content" כמה הידרדרות של דגימות הזרע אם הם לא טופלו כראוי. זרע לובסטר לעבור תגובת acrosomal די בקלות, לפעמים כתוצאה מתסיסה מכאנית 13. ברגע שהזרע הגיב, הם מתחילים להישבר במדגם ולהיות קשה לזיהוי. מסיבה זו, תסיסה של בקבוקוני המדגם צריכה להישמר עד למינימום. שמירת הדגימות מגניב גם מופיעה כדי לעזור לשמר את היושרה של הזרע. לבסוף, הוא הציע להשתמש במי ים סטריליים כאשר עיבוד מדגם. זה עשוי לפעול למזעור התפתחותם של חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים (מעל 36-48 שעה) שעלול לגרום נזק לזרע.
רוב (90.3%) של נקבת הלובסטרים נדגם שהזדווגו בהצלחה, המבוסס על הנוכחות של זרע בקיבול הזרע שלהם. שאר בעלי החיים אולי לא היה זרע חיובי כי גם הם היו בשלה מיניים, תקעי הזרע שלהם הידרדרו לאורך זמן או שהיו לי להיותen משמש באופן מלא כדי להפרות מצמד אחד או יותר של ביצים, או שהם מעולם לא הזדווגו, אולי בגלל שאף פעם לא נתקלו בזכר מתאים בזמן הנכון במחזור נשירתם 11. לובסטרים נקבה באזור הגדה של ג'ורג' יש לי גדול יחסית בגודל בפדיון, רק עם 50% מהנשים בוגרים ב100 מ"מ 14. נקבות קייפ אן בוגרות בגודל מעט קטן יותר מאשר לעשות את הלובסטרים מהחוף, עם 50% מהנשים בוגרים ב90 מ"מ 15 CL. לכן, בהתחשב בכך שהנקבות הקטנות ביותר היו 71 מ"מ CL, זה לא מתקבל על דעת שכמה מהנקבות חסרות תקעי זרע היו סביר בשלה, ולכן, לא היה הזדווגו. לובסטרים רבים גדולים נשיים, כגון אלה שנדגמו בקבוצת משנה offshore שלנו, ייתכן שרצים בשנים רצופות ללא השרה וremating 16.
הפריות מרובות משתמשים באותו spermatophore עשויות סופו של דבר לגרום להתמוטטות של חומר התקע ועשויות להשתמש בעד הזרע הכלול בRECEPTAcle, מניב תוצאה שלילית. עם זאת, הפירוק המכני של תקע הזרע לאורך זמן לא, למיטב ידיעתנו, כבר תאר. לבסוף, ייתכן שנקבות אלו ללא זרע בקיבול שלהם לא הצליחו לאתר בן זוג. יחסי מין נשיים מוטים תועדו במלאי לובסטר הבנק של ג'ורג' 17, ואת האפשרות שזה מוביל להגבלת זרע ראויה לתשומת לב נוספת בשל ההשלכות הפוטנציאליות לתפוקת הרבייה של אוכלוסיית הלובסטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לכל lobstermen ניו אינגלנד המסחרית שהסירות נתנו לנו לטעום מ-- שיתוף הפעולה שלהם זוכה להערכה רבה. כמו כן, אנו מודים למפרץ קטן לובסטר חברה (Newington, NH) ומאכלי הים של Champlin (נקודה יהודית, RI) שאפשר לנו לבצע דגימה במתקנים שלהם. תלמידי UNH הבאים סיפקו סיוע רב ערך לאורך כל המחקר הזה: היילי לבנה, פרנסואז מוריסון, שרה Havener, אודרה Chaput, ומאי גרוז. פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מSeaGrant NH לWHW (פרויקט # R/CFR-11) וגרנט UNH הימי תכנית לJSG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calipers | Mitutoyo Digimatic | 500-196-20 | http://www.globalindustrial.com |
| 3 ml Luer-Lok syringe | Beckton-Dickinson | 309585 | www.bd.com |
| Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 | Webster Veterinary | 8881202348 | www.mywebstervet.com |
| 2.0 ml Plastic storage tubes | Eppendorf | wu-06333-72 | http://www.coleparmer.com |
| Styrofoam cooler with ice | |||
| Compound light microscope | Olympus | BH System | http://www.olympusamerica.com |
| Glass sides with cover slip | 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness | ||
| Pipettor with disposable tips |
References
- FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. , Available from: http://www.fao.org (2012).
- MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
- Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
- Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
- Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
- Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
- Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. , Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
- Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
- Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
- Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
- Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
- Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
- Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. , Academic Press. NY. 177-216 (1995).
- Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
- Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
- Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
- Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. , Washington, D.C. (2009).
