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Environment

Un metodo non invasivo per doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Cambiamenti della pesca indotti alla pesca di crostacei sfruttati, come l'aragosta pesca americano, potrebbero potenzialmente influenzare le loro dinamiche riproduttive, portando ad una riduzione nel successo di accoppiamento. L'obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo invasivo per accertare il successo dell'accoppiamento delle aragoste femmine che possono essere fisiologicamente o funzionalmente maturo.

Abstract

Nonostante sia una delle attività di pesca più produttive nell'Atlantico nord-occidentale, molto rimane sconosciuto circa le dinamiche riproduttive naturali di aragoste americane. Un recente lavoro in popolazioni di crostacei sfruttate (granchi e aragoste), suggerisce che ci sono circostanze in cui le femmine mature sono in grado di raggiungere il loro pieno potenziale riproduttivo a causa delle limitazioni dello sperma. Per esaminare questa possibilità in diverse regioni del aragosta pesca americano, un metodo affidabile e non invasiva è stato sviluppato per il campionamento di un gran numero di aragoste femmine in mare. Questo metodo comporta l'inserimento di un ago a punta smussata nel ricettacolo seminale della femmina per determinare la presenza o l'assenza di una spina sperma e per prelevare un campione che può essere esaminato per la presenza di spermatozoi. Una serie di studi di controllo sono stati condotti al molo e in laboratorio per testare l'affidabilità di questa tecnica. Questi sforzi hanno comportato campionamento 294 aragoste femmine per confermare che la presenza ospina sperma fa era un indicatore affidabile di sperma all'interno del recipiente e, quindi, l'accoppiamento. Dettagli Questo documento la metodologia ed i risultati ottenuti da un sottoinsieme delle femmine totale del campione. Dei 230 aragoste femmine nel campione da Bank George e Cape Ann, MA (range size = 71-145 mm di lunghezza carapace), il 90,3% era positivo per gli spermatozoi. Possibili spiegazioni per l'assenza di spermatozoi in alcune femmine sono: immaturità (mancanza di maturità fisiologica), la ripartizione del plug sperma dopo essere stato utilizzato per fertilizzare una frizione di uova, e la mancanza di attività di accoppiamento. Le indagini indicano che questa tecnica per esaminare l'accoppiamento di successo aragoste femmine è un proxy affidabile che può essere utilizzato nel campo per documentare attività riproduttiva in popolazioni naturali.

Introduction

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Astice americano (Homarus americanus) è una delle attività di pesca più produttive del Nord Atlantico (~ 56.000 tonnellate nel 2011, valutato più di 390 milioni dollari) 1. Tuttavia, vi è una generale mancanza di comprensione riguardo le dinamiche riproduttive di questa specie in popolazioni selvatiche. Generazione di stime più accurate di potenza riproduttiva, compreso il numero e le dimensioni delle persone che partecipano attivamente alla riproduzione, può migliorare il processo di valutazione degli stock. Ad esempio, le femmine che sono impedito di raggiungere il loro pieno potenziale riproduttivo a causa delle limitazioni spermatozoi sono stati identificati come una preoccupazione per alcuni crostacei marini sfruttate commercialmente, tra cui: aragoste, granchi blu 2 3, re granchi 4, 5 granchi di pietra, e granchi neve 6. L'obiettivo generale è quello di stabilire se la limitazione dello sperma potrebbe essere un fattore in alcune regioni del aragosta pesca americano.

nt "> I primi segni di un potenziale problema di limitazione di spermatozoi nel aragoste sono stati osservati durante lo svolgimento di uno studio di tagging correlato con ovigeri aragoste femmine (con visibilmente intatti, uova di recente estrusi). Recapture relazioni di pescatori ha indicato che circa il 15% di questi animali era caduto loro grinfie di uova dopo soli 1-2 mesi. L'ipotesi di lavoro è che alcune aragoste portavano le uova che non erano state fecondate e, di conseguenza, 'caduto' 7. dati preliminari di uno studio successivo hanno confermato il fatto che le aragoste saranno estrudere uova, anche se non sono accoppiati con successo e queste uova non fecondate vengono effettuate solo per ~ 1 mesi 8. Pertanto, data l'osservazione delle femmine che trasportano le uova non fecondate nelle popolazioni naturali, abbiamo cercato di determinare la misura in cui la limitazione dello sperma potrebbe essere contribuendo a un livello submassimale di riproduzione di aragoste sessualmente maturi. Per raggiungere questo obiettivo, una tecnica è stata sviluppata per rilevare la spermatozoiPhore depositato dai maschi durante l'accoppiamento.

Questo documento e il video descrivono un non invasivo, semplice metodo sviluppato per accertare il successo di accoppiamento di aragoste femmine. La tecnica può essere utilizzata in modo rapido e affidabile al mare, sia a bordo delle ricerche o pescherecci commerciali. I dettagli del metodo di campionamento nonché alcuni risultati rappresentativi sono presentati per illustrare l'applicazione della tecnica.

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Protocol

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Parte A: Tecnica Campo di campionamento

1. Femmina Misure

  1. Per ogni aragoste femmine, misurare la lunghezza carapace (CL) e la larghezza del secondo segmento addominale con l'approssimazione di 1,0 millimetri usando un paio di pinze.
    NOTA: Il secondo segmento addominale è misurata perché la larghezza dell'addome (dove femmine portano le loro uova) è un indicatore della maturità sessuale. Inoltre, potrebbe essere vantaggioso per accertare la fase muta per abbinare successivamente questi dati con fase riproduttiva (vedere fase 1.2).
  2. Ritagliare una piccola porzione distale fuori una delle pleopodi addominali (un protocollo metodologico standard aragoste) e memorizzare il pleopod in acqua di mare pulita per una visione successiva con un microscopio dissezione 9.
    NOTA: Questo passaggio potrebbe anche rivelare la presenza di ghiandole di cemento sui pleopodi, che sono un'indicazione che le donne si stanno preparando per estrudere le loro uova 10.

2. Needle Inseincidenza sulle

  1. Inserire l'ago della siringa (18 G, vedi Tabella 1) ~ 1 centimetro nel ricettacolo seminale, angolati verso la coda a ~ 45 ° (Figura 1).
    NOTA: In aragoste con tappi spermatozoi intatti l'ago potrebbe incontrare qualche resistenza durante l'inserimento, quanto è spinto attraverso il tappo di sperma prima di raggiungere la massima concentrazione di sperma sul fondo del recipiente seminale (Figura 1).
    NOTA: La presenza della spina, di per sé, è un indicatore affidabile che le aragoste sono accoppiati. In alcuni animali ci può essere poca resistenza, forse perché non spermatoforo è presente, il spermatoforo è piccola, non è ancora indurito in una spina, o potrebbe essere già stato utilizzato per concimare uno o più grinfie di uova.

Figura 1 Figura 1. Inserimento dell'ago e la vista di aragosta presa seminale. Inserimento dell'ago a punta smussata nella presa seminale dell'aragosta per estrarre un campione di sperma. L'angolo e la profondità dell'ago sono entrambi fondamentali per ottenere campioni omogenei. A destra: Veduta di un ricettacolo seminale che è stato sezionato e diviso verticalmente. La spina sperma occupa la parte superiore o esterna del recipiente mentre gli spermatozoi si trovano in basso (punto più profondo) del recipiente. E 'importante notare che il campionamento di sotto di questa profondità può forare la presa e il risultato in un campione di sangue contaminato. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

3. Penetrando la Sperm Plug

  1. Dopo l'inserimento iniziale, steepen l'angolo del dell'ago pressoché verticali (perpendicolari all'asse del corpo), e molto lentamente inizia a lavorareverso il basso nel recipiente.
  2. Tenere l'ago inclinato a un angolo in modo che la punta è rivolta leggermente verso la coda. In questo caso la punta dell'ago si comprime la parte superiore del tappo, finché alla fine penetra nella matrice.
  3. Continuare a spingere lentamente l'ago verso il basso fino a sentire resistenza una volta di più - questo è il fondo del recipiente e dove viene prelevato il campione.

4. Sperm rimozione

  1. Rimuovere un campione (spesso materiale spina solido, sperma liquido e di altro fluido) dal fondo del recipiente e depositare il campione in una provetta di plastica etichettata 2.0 ml.
  2. Lavare il recipiente con ~ 0,1-0,5 ml di acqua di mare fredda.
  3. Rimuovere circa 0,3 ml di liquido e di luogo nella stessa provetta.
  4. Conservare i campioni di sperma sul ghiaccio fino a che non possono essere esaminati in laboratorio.
    Parte B: Esame dei campioni di sperma in laboratorio
    NOTA: I campioni prelevati dai recipienti seminali dei singoli l obsters devono essere esaminati per determinare se gli spermatozoi erano presenti o assenti.
  5. Rimuovere ~ 50 ml di liquido da ogni tubo di plastica, posto su un vetrino con una scivolata di copertura, e vista a 100X con un microscopio composto.
  6. Punteggio campioni: lo sperma scarsa, numerosi, o assente (questo studio non ha quantificato il numero di spermatozoi effettivi, Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Immagini campione Lobster sperma. Immagini di campioni di aragosta sperma prelevati da ricettacolo seminale di una femmina, come visto con un microscopio composto a 40X di ingrandimento. Immagine sulla sinistra mostra un esempio che conteneva numerosi sperma mentre l'altro (destra) illustra un campione sparse (bar scala = 10 um).. Jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Representative Results

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I dati qui riportati sono stati per un sottoinsieme di aragoste femmine che provenivano sia da nearshore e sedi offshore. Il gruppo nearshore consisteva di 44 aragoste che sono stati catturati nelle acque costiere vicino a Cape Ann, Massachusetts e trasportate in dispositivi di raffreddamento al laboratorio per l'esame. Un totale di 186 aragoste off-shore sono stati catturati sulla Banca di George e campionato in una struttura un'azienda commerciale in New Hampshire.

Campioni di sperma sono stati ottenuti da tutti gli animali e immediatamente esaminati per verificare la presenza o assenza di spermatozoi secondo i metodi sopra descritti. Un totale di 90,3% di tutte le donne in questo sottogruppo ha avuto spermatozoi nei loro ricettacoli seminali. Sorprendentemente, coloro che mancava sperma non erano necessariamente alla fine minore dell'intervallo di dimensioni (Figura 3).

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Figura 3. Risultati di campionamento per la presenza di spermatozoi nel aragoste. Percentuale di aragoste femmine in 5 mm Dimensione CL bidoni di classe che avevano spermatozoi nei loro ricettacoli seminali (percentuale positiva) come un indicatore di accoppiamento. Le femmine sono stati catturati dalle acque nei pressi di Cape Ann, MA (71-83 mm CL) e da Bank George (89-154 mm CL). Numeri all'interno barre rappresentano dimensione totale del campione per che bin. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

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Questo schema video e carta e dimostrare un metodo per determinare se le aragoste femmine sono accoppiati con successo. Questo approccio è abbastanza semplice che può essere utilizzato per il campionamento larga scala di aragoste in mare da una varietà di utenti. Il metodo si basa sulla rilevazione della presenza di un spermatophore nel ricettacolo seminale che viene passato da maschio a aragoste femmina durante l'accoppiamento. Questi spermatofori parzialmente induriscono in una spina spermatozoi poco dopo che si depositano nel recipiente, quindi, la presenza di una spina sperma è anche indicativo di successo accoppiamento. In questo studio, nonché un successivo studio più ampio, è stato determinato che la maggior parte delle spine sperma avevano spermatozoi essi associati 11. Tuttavia, mentre la presenza di un tappo è un indicatore affidabile dell'attività accoppiamento, la sua assenza non è.

Anche se non possiamo essere del tutto certi se questa metodologia di campionamento comporta un effetto negativo sulla capacità di aragoste femmine per deporre le uova und concimare con successo la loro frizione uovo, ci sono aspetti di questo protocollo di campionamento sperma che suggeriscono che il danno sarebbe minimo sia al spermatoforo o recipiente. Ci sono dei dati (da studi di laboratorio in corso), che indicano alcune aragoste, campionamento post-sperma, ancora estrudere frizioni di uova fecondate (n = 3) e sono in grado di fecondare più di una frizione delle uova con lo stesso spermatoforo. Queste uova si sviluppano e si schiudono in modo simile a astici che non sono stati inclusi nel campione. Inoltre, questa tecnica di campionamento serve solo per campionare una piccola frazione del totale spermatozoi. Esso non è destinato a campionare quantitativamente integralmente un recipiente. A causa della complessa architettura fisica del recipiente 12,13 una tecnica diversa (ad esempio dissezione) sarebbe necessaria per ottenere questo tipo di risultati.

Sperma è stato trovato in un numero di animali campione che mancava un tappo sperma, probabilmente perché il spermatoforo era relativamente new, e non aveva ancora indurito in un tappo, o il spermatoforo era stato precedentemente utilizzato per concimare uno o più grinfie di uova e si era deteriorata. Pertanto, al fine di ottenere l'indice più accurato di successo accoppiamento è importante sia controllo per una spina sperma e di esempio per gli spermatozoi.

Orientamento accurata dell'ago durante la procedura di campionamento è critico per diverse ragioni. Primo, controllando che l'ago sia parallelo al piano corpo laterale impedisce di penetrare il lato sottile del ricettacolo seminale. Quando la tecnica viene eseguita correttamente, non provoca mortalità, come l'ago mai effettivamente penetra nella cavità del corpo. In secondo luogo, l'angolo di 45 ° inserimento, seguita da un aumento dell'inclinazione dell'ago, aiuta ad assicurare che l'ago raggiunge il fondo del recipiente in cui gli spermatozoi sono concentrati senza penetrare la parete del spermatophore e inserendo il seno corpo adiacente (Figura 1) .

13. Una volta che lo sperma hanno reagito, cominciano ad abbattere nel campione e diventare difficile da identificare. Per questo motivo, agitazione dei vial di campioni deve essere ridotto al minimo. Mantenere i campioni raffreddare appare anche per aiutare a preservare l'integrità dello sperma. Infine, si suggerisce di utilizzare l'acqua di mare sterile campione di trasformazione. Questo può agire per minimizzare la crescita di batteri e altri microrganismi (oltre 36-48 hr) che potrebbero danneggiare lo sperma.

La maggior parte (90,3%) delle aragoste femmine nel campione erano accoppiate con successo, in base alla presenza di spermatozoi nel loro ricettacoli seminali. Il resto degli animali non sarebbe stato lo sperma positivo perché o erano sessualmente immaturi, le loro prese di sperma erano deteriorati nel tempo o ha avuto essereen interamente utilizzati per fertilizzare uno o più grinfie di uova, o non avevano mai accoppiati, forse perché non hanno mai incontrato un maschio adeguato al momento giusto nel loro ciclo di muta 11. Aragoste femminili in regione Banca del George hanno una dimensione relativamente grande-a-scadenza, con solo il 50% delle femmine mature a 100 mm 14. Femmine Cape Ann maturano in un formato leggermente più piccolo di quanto non facciano le aragoste in mare aperto, con il 50% delle femmine mature a 90 millimetri CL 15. Pertanto, dato che i piccoli femmine erano 71 millimetri CL, non è irragionevole suggerire che alcune delle femmine mancanti tappi spermatici erano probabilmente immaturo e quindi, non sarebbe accoppiato. Molte grandi aragoste femminili, come quelli campionati nel nostro sottoinsieme mare aperto, possono deporre le uova in anni consecutivi senza muta e remating 16.

Più concimazioni utilizzando lo stesso spermatoforo può eventualmente provocare una ripartizione del materiale spina e possono utilizzare fino lo sperma contenuto nel receptAcle, ottenendo un risultato negativo. Tuttavia, la rottura meccanica della spina sperma nel tempo non è, a nostra conoscenza, stato descritto. Infine, è possibile che queste donne senza spermatozoi nei loro recipienti erano in grado di trovare un compagno. Rapporti sessuali femminili distorte sono stati documentati in George aragosta Banca magazzino 17, e la possibilità che questo porta a una limitazione degli spermatozoi merita ulteriore attenzione a causa delle potenziali conseguenze per la capacità riproduttiva della popolazione di aragosta.

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Disclosures

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare tutti i pescatori di aragoste commerciali del New England cui le barche ci hanno permesso di campionare - la loro cooperazione è molto apprezzato. Inoltre, ringraziamo Little Bay Lobster Company (Newington, NH) e di Champlin Seafood (Point Judith, RI), che ci ha permesso di condurre il campionamento presso le loro strutture. I seguenti studenti UNH fornito la preziosa assistenza nel corso di questo studio: Haley Bianco, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, e maggio Grose. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal NH SeaGrant a WHW (progetto # R/CFR-11) e un programma UNH Marine Grant JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un metodo non invasivo per<em&gt; In situ</em&gt; Determinazione del successo di accoppiamento in americano femminile Aragoste (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
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Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

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