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Environment

에 대한 비 침습적 방법 doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

이러한 미국의 랍스터 어업으로 악용 갑각류 어업에 어업에 의한 변화는 잠재적 짝짓기 성공의 감소로 이어지는, 생식 역학에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구의 목표는 생리 학적으로 또는 기능적으로 성숙 될 수 있습니다 여성의 바다 가재의 짝짓기 성공을 판명하기위한 비 침습적 방법을 개발하는 것이 었습니다.

Abstract

북서 대서양에서 가장 생산적인 어업 중 하나 임에도 불구하고, 많은 미국 가재의 자연 생식 역학에 대한 알 수없는 남아있다. 악용 갑각류 인구 (게, 가재)의 최근 작업은 성숙한 여성 인해 정액 제한에 자신의 모든 생식 잠재력을 달성 할 수없는 경우가 있습니다 것을 제안합니다. 미국 가재 어업의 다른 지역에서이 가능성을 검토하기 위해, 안전하고 비 침습적 인 방법은 바다에서 여성 가재 많은 수의 샘플링을 위해 개발되었습니다. 이 방법은 정자 플러그의 유무를 결정하고, 정자의 존재를 조사 할 수있는 샘플을 인출 한 여성의 정액 리셉터클에 무딘 팁 니들을 삽입하는 것을 포함한다. 대조군 연구의 시리즈는이 기술의 안정성을 테스트하는 도크와 연구실에서 수행 하였다. 이러한 노력은 294 여성 가재 확인을 위해 샘플링을 수반하는 존재의 오FA 정자 플러그는 신뢰할 수있는 용기 내에서 정자의 표시 따라서, 교배했다. 이 논문은 방법론과 샘플링 전체 여성의 하위 집합에서 얻은 결과를 자세히 설명합니다. 조지 은행과 케이프 앤, MA에서 샘플 (230) 여성 바다 가재 (크기 범위는 = 등딱지 길이 71~1백45밀리미터), 90.3 %는 정자에 긍정적이었다. 일부 여성에서 정자의 부재에 대한 잠재적 인 설명은 다음을 포함한다 : 미숙 (생리적 성숙의 부족), 계란의 클러치를 비옥하게하는 데 사용 된 후 정자 플러그의 고장, 짝짓기 활동의 부족. 조사는 여성 가재 메이팅 성공을 조사하기위한이 기술은 자연 인구 생식 활동을 문서화하는 분야에서 사용할 수있는 신뢰할 수있는 프록시임을 나타낸다.

Introduction

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미국 가재 (Homarus의 americanus)는 북대서양 (~ 390,000,000달러 상당의 2011 년 56,000 MT) 1에서 가장 생산적인 어업 중 하나입니다. 그러나, 자연 개체군에서이 종의 생식 역학에 대한 이해의 일반적인 부족이있다. 적극적 재생 참여 개인의 개수 및 크기 등의 생식 출력의보다 정확한 추정치를, 생성하는 콘텐츠 평가 프로세스를 향상시킬 수도있다. 가시가있는 가재 2, 꽃게 3, 킹 게 4, 돌 게 5, 스노우 게 예를 들어, 때문에 정자 제한에 자신의 모든 생식 잠재력을 달성하는 것을 방지하는 여성은 등 여러 가지 상업적으로 악용 해양 갑각류에 대한 우려로 확인되었다 6. 전반적인 목표는 정자의 제한뿐만 아니라 미국 가재 어업의 특정 지역의 요인이 될 수 있는지 확인하는 것입니다.

NT "> (눈에 띄게 손상, 최근 압출 계란) ovigerous 여성 바닷가 재와 관련이없는 태그 연구를 수행하는 동안 바닷가에있는 잠재적 인 정자 제한 문제의 첫 번째 징후가 관찰되었다. ~이 동물의 15 %가 떨어졌다 지적 어부의 보고서를 탈환 그들의 계란 클러치 만 1-2개월 후. 작업 가설은 몇 가지 가재 기름지게되지 않았다 계란을 운반하고, 그 결과로, '떨어졌다'7. 후속 연구의 예비 자료는 사실을 확인했다였습니다 그 바다 가재 것 그들이 성공적으로 성관계를하지 않은이 미 수정 계란 만 ~ 1개월 8에 대해 실시하는 경우에도 알을 돌출. 따라서, 자연 인구에서 미 수정 난자를 운반하는 여성의 관찰 주어진, 우리는 정자 제한에 기여 될 수있는 정도를 결정하는 모색 성적 성숙 가재 의해 재생 준 최대 레벨.이 목표를 달성하기 위해, 기술은 spermato를 검출하기 위해 개발되었다phore는 짝짓기하는 동안 남성에 의해 증착.

이 논문 및 비디오 여성 가재의 짝짓기 성공을 판명 위해 개발 된 비 침습적, 간단한 방법을 설명합니다. 이 기술은 바다에서, 어느 연구 또는 상업적 어선을 타고 신속하고 안정적​​으로 이용 될 수있다. 이러한 샘플링 방법의 세부 사항뿐 아니라 몇몇 대표적인 결과는 기술의 애플리케이션을 예시하기 위해 제시된다.

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Protocol

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파트 A : 필드 샘플링 기술

1. 여성 측정

  1. 암컷 랍스터 들어 갑 길이 (CL)와 캘리퍼스 쌍을 사용하여 가장 가까운 1.0 mm로 제 복근 세그먼트의 폭을 측정.
    NOTE : (암컷이 알을 수행) 복부의 폭 성적인 성숙의 지표이므로 제 복부 세그먼트가 측정된다. 또한다 (단계 1.2 참조) 이후 생식 단계와 이러한 데이터를 일치 탈피 스테이지를 확인하는 것이 바람직 할 수있다.
  2. 복부 pleopods 중 하나 (바다 가재의 표준 방법론 프로토콜) 떨어져 작은 말단 부분을 클립 나중에 해부 현미경 9 볼 깨끗한 해수 pleopod을 저장합니다.
    참고 :이 단계는 또한 여성은 자신의 알 (10)를 돌출 준비하고 표시하는 pleopods, 시멘트 샘의 존재를 발견 할 수 있다는 것입니다.

2. 바늘 INSErtion

  1. (18 G 표 1 참조) 주사기 바늘을 삽입 ~ 45 ° (그림 1) ~에서 꼬리쪽으로 기울어 진 정액 콘센트에 1cm.
    참고 :이 전에 정액 소켓의 맨 아래에있는 정자의 높은 농도 (그림 1)에 도달하는 정자의 플러그를 통해 밀려으로 그대로 정자 플러그와 바다 가재에, 바늘, 삽입시 약간의 저항을 만날 수있다.
    참고 : 플러그의 존재는 그 자체로, 바다 가재가 성관계를했다고 신뢰할 수있는 지표입니다. 어떤 동물에 spermatophore가 없을 가능성이 있기 때문에, 약간의 저항이있을 수 있으므로, spermatophore는 아직 플러그인으로 강화되지 않았거나 이미 계란 하나 이상의 클러치를 비옥하게하는 데 사용되었을 수 있습니다 작다.

그림 1 그림 1. 바늘 삽입 및 가재 정액 용기의보기. 정자 샘플을 추출하는 가재의 정액 소켓에 뭉툭한 팁 바늘을 삽입. 바늘의 각도와 깊이는 모두 일관된 샘플을 얻기에 중요합니다. 오른쪽 : 해부 및 수직으로 분할 된 정액 소켓의 전망. 정자는 용기의 바닥 (가장 깊은 지점)에 위치하는 동안 정자의 플러그는 콘센트의 위쪽이나 바깥 쪽 부분을 차지합니다. 그것은이 깊이 아래 샘플링 용기에 구멍과 혈액 오염 된 샘플을 초래할 수 있으므로주의하는 것이 중요합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

3. 정자 플러그를 관통

  1. 초기 삽입 후, (몸체 축에 수직 한) 거의 수직으로 바늘의 각도를 가파르게하고, 매우 천천히 작동하기 시작할아래 소켓에.
  2. 끝이 꼬리를 향해 약간의 포인트가되어 있도록 각도로 기울어 진 바늘을 유지합니다. 그것이 결국 매트릭스에 침투 할 때까지이 경우 바늘 끝이 플러그의 상단을 압축한다.
  3. 저항을 한 번 더 느껴질 때까지 천천히 아래로 바늘을 밀어 계속 -이 용기의 바닥과 샘플 촬영입니다.

4. 정자 제거

  1. 용기의 바닥에서 샘플 (종종 솔리드 플러그 재료, 액체 정자와 다른 유체)를 제거하고 레이블이 2.0 ㎖의 플라스틱 튜브에 샘플을 입금.
  2. 차가운 해수 ~ 0.1 ~ 0.5 ㎖로 용기를 세척합니다.
  3. 같은 튜브에 유체 및 장소의 약 0.3 ML를 제거합니다.
  4. 얼음에 저장 정자 샘플들이 실험실에서 검사 할 수있을 때까지.
    파트 B : 실험실에서 정자 샘플의 시험
    참고 : 개별 L의 정액 소켓에서 제거 샘플 obsters는 정자 세포가 존재 또는 부재되었는지 확인하기 위해 조사해야합니다.
  5. 각 플라스틱 튜브, 커버 슬립 유리 슬라이드에 장소 및 복합 현미경으로 100 배의보기에서 ~ 유체의 50 μL를 제거합니다.
  6. 로 샘플을 점수 : 부족한 다수의 또는 결석 정자 (이 연구는 실제 정자의 숫자, 그림 2의 양을하지 않았다).

그림 2
그림 2. 가재 정자 샘플 이미지. 40 배 배율로 복합 현미경으로 볼 때, 여성의 정액 콘센트에서 찍은 가재 정자 샘플의 이미지. 왼쪽의 이미지는 다른 (오른쪽) 스파 스 샘플 (스케일 바 = 10 ㎛)를 보여줍니다 동안 수많은 정자가 포함 된 샘플을 보여줍니다.. JPG "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Representative Results

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여기에보고 된 데이터의 연안 및 해양 지역 모두에서 유래 여성 바다 가재의 하위 집합했다. 의 연안 그룹은 케이프 앤, 매사 추세 츠 근처의 연안 해역에서 캡처 시험을위한 실험실로 냉각기에 수송되었다 44 바다 가재로 구성되었다. 186 해상 바다 가재의 총 조지 은행에 캡처 뉴 햄프셔에서 상용 보유 시설에서 샘플링되었다.

정자 샘플은 전술 된 방법에 따라 모든 동물로부터 얻어지는 즉시 정자의 존재 유무에 대해 조사 하였다. 이 부분 집합의 모든 여성의 90.3 %의 총은 정액 용기에 정자를했다. 놀랍게도, 정자 부족이 사람들은 크기 범위의 작은 끝 (그림 3)에 필요하지 않았다.

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그림 3. 바닷가에있는 정자의 존재에 대한 샘플링 결과 짝짓기의 표시로 자신의 정액 용기에 정자를했다 5mm CL 크기 클래스 쓰레기통 (%의 긍정적 인) 여성 바다 가재. 퍼센트. 여성은 물에서 케이프 앤, MA (71-83밀리미터 CL) 근처에 조지 은행 (89~1백54밀리미터 CL)에서 촬영되었다. 바 내부의 숫자는 그 빈에 대한 전체 표본의 크기를 나타내는 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭 .

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Discussion

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이 비디오 및 종이 윤곽과 여성 가재 성공적 정합 한 경우를 결정하기위한 방법을 보여준다. 이러한 접근 방식은 사용자의 다양한 의해 바다 가재의 대규모 샘플링에 사용될 수있을만큼 간단하다. 이 방법은 짝짓기하는 동안 남성에서 여성 바닷가에 전달되는 정액 소켓에 spermatophore의 존재를 검출을 기반으로합니다. 이러한 spermatophores 부분적들이 리셉터클에 퇴적 직후 정자 마개로 경화되므로, 정자 플러그의 존재는 또한 메이팅 성공 나타낸다. 이 연구뿐만 아니라 후속 큰 연구에서, 정자 플러그의 대부분은 정자들을 11과 관련 있다고 결정 하였다. 플러그의 존재가 상대측 활동의 신뢰할 수있는 지표 인 반면 그러나, 그 부재는 아니다.

이 샘플링 방법론을 산란 여성 바다 가재의 능력에 부정적인 영향을 초래하는 경우에 우리는 완전히 확신 할 수는 없지만성공적으로 계란 클러치을 비옥 D, 손상이 spermatophore 또는 소켓도 최소화 될 것이라고 제안이 정자 샘플링 프로토콜 측면이 있습니다. 데이터는 약간의 바다 가재, 후 정자 샘플링, 여전히 계란의 수정 된 클러치 (N = 3) 돌출과 같은 spermatophore을 사용하여 계란 하나 이상의 클러치를 비옥하게 할 수있다을 나타냅니다 그에게 (지속적인 실험실 연구에서)이 있습니다. 이러한 계란 개발 및 샘플링되지 않은 바다 가재와 비슷하게 부화. 또, 이러한 샘플링 기법은 단지 전체 정자의 작은 부분을 샘플링하는 역할을한다. 그것은 양적 소켓의 전체 내용을 샘플링하기위한 것이 아닙니다. 때문에 용기 (12, 13)의 복잡한 물리적 아키텍처로, 다른 기술 (예를 들어 해부) 그런 결과를 얻기 위해 필요한 것입니다.

spermatophore이 상대적으로 N이었다 가능성이 있기 때문에 정자는 정자 플러그 부족 샘플링 된 동물의 숫자에서 발견되었다EW, 아직 플러그인에 강화하지 않았거나 spermatophore 이전에 계란 하나 이상의 클러치를 비옥하게하는 데 사용했다 및 악화했다. 따라서 상대측 성공의 가장 정확한 인덱스를 얻기 위해는 정자 정자 플러그와 샘플 모두 확인하는 것이 중요하다.

샘플링 절차 동안 바늘의 정확한 배향은 여러 가지 이유로 중요하다. 먼저, 바늘 측면 바디 평면에 평행 한 것을 보장하는 정액 리셉터클의가는 측을 관통하는 것을 방지. 기술이 정확하게 수행 될 때 바늘이 결코 실제로 체강을 관통로, 그것은 어떠한 사망 원인이 없다. 둘째, 바늘의 스티프 닝이어서 45 ° 삽입 각도, 바늘이 정자가 spermatophore의 벽을 관통하고 인접한 보디 부비동를 입력하지 않고 집중되어 리셉터클의 바닥 (도 1)에 도달하도록 도움 .

(13)의 결과로서, 매우 쉽게 acrosomal 반응을 겪는다. 정자가 반응하면, 그들은 샘플에서 분해 식별하기 어려운되기 시작합니다. 이러한 이유로, 샘플 튜브의 교반은 최소로 유지되어야한다. 샘플을 차가운 유지하는 것은 또한 정자의 무결성을 유지하는 데 도움이 나타납니다. 마지막으로,이 때 샘플 처리 살균 해수를 사용하는 것이 좋습니다. 이 정자를 손상시킬 수있는 박테리아 및 기타 미생물의 성장 (36 ~ 48 시간 이상)을 최소화하는 역할을 할 수 있습니다.

샘플링 한 여성 바다 가재 (90.3 %), 대부분은 자신의 정액 용기있는 정자의 존재 여부에 따라 성공적으로 결합했다. 그들은 하나가 성적으로 미숙하기 때문에 동물의 나머지 부분은 자신의 정자 플러그가 시간이 지남에 따라 악화 또는 수 있었다했다, 정자 긍정적되지 않았을 수 있습니다완전히 계란 하나 이상의 클러치를 비옥하게하는 데 사용하거나, 그들은 자신의 털갈이 사이클 (11)에 적절한 시간에 적절한 남성을 발생하지 않을 가능성이 있기 때문에, 성관계 적이 엉. 조지 은행의 지역에서 여성 가재는이 여성의 50 %는 100mm (14)에서 성숙으로, 사이즈에 만기 비교적 큰.을 케이프 앤의 여성은 여성의 50 %가 CL 15 90mm에서 성숙으로, 근해 바다 가재보다 약간 작은 크기로 성숙. 따라서, 정자 플러그가 부족한 여성의 일부는 가능성이 미숙하기 때문에, 결합하지 않았을 있다고 제안 무리없는, 가장 작은 여성은 71mm CL 있다고 없습니다. 이러한 우리의 해양 집합 샘플링 것과 같은 많은 큰 여성 가재는 탈피하고 16 remating없이 년 연속 산란 할 수 있습니다.

같은 spermatophore을 사용하여 여러 fertilizations 결국 플러그 소재의 고장을 초래할 수 있으며, RECEPT에 포함 된 정자를 사용할 수 있습니다에이 클, 부정적인 결과를 얻었다. 그러나, 시간이 지남에 따라 정자 플러그의 기계적 고장, 우리의 지식, 설명되지 않았습니다. 마지막으로, 자신의 용기에 정자가없는 그 여성은 짝을 찾을 수없는 있다고 할 수있다. 기울어 져 여성의 성 비율은 조지 은행 랍스터 주식 17에 설명되어 있고,이 정자 제한에 이르게 가능성으로 인해 가재 인구의 생식 출력에 대한 잠재적 인 결과에 더 관심을받을 권리가있어.

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Disclosures

저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

그들의 협력은 매우 평가된다 - 저자는 그 보트 우리가에서 샘플링 할 수 있던 모든 뉴 잉글랜드 상업 lobstermen에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 우리는 리틀 베이 랍스터 회사 (뉴 잉턴, NH) 우리는 자신의 시설에서 샘플링을 수행 할 수 챔 플린의 요리 (포인트 주디스, RI)를 감사합니다. 다음 UNH 학생은이 연구를 통해 귀중한 도움을 제공 : 헤일리 화이트, 프랑소와 모리슨, 사라 Havener, 드라 Chaput, 월 그로스를. 이 프로젝트는 WHW (프로젝트 # 1 R/CFR-11)과 JSG에 UNH 해양 프로그램 그랜트 NH의 SeaGrant에서 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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에 대한 비 침습적 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 여성 미국의 바닷가에 연결 성공 (의 결정<em&gt; Homarus의 americanus</em&gt;)
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Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

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