Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

En invasiv metode for doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Fiskeri-indusert endringer i utnyttes krepsdyr fiskerier, for eksempel den amerikanske hummer fisket, kan potensielt påvirke sine reproduktive dynamikk, som fører til en reduksjon i parring suksess. Denne studien hadde som mål å utvikle en ikke-invasiv metode for å fastslå parings suksess kvinnelige hummerne som kan være fysiologisk eller funksjonelt moden.

Abstract

Til tross for å være en av de mest produktive fiskeriene i Nordvest-Atlanteren, er fortsatt mye ukjent om de naturlige reproduktive dynamikken i amerikansk hummer. Nyere arbeider i utnyttes krepsdyrpopulasjoner (krabber og hummer) tyder på at det er omstendigheter hvor modne kvinner er i stand til å oppnå sitt fulle reproduksjonspotensial på grunn av sperm begrensning. For å undersøke denne muligheten i ulike regioner av amerikansk hummer fisket, ble en pålitelig og ikke-invasiv metode utviklet for prøvetaking stort antall kvinnelige hummer på sjøen. Denne metoden innebærer å sette inn en butt tupp kanyle inn i kvinnens bryt beholder for å fastslå tilstedeværelse eller fravær av en sperm plugg og for å trekke en prøve som skal undersøkes for nærvær av sædceller. En serie kontrollstudier ble utført på kaien og i laboratoriet for å teste påliteligheten av denne teknikken. Dette arbeidet medførte prøvetaking 294 kvinnelige hummer å bekrefte at tilstedeværelsen ofa sperm pluggen var en pålitelig indikator på sædceller i beholderen og dermed parring. Denne artikkelen beskriver metoden og resultatene fra en undergruppe av den totale kvinner samplet. Av de 230 kvinnelige hummerne samplet fra Georges Bank og Cape Ann, MA (størrelse rekkevidde = 71-145 mm i skjoldlengde), 90,3% var positive for sperm. Potensielle forklaringer på fravær av sædceller i enkelte kvinner inkluderer: umodenhet (manglende fysiologisk modenhet), nedbryting av sperm pluggen etter å ha blitt brukt til å befrukte en clutch av egg, og mangel på parring aktivitet. De undersøkelser tyder på at denne teknikk for å undersøke parring suksess for kvinnelige hummer er en pålitelig proxy som kan brukes i felten til å dokumentere reproduktive aktivitet i naturlige populasjoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Amerikansk hummer (Homarus americanus) er en av de mest produktive fiskeriene i Nord-Atlanteren (~ 56 000 tonn i 2011, verdsatt enn $ 390 millioner) en. Men, det er en generell mangel på forståelse for de reproduktive dynamikken i denne arten i ville populasjoner. Generere mer nøyaktige beregninger av reproduktiv utgang, inkludert antall og størrelser av enkeltpersoner å delta aktivt i reproduksjon, kan forbedre lagervurderingsprosessen. For eksempel har kvinner som er forhindret fra å oppnå sitt fulle reproduksjonspotensial på grunn av sperm begrensning blitt identifisert som en bekymring for flere kommersielt utnyttede marine krepsdyr inkludert: spiny hummer 2, blå krabber 3, kongekrabbe 4, stein krabber 5, og snøkrabbe 6. Det overordnede målet er å finne ut om sperm begrensning kan være en faktor i enkelte regioner av amerikansk hummer fisket også.

nt "> ble observert De første tegn på en potensiell sperm begrensning problem i hummer mens gjennomføre en urelatert tagging studie med ovigerous kvinnelige hummer (med synlig intakte, nylig ekstruderte egg). Gjenfangst rapporter fra fiskere indikerte at ~ 15% av disse dyrene hadde droppet deres egg klørne etter bare 1 til 2 måneder. Arbeids hypotese var at noen hummere ble bære egg som ikke hadde blitt befruktet og, som et resultat, 'falt av '7. Foreløpige data fra en senere studie har bekreftet det faktum at hummer skal ekstrudere egg selv om de ikke har klart å parret og disse ubefruktede egg er bare gjennomført for ~ 1 måned åtte. derfor gitt observasjon av kvinner bærer ubefruktede egg i naturlige populasjoner har vi ønsket å finne ut i hvilken grad sperm begrensning kan være medvirkende til en submaksimal nivå av reproduksjon av kjønnsmodne hummer. For å oppnå dette målet, ble en teknikk utviklet for å oppdage spermatoPhore avsatt av menn under parring.

Dette papiret og video beskrive en ikke-invasiv, enkel metode utviklet for å fastslå parings suksessen til kvinnelige hummer. Teknikken kan brukes raskt og pålitelig på sjøen, enten ombord forskning eller kommersielle fiskefartøyer. Detaljene for denne metoden sampling samt noen representative resultater er presentert for å illustrere anvendelsen av teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Del A: Feltet sampling teknikk

En. Kvinnelige Målinger

  1. For hver hunn hummer, måle skjoldlengde (KL) og bredden av den andre abdominale segment til nærmeste 1,0 mm ved hjelp av et par av målepunkter.
    MERK: Den andre abdominal segmentet måles fordi bredden av magen (der kvinner bærer sine egg) er en indikator på seksuell modenhet. I tillegg kan det være fordelaktig å fastslå molt fasen til senere møter disse data med reproduksjonstrinn (se trinn 1.2).
  2. Klipp en liten distal del av en av de mage pleopods (en standard metodisk protokoll i hummer) og lagre pleopod i rent sjøvann for senere visning med en dissekere mikroskop ni.
    MERK: Dette trinnet kan også avsløre tilstedeværelsen av sement kjertler på pleopods, som er en indikasjon på at kvinner forbereder seg på å ekstrudere eggene sine 10.

2. Needle Insertion

  1. Stikk sprøytespissen (18 G, se tabell 1) ~ 1 cm inn i seminal mottaket, vinklet mot halen på ~ 45 ° (Figur 1).
    MERK: I hummere med intakte sperm plugger, kan nålen møte noen motstand under innføring, som det er presset gjennom sæd pluggen før det når den høyeste konsentrasjonen av sperm i bunnen av den forutgående beholder (fig. 1).
    MERK: Tilstedeværelsen av pluggen, i seg selv, er en pålitelig indikator på at hummer har parret. I noen dyr kan det være litt motstand, muligens fordi ingen spermatofor er til stede, er det spermatofor liten, det har ikke herdet inn en plugg ennå, eller det kan ha allerede blitt brukt til å befrukte en eller flere klørne til egg.

Figur 1 Figur 1. Nålen innsetting og visning av hummer seminal mottaket. Innsetting av stump-tipset nål inn i seminal mottaket av hummer til å trekke ut en sperm prøven. Vinkelen og dybden av nålen befinner seg kritisk for oppnåelse av ensartede prøver. Høyre: Visning av en banebrytende mottaket som har blitt dissekert og delt vertikalt. Sperm pluggen opptar den øverste eller ytterste parti av beholderen, mens den spermatozoa er plassert på bunnen (dypeste punkt) av beholderen. Det er viktig å merke seg at prøvetaking under denne dybden kan punktere mottaket og resultere i en blod-forurenset prøven. Klikk her for å se større bilde .

Tre. Penetrating Sperm Plug

  1. Etter den første innsettings, brattere vinkel på nålen til nesten vertikal (perpendikulær på kroppens akse), og svært sakte begynne å arbeide detnedover i beholderen.
  2. Hold nålen på skrå slik at spissen peker litt mot halen. I dette tilfellet blir nålespissen er komprimere toppen av pluggen, inntil det til slutt trenger inn i matriksen.
  3. Fortsett å sakte presse nålen nedover inntil det føles motstand gang til - dette er i bunnen av beholderen, og hvor prøven er tatt.

4. Sperm fjerning

  1. Ta en prøve (ofte fast pluggmaterialet, flytende spermier og annet fluid) fra bunnen av beholderen og sette prøven i en merket 2,0 ml plastrør.
  2. Skyll beholderen med ~ 0,1-0,5 ml kaldt sjøvann.
  3. Fjern ca 0,3 ml væske og sted i det samme røret.
  4. Butikk sædprøver på is inntil de kan bli undersøkt i laboratoriet.
    Del B: Undersøkelse av sædprøver i Lab
    MERK: Prøver fjernet fra seminal beholdere av individuell l obsters bør undersøkes for å fastslå om sædceller var til stede eller fraværende.
  5. Fjern ~ 50 mL av væske fra hver plastrør, sted på et glass lysbilde med et dekkglass, og visning på 100X med et sammensatt mikroskop.
  6. Resultat prøvene som: sperm knappe, mange, eller fraværende (denne studien ikke kvantifisere faktiske sperm tall, figur 2).

Fig. 2
Figur 2. Hummer sperm eksempelbilder. Bilder av hummer spermprøver tatt fra en kvinnelig bryt mottaket, som sett med et sammensatt mikroskop på 40X forstørrelse. Bilde på venstre viser en prøve som inneholdt mange sperm mens den andre (høyre) illustrerer en glissen prøve (skala bar = 10 mikrometer).. Jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dataene som rapporteres her var for en undergruppe av kvinnelige hummer som stammer fra både nearshore og offshore lokasjoner. Den nearshore-gruppen besto av 44 hummere som ble fanget i de kystnære farvann nær Cape Ann, Massachusetts og transportert i kjølere til laboratoriet for undersøkelse. Totalt 186 offshore hummer ble fanget på Georges Bank og samplet på en kommersiell beholdning anlegget i New Hampshire.

Spermprøver ble erholdt fra alle dyrene og umiddelbart undersøkt med hensyn til nærvær eller fravær av sperm i henhold til metodene beskrevet ovenfor. Totalt 90,3% av alle kvinner i denne undergruppe fikk sperm i sine banebrytende beholdere. Overraskende, var de som manglet sperm ikke nødvendigvis ved den mindre ende av størrelsesområdet (figur 3).

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figur 3. Prøvetaking resultater for tilstedeværelse av sperm i hummer. Prosent av kvinnelige hummer i 5 mm CL størrelsesklasse binger som hadde sperm i sine banebrytende beholdere (prosent positive) som en indikator på parring. Kvinner ble tatt fra vannet i nærheten av Cape Ann, MA (71-83 mm CL) og fra Georges Bank (89-154 mm CL). Tall inne søylene representerer total utvalgsstørrelse for at bin. Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne videoen og papir disposisjon og demonstrere en metode for å avgjøre om kvinnelige hummerne har blitt parret. Denne fremgangsmåten er enkel nok til at den kan brukes for storskala sampling av hummere til havs av en rekke brukere. Metoden er basert på å påvise tilstedeværelse av en spermatofor i seminal mottaket som er gått fra mann til kvinne hummer under parring. Disse spermatophores delvis herde til en sperm plugg kort tid etter at de er satt inn i beholderen, og derfor er også tegn på parring suksess nærvær av en sperm plugg. I denne studien, så vel som en etterfølgende større undersøkelse ble det fastslått at de fleste av sperm plugger hadde sperm forbundet med dem 11. Imidlertid, mens tilstedeværelsen av en plugg er en pålitelig indikator for mating aktivitet, er dens mangel ikke.

Selv om vi ikke kan være helt sikker på om dette prøvetaking metodikk pådrar seg en negativ effekt på evnen til kvinnelige hummer å gyte end hell befrukte sine egg clutch, er det aspekter til dette sperm prøvetaking protokollen som tyder på at skaden vil være minimal til enten spermatofor eller stikkontakten. Det er data (fra pågående lab studier) som viser litt hummer, post-sperm prøvetaking, fortsatt ekstrudere befruktede klørne til eggs (n = 3) og er i stand til å gjødsle mer enn én clutch av egg ved hjelp av samme spermatofor. Disse eggene utvikler og klekkes på samme måte som hummer som ikke har blitt samplet. I tillegg er bare tjener denne sampling teknikk for å prøve en liten brøkdel av den totale sperm. Den er ikke ment å kvantitativt prøve hele innholdet i en beholder. På grunn av den komplekse fysiske arkitekturen til mottager 12,13, vil en annen teknikk (f.eks disseksjon) være nødvendig for å oppnå slike resultater.

Sperm ble funnet i en rekke prøve dyr som manglet en sperm plugg, muligens fordi spermatofor var relativt new, og ennå ikke herdet inn en plugg, eller spermatofor hadde tidligere blitt brukt til å befrukte en eller flere kull av egg og hadde forverret seg. Derfor, for å oppnå en mest mulig nøyaktig indeks på parring suksess er det viktig at både sjekk for en sperm plugg og prøven for spermier.

Nøyaktig orientering av nålen under prosedyren prøvetaking er kritisk for flere grunner. For det første å sikre at nålen er parallell med den laterale kroppsplanet hindrer den fra å trenge inn i den tynne side av den forutgående beholder. Når teknikken er utført på riktig måte, det fører til ingen dødelighet, slik at nålen aldri trenger inn i kroppens hulrom. For det andre, 45 ° innsettingsvinkel, etterfulgt av en brattere av nålen, bidrar til å sikre at nålen når frem til bunnen av beholderen der spermatozoa konsentreres uten å trenge inn i veggen av spermatofor og inn i tilstøtende kropps sinus (figur 1) .

13.. Når sperm har reagert, begynner de å bryte ned i prøven og bli vanskelig å identifisere. Av denne grunn bør agitasjon av prøven ampuller holdes på et minimum. Holde prøvene kule synes også å bidra til å bevare integriteten av sperm. Endelig er det foreslått å benytte sterile sjøvann når prøvebehandling. Dette kan virke til å redusere veksten av bakterier og andre mikroorganismer (over 36 til 48 timer) som kan skade sæden.

De fleste (90,3%) av de kvinnelige hummerne samplet hadde parret med suksess, basert på tilstedeværelse av sperm i sine banebrytende beholdere. Resten av dyrene ikke kan ha vært sperm positive fordi enten de var seksuelt umodne, deres sperm plugger hadde forverret seg over tid eller hadde væreno fullt brukes til å befrukte en eller flere kull av egg, eller de hadde aldri parret, muligens fordi de aldri møtt en passende mann til rett tid i deres molt syklus 11. Kvinne hummer i George Bank regionen har en relativt stor størrelse-på-forfall, med kun 50% av kvinner modnes på 100 mm 14. Cape Ann kvinner modnes på en litt mindre størrelse enn gjør offshore hummer, med 50% av kvinner modnes på 90 mm ​​CL 15. Derfor, gitt at de minste hunner var 71 mm CL, det er ikke urimelig å foreslå at noen av hunnene mangler sperm plugger var sannsynligvis umoden og dermed ville ikke ha parret. Mange store kvinnelige hummer, slik som de samplet i vår offshore undergruppe, kan gyte i år på rad uten å skifte ham og remating 16.

Flere befruktninger bruker samme spermatofor kan til slutt føre til et sammenbrudd av pluggen materiale og kan bruke opp sæden som finnes i receptacle, hvilket ga et negativt resultat. Men den mekaniske sammenbrudd av sperm pluggen over tid har ikke, så vidt vi vet, blitt beskrevet. Til slutt, er det mulig at disse hunnene uten sædceller i sine beholdere klarte ikke å finne en make. Skjeve kvinnelige kjønnsfordelingen har blitt dokumentert i Georges Bank hummer lager 17, og muligheten for at dette fører til sperm begrensning fortjener ytterligere oppmerksomhet på grunn av de potensielle konsekvensene for den reproduktive produksjonen av hummer befolkningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke alle New England kommersielle lobstermen hvis båtene vi fikk lov til å ta prøver fra - samarbeidet er mye verdsatt. I tillegg takker vi Little Bay Lobster Company (Newington, NH) og Champlin sjømat (Point Judith, RI) som tillot oss å gjennomføre prøvetaking på sine anlegg. Følgende UNH studenter gitt uvurderlig hjelp gjennom denne studien: Haley Hvit, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, og mai Grose. Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra NH SeaGrant til WHW (prosjekt # R/CFR-11) og en UNH Marine Program Grant til JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. Available from: http://www.fao.org (2012).
  2. MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
  3. Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
  4. Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
  5. Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
  6. Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
  7. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
  8. Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
  9. Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
  10. Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
  11. Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
  12. Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
  13. Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. Academic Press. NY. 177-216 (1995).
  14. Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
  15. Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
  16. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
  17. Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. Washington, D.C. (2009).
En invasiv metode for<em&gt; In situ</em&gt; Fastsettelse av Mating Suksess i kvinnelig amerikansk hummer (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter