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Un método no invasivo para doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Los cambios inducidos por la pesca-para la pesca de crustáceos explotados, como la pesca de la langosta americana, potencialmente podrían influir en su dinámica reproductiva, lo que lleva a una reducción en el éxito de apareamiento. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método no invasivo para determinar el éxito de apareamiento de las langostas hembras que pueden ser fisiológicamente o funcionales madura.

Abstract

A pesar de ser una de las pesquerías más productivas del Atlántico Noroeste, aún queda mucho por conocer acerca de la dinámica reproductiva naturales de langostas americanas. Trabajos recientes en las poblaciones de crustáceos explotados (cangrejos y langostas) sugiere que hay circunstancias en las hembras maduras son incapaces de alcanzar su potencial reproductivo completo debido a la limitación de los espermatozoides. Para examinar esta posibilidad en diferentes regiones de la pesquería de langosta de América, un método confiable y no invasivo fue desarrollado para el muestreo de un gran número de langostas hembras en el mar. Este método consiste en insertar una aguja en el receptáculo seminal de la hembra de punta roma para determinar la presencia o ausencia de un tapón de esperma y para extraer una muestra que puede ser examinada para detectar la presencia de espermatozoides. Una serie de estudios de control se llevaron a cabo en el muelle y en el laboratorio para poner a prueba la fiabilidad de esta técnica. Estos esfuerzos implicaron muestreo 294 langostas hembra para confirmar que la presencia oenchufe de esperma FA era un indicador fiable de los espermatozoides dentro del receptáculo y, por tanto, el apareamiento. Este documento detalla la metodología y los resultados obtenidos a partir de un subconjunto de las hembras total de la muestra. De los 230 langostas hembra muestreados de Banco de George y Cape Ann, MA (rango 71-145 size = mm de longitud del caparazón), el 90,3% fueron positivas para el esperma. Las posibles explicaciones para la ausencia de espermatozoides en algunas mujeres incluyen: falta de madurez (falta de madurez fisiológica), la ruptura del tapón de esperma después de ser utilizado para fertilizar una nidada de huevos, y la falta de actividad de apareamiento. Las encuestas indican que esta técnica para examinar el éxito de apareamiento de langostas hembra es un proxy fiable que se puede utilizar en el campo para documentar la actividad reproductiva en las poblaciones naturales.

Introduction

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Langosta americana (Homarus americanus) es una de las pesquerías más productivas del Atlántico Norte (~ 56 000 toneladas en 2011, valorado en más de $ 390 millones) 1. Sin embargo, hay una falta general de comprensión de la dinámica de reproducción de esta especie en las poblaciones silvestres. La generación de estimaciones más precisas de producción reproductiva, incluyendo el número y tamaño de los individuos que participan activamente en la reproducción, se puede mejorar el proceso de evaluación de la población. Por ejemplo, las mujeres que se les impide alcanzar su potencial reproductivo completo debido a la limitación de esperma se han identificado como una preocupación para varios crustáceos marinos explotados comercialmente, incluyendo: langostas, cangrejos azules 2 3, 4 cangrejos rey, cangrejos de piedra 5, y los cangrejos de nieve 6. El objetivo general es determinar si la limitación de esperma podría ser un factor en algunas regiones de la pesquería de la langosta americana.

nt "> Se observaron los primeros signos de un problema potencial limitación de esperma en langostas, mientras que la realización de un estudio de marcado no relacionada con las langostas hembras ovígeras (con huevos visiblemente intactos, recientemente extruidos). recaptura informes de los pescadores indicó que ~ 15% de estos animales había disminuido sus puestas de huevos después de sólo 1-2 meses. La hipótesis de trabajo fue que algunas langostas estaban llevando los huevos que no habían sido fertilizados y, como resultado, "se cayó" 7. Los datos preliminares de un estudio posterior ha confirmado el hecho de que las langostas se extrusión de huevos, incluso si no se han apareado con éxito y estos huevos no fertilizados sólo se llevan durante ~ 1 meses 8. Por lo tanto, teniendo en cuenta la observación de las hembras llevan los huevos no fertilizados en las poblaciones naturales, hemos tratado de determinar el grado en el cual la prescripción de esperma podría estar contribuyendo a un nivel submáximo de reproducción por las langostas sexualmente maduros. Para lograr este objetivo, se desarrolló una técnica para detectar la espermatogénesisphore depositada por los machos durante el apareamiento.

Este documento y el vídeo se describen un método no invasivo, simple desarrollada para determinar el éxito de apareamiento de las langostas hembras. La técnica se puede utilizar de forma rápida y fiable en el mar, ya sea a bordo de la investigación o de buques pesqueros comerciales. Los detalles de este método de muestreo, así como algunos resultados representativos se presentan para ilustrar la aplicación de la técnica.

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Protocol

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Parte A: El campo de muestreo Técnica

1. Medidas Femenino

  1. Para cada langosta hembra, medir la longitud del caparazón (CL) y la anchura del segundo segmento abdominal para los 1,0 mm más próximo utilizando un par de pinzas.
    NOTA: El segundo segmento abdominal porque se mide la anchura del abdomen (donde las mujeres llevan sus huevos) es un indicador de la madurez sexual. Además, podría ser ventajoso para determinar la etapa de muda para que coincida más adelante estos datos con la etapa reproductiva (véase el paso 1.2).
  2. Clip una pequeña porción distal de uno de los pleópodos abdominales (un protocolo metodológico estándar de langostas) y almacenar el pleópodo en agua de mar limpia para su posterior visualización con un microscopio de disección 9.
    NOTA: Este paso también puede revelar la presencia de glándulas del cemento en los pleópodos, que son una indicación de que las mujeres se están preparando para la extrusión de los huevos 10.

2. Aguja InseRTion

  1. Inserte la aguja de la jeringa (18 G, véase el cuadro 1) ~ 1 cm en el receptáculo seminal, en ángulo hacia la cola en el ~ 45 ° (Figura 1).
    NOTA: En langostas con tapones de espermatozoides intactos, la aguja puede satisfacer cierta resistencia durante la inserción, ya que se empuja a través del tapón de esperma antes de alcanzar la más alta concentración de espermatozoides en la parte inferior del receptáculo seminal (Figura 1).
    NOTA: La presencia de la clavija, en sí mismo, es un indicador fiable de que las langostas se han apareado. En algunos animales puede haber poca resistencia, posiblemente porque no espermatóforo está presente, el espermatóforo es pequeño, no ha cristalizado en un enchufe todavía, o es posible que ya se han utilizado para fertilizar una o varias puestas de huevos.

Figura 1 Figura 1. La inserción de la aguja y la vista de la langosta receptáculo seminal. Inserción de la aguja en el receptáculo seminal de la langosta de punta roma para extraer una muestra de esperma. El ángulo y la profundidad de la aguja son tanto crítico para la obtención de muestras consistentes. Derecha: Vista de un receptáculo seminal que ha sido diseccionada y dividida verticalmente. El tapón de esperma ocupa la parte superior o exterior del receptáculo, mientras que los espermatozoides se encuentra en la parte inferior (el punto más profundo) del receptáculo. Es importante tener en cuenta que el muestreo por debajo de esta profundidad puede perforar el receptáculo y el resultado en una muestra contaminada con sangre. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

3. Penetrar el esperma Plug

  1. Después de la inserción inicial, más pronunciada el ángulo de la aguja a casi vertical (perpendicular al eje del cuerpo), y muy lentamente comenzar a trabajar sehacia abajo en el receptáculo.
  2. Mantenga la aguja inclinada en un ángulo tal que la punta está apuntando ligeramente hacia la cola. En este caso, la punta de la aguja está comprimiendo la parte superior del tapón, hasta que eventualmente penetra en la matriz.
  3. Continuar para empujar la aguja lentamente hacia abajo hasta sentir una resistencia, una vez más - esta es la parte inferior del recipiente y donde se toma la muestra.

4. Extracción de esperma

  1. Extraer una muestra (a menudo material del tapón sólido, líquido y espermatozoides otro fluido) desde la parte inferior del receptáculo y depositar la muestra en un tubo de plástico de 2,0 ml etiquetados.
  2. Enjuague el recipiente con ~ 0,1 a 0,5 ml de agua de mar fría.
  3. Retire aproximadamente 0,3 ml de líquido y coloque en el mismo tubo.
  4. Muestras de esperma tienda en hielo hasta que puedan ser examinados en el laboratorio.
    Parte B: El examen de las muestras de semen en el laboratorio
    NOTA: Las muestras extraídas de los receptáculos seminales de l individuo obsters deben ser examinados para determinar si los espermatozoides estaban presentes o ausentes.
  5. Retire ~ 50 l de fluido de cada tubo de plástico, lugar en un portaobjetos de vidrio con una hoja de cubierta, y vista a 100X con un microscopio compuesto.
  6. Puntuación muestras como: esperma escaso, numerosas, o ausentes (este estudio no cuantificó el número de espermatozoides reales, Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Imágenes de muestra de esperma de langosta. Imágenes de las muestras de semen de langosta tomadas de receptáculo seminal de una mujer, tal como se observa con un microscopio compuesto a 40X de aumento. La imagen en la izquierda muestra una muestra que contenía numerosos espermatozoides mientras que el otro (derecha) ilustra una muestra escasa (barra de escala = 10 micras).. "Target =" _blank jpg "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Representative Results

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Los datos aquí presentados son para un subconjunto de las langostas hembras que se originaron en tanto cerca de la costa y de los centros extraterritoriales. El grupo constaba de 44 nearshore langostas que fueron capturadas en las aguas costeras cerca de Cape Ann, Massachusetts y transportan en neveras al laboratorio para su análisis. Se capturaron un total de 186 langostas en alta mar en el Banco de George y se tomaron muestras a un centro de detención comercial en Nueva Hampshire.

Las muestras de esperma se obtuvieron de todos los animales y de inmediato examinados para la presencia o ausencia de espermatozoides de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Un total de 90.3% de todas las mujeres en este subconjunto tuvo esperma en sus receptáculos seminales. Sorprendentemente, las que carecía de los espermatozoides no eran necesariamente en el extremo más pequeño de la gama de tamaño (Figura 3).

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Figura 3. Los resultados del muestreo de la presencia de espermatozoides en langostas. Porcentaje de langostas hembras en 5 compartimentos mm de tamaño de CL de clase que tenían espermatozoides en sus receptáculos seminales (porcentaje positivo) como un indicador de apareamiento. Las hembras fueron capturadas en las aguas cerca de Cape Ann, MA (71-83 mm LC) y del Banco de George (89 a 154 mm LC). Los números dentro de las barras representan el tamaño total de la muestra para ese bin. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Discussion

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Este esquema de vídeo y papel y demostrar un método para determinar si langostas hembra se han apareado con éxito. Este enfoque es bastante simple que se puede utilizar para la toma de muestras a gran escala de langostas en el mar por una variedad de usuarios. El método se basa en la detección de la presencia de un espermatóforo en el receptáculo seminal que se transmite de hombre a langostas hembra durante el apareamiento. Estos espermatóforos endurecen parcialmente en un tapón de esperma poco después de que se depositan en el recipiente, por lo que, la presencia de un tapón de esperma también es indicativo de éxito de apareamiento. En este estudio, así como un estudio más amplio posterior, se determinó que la mayor parte de las bujías de esperma de esperma habían asociado con ellos 11. Sin embargo, mientras que la presencia de un tapón es un indicador fiable de la actividad de apareamiento, su ausencia no es.

Aunque no podemos estar del todo seguro de si este método de muestreo incurre en un efecto negativo sobre la capacidad de las langostas hembras para desovar unad fertilizar con éxito su nidada, hay aspectos de este protocolo de muestreo de esperma que sugieren que el daño sería mínimo ya sea el espermatóforo o el receptáculo. Se dispone de datos (a partir de estudios de laboratorio en curso) que indican algunas langostas, muestreo post-esperma, aún extruir garras fertilizados de los huevos (n = 3) y son capaces de fertilizar más de una nidada de huevos usando la misma espermatóforo. Estos huevos se desarrollan y eclosionan de forma similar a las langostas que no han sido incluidos en la muestra. Además, esta técnica de muestreo sólo sirve para muestrear una pequeña fracción del total de espermatozoides. No se pretende probar cuantitativamente el contenido completo de un receptáculo. Debido a la compleja arquitectura física del receptáculo 12,13, una técnica distinta (por ejemplo, la disección) sería necesario para obtener ese tipo de resultados.

Los espermatozoides se encuentra en un número de animales muestreados que carecían de un tapón de esperma, posiblemente debido a que el espermatóforo fue relativamente new, y aún no se había endurecido en un enchufe, o el espermatóforo se haya utilizado previamente para fertilizar una o varias nidadas de huevos y se había deteriorado. Por lo tanto, con el fin de obtener el índice más preciso de éxito de apareamiento es importante tanto para la verificación de un tapón de esperma y de la muestra para el esperma.

La orientación precisa de la aguja durante el procedimiento de muestreo es crítico para varias razones. En primer lugar, asegurando que la aguja se encuentra paralelo al plano lateral del cuerpo impide que penetre el lado delgado de la receptáculo seminal. Cuando la técnica se realiza correctamente, no causa la mortalidad, cuando la aguja penetra en realidad nunca la cavidad del cuerpo. En segundo lugar, el ángulo de inserción 45 °, seguido por un empinamiento de la aguja, ayuda a asegurar que la aguja alcanza la parte inferior del receptáculo donde los espermatozoides se concentran sin penetrar la pared de la espermatóforo y entrar en el seno del cuerpo adyacente (Figura 1) .

13. Una vez que los espermatozoides han reaccionado, comienzan a descomponerse en la muestra y se convierten en difíciles de identificar. Por esta razón, la agitación de los viales de muestra se debe mantener a un mínimo. Mantener las muestras fresco también parece ayudar a preservar la integridad de los espermatozoides. Por último, se sugiere usar el agua de mar estéril cuando procesamiento de la muestra. Este puede actuar para reducir al mínimo el crecimiento de bacterias y otros microorganismos (más de 36-48 h) que podrían dañar el esperma.

La mayoría (90.3%) de las langostas mujeres en la muestra se habían apareado con éxito, sobre la base de la presencia de esperma en sus receptáculos seminales. El resto de los animales podría no haber sido el esperma positivo, ya sea porque eran sexualmente inmaduros, sus tapones espermáticos se habían deteriorado con el tiempo o ser tenidoes plenamente utilizados para fertilizar una o varias puestas de huevos, o que nunca habían apareado, posiblemente porque nunca encontraron con un hombre adecuado en el momento adecuado en su ciclo de muda 11. Langostas femeninas en la región del Banco de la George tienen un tamaño relativamente grande de madurez, con sólo el 50% de las hembras maduras a 100 mm 14. Hembras Cape Ann maduran a un tamaño ligeramente más pequeño que lo hacen las langostas en alta mar, con el 50% de las hembras maduras a 90 mm ​​CL 15. Por lo tanto, dado que las hembras más pequeñas fueron de 71 mm de LC, no es razonable sugerir que algunas de las mujeres que carecen de tapones de esperma era probable inmaduros y, por tanto, no habría acoplado. Muchas grandes langostas femeninas, como los muestreados en nuestro subconjunto de la costa, pueden desovar en años consecutivos sin la muda y aparearse 16.

Múltiples fertilizaciones utilizando el mismo espermatóforo eventualmente puede resultar en una avería del material del tapón y puede utilizar hasta los espermatozoides contenidos en el receptAcle, dando un resultado negativo. Sin embargo, la ruptura mecánica de la clavija de esperma con el tiempo no ha, para nuestro conocimiento, ha descrito. Por último, es posible que esas mujeres sin esperma en sus receptáculos no pudieron localizar a un compañero. Relaciones sexuales sesgadas se han documentado en la George langosta acciones del Banco 17, y la posibilidad de que esto conduce a la limitación de esperma merece más atención debido a las posibles consecuencias para el rendimiento reproductivo de la población de langosta.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a todos los pescadores de langostas comerciales de Nueva Inglaterra cuyos barcos se nos permitió muestra de - su cooperación es muy apreciada. Además, agradecemos a Little Bay Lobster Company (Newington, Nueva Hampshire) y de Champlin Mariscos (Point Judith, Rhode Island), que nos permitió realizar el muestreo en sus instalaciones. Los siguientes estudiantes UNH proporcionaron asistencia invaluable a lo largo de este estudio: Haley Blanco, Françoise Morrison, Sarah Havener, Audra Chaput, y mayo Grose. Este proyecto fue apoyado por becas de NH SeaGrant a WHW (proyecto # R/CFR-11) y una subvención del programa UNH Marino que JSG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

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References

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Un método no invasivo para<em&gt; In situ</em&gt; Determinación de Éxito de apareamiento en americano femenino Langostas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
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Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

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