Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

A Noninvaziv Yöntemi doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

Böyle Amerikan ıstakoz balıkçılık gibi sömürülen kabuklu balıkçılık için balıkçılık kaynaklı değişimler, potansiyel çiftleşme başarısında düşüşe neden üreme dinamiklerini etkileyebilir. Bu çalışmanın amacı, fizyolojik veya işlevsel olgun olabilir dişi ıstakoz çiftleşme başarısını tespit etmek için non-invaziv bir yöntem geliştirmek için oldu.

Abstract

Kuzeybatı Atlantik'te en verimli balıkçılık biri olmasına rağmen, çok Amerikan ıstakoz doğal üreme dinamikleri hakkında bilinmemektedir. Sömürülen kabuklu nüfus (yengeç ve ıstakoz) son çalışmalar olgun kadın nedeniyle sperm sınırlaması tam üreme potansiyeline ulaşmak mümkün durumlar vardır olduğunu göstermektedir. Amerikan ıstakoz balıkçılık farklı bölgelerinde bu olasılığı incelemek için, güvenilir ve ağrısız bir yöntem denizde kadın ıstakoz çok sayıda örnekleme için geliştirilmiştir. Bu yöntem, bir sperm fiş varlığını veya yokluğunu belirlemek için ve sperm varlığı açısından incelenebilir bir örnek geri alma dişinin seminal deponun içine bir küt uçlu bir iğne ekleme içerir. Kontrol çalışmalarında bir dizi bu tekniğin güvenilirliğini test etmek için dock ve laboratuarda yapılmıştır. Bu çabalar 294 kadın ıstakoz onaylamak için örnekleme getirdiğini varlığı ofa sperm fiş güvenilir bir kap içinde sperm göstergesidir ve dolayısıyla, çiftleşme oldu. Bu kağıt metodoloji ve örneklenen toplam kadın bir alt elde edilen sonuçları göstermektedir. George Bankası ve Cape Ann, MA örneklemeyi 230 kadın ıstakoz (boyut aralığı = Kabuk uzunluğu olarak 71-145 mm),% 90.3 sperm için pozitiftir. Bazı kadınlarda sperm yokluğu için potansiyel açıklamalar şunlardır: gelişmemişlik (fizyolojik olgunluk eksikliği), yumurtası döllemek için kullanılan sonra sperm fiş dökümünü ve çiftleşme aktivite eksikliği. Anketler kadın ıstakoz çiftleşme başarısını incelemek için bu teknik doğal popülasyonlarının üreme aktivitesini belgelemek için alanda kullanılabilecek güvenilir bir vekil olduğunu göstermektedir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Amerikan ıstakoz (Homarus americanus) Kuzey Atlantik (~ $ 390,000,000 üzerinde değerli 2011 yılında 56.000 mt) 1 en verimli balıkçılık biridir. Ancak, vahşi popülasyonlar bu türün üreme dinamikleri konusunda anlayış genel bir eksikliği vardır. Aktif üreme katılan bireylerin sayısı ve boyutları da dahil olmak üzere üreme çıkış daha doğru tahminler, üreten bir stok değerlendirme sürecini iyileştirmek olabilir. Dikenli ıstakoz 2, mavi yengeç 3, kral yengeç 4, taş yengeçler 5 ve kar yengeç: Örneğin, nedeniyle sperm sınırlaması tam üreme potansiyelini elde engellenir kadın dahil olmak üzere birçok ticari istismar deniz kabuklular için bir endişe olarak tespit edilmiştir 6. Genel amaç sperm sınırlama yanı sıra Amerikan ıstakoz balıkçılığın belirli bölgelerinde bir faktör olabilir eğer belirlemektir.

nt "> (gözle görülür sağlam, son zamanlarda sıkılır yumurta) ovigerous kadın ıstakoz ile alakasız bir etiketleme çalışması yapılırken İstakozlarda potansiyel bir sperm sınırlama sorununun ilk belirtileri gözlendi. ~ bu hayvanların% 15 düşmüş olduğu belirtilen balıkçıların raporları Recapture onların yumurta kavramaları sadece 1-2 ay sonra. çalışma hipotezi bazı ıstakoz döllenmiş olmasaydı yumurta taşıma ve, sonuç olarak, 'düştü' 7., bir sonraki çalışmasının ön veriler gerçeği doğruladı olduğunu olduğunu ıstakoz olacak başarıyla evlendirilen değil ve bu döllenmemiş yumurta, sadece ~ 1 ay 8 uygulansa bile yumurta a'ya. Dolayısıyla, doğal popülasyonlarının döllenmemiş yumurta taşıyan dişilerin gözlem verilen, biz sperm sınırlama katkıda olabilir için kapsamını belirlemek için çalıştı cinsel olgun ıstakozlarına üreme bir submaksimal düzeyde. Bu hedefe ulaşmak için, teknik spermatositlerde algılamak için geliştirilmiştirPhore çiftleşme sırasında erkek tarafından yatırılır.

Bu kağıt ve video kadın ıstakoz çiftleşme başarısını tespit etmek için geliştirilen bir invaziv olmayan, basit bir yöntem. Teknik denizde, ya araştırma ya da ticari balıkçı teknelerinde hızlı ve güvenilir şekilde kullanılabilir. Bu numune alma yöntemin ayrıntıları yanı sıra bazı temsili bulgular tekniğinin uygulanmasını göstermek için sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kısım A: Alan Örnekleme Tekniği

1.. Kadın Ölçümler

  1. Her dişi ıstakoz, karapas uzunluğu (CL) ve kaliperler bir çift kullanarak en yakın 1.0 mm, ikinci karın segmentinin genişliğini ölçmek.
    NOT: (dişiler yumurta taşıyan) karın genişliği cinsel olgunluk göstergesidir çünkü ikinci karın segmenti ölçülür. Buna ek olarak, (adım 1.2), daha sonra üreme aşaması ile, bu veriler için gerekli dökücü sahne tespit edilmesi avantajlı olabilir.
  2. Karın pleopods birinde (İstakozlarda standart bir metodolojik protokol) kapalı bir küçük distal bölümünü Klip ve daha sonra bir diseksiyon mikroskobu 9 görüntüleme için temiz deniz suyunda pleopod saklayın.
    NOT: Bu adım aynı zamanda dişiler yumurtalarını 10 a'ya hazırlanıyor bir göstergesidir pleopods, çimento bezlerinin varlığını ortaya çıkarabilir.

2. İğne Insertion

  1. (18, G Tablo 1 e bakınız), şırınga iğnesi kaydedin ~ 45 ° (Şekil 1) ° 'de, kuyruk doğru açılı seminal deponun içine 1 cm.
    Not: önce seminal deponun altındaki sperm en yüksek konsantrasyonu (Şekil 1) ulaşmak için sperm tamponundan itilir gibi dokunulmamış sperm fişli ıstakoz, iğne, sokma esnasında bir direnç karşılayabilir.
    NOT: fiş varlığı, kendi içinde, ıstakozlar evlendirilen olduğunu güvenilir bir göstergedir. Bazı hayvanlarda hiçbir spermatofor mevcut olabilir, çünkü çok az direnç olabilir, spermatofor henüz bir fiş içine sertleştirilmiş edilmemiştir, ya da daha önce yumurta bir veya daha fazla kavramaları dölleme için kullanılmış olabilir küçüktür.

Şekil 1 Şekil 1. İğne ekleme ve ıstakoz seminal kabın görüntüle. Sperm örneği ayıklamak için ıstakoz seminal yuvasına künt uçlu iğne takma. İğnenin açısı ve derinliği de tutarlı bir numune elde etmek için kritiktir. Sağ: disseke ve dikey olarak bölünmüş olan bir seminal deponun göster. Spermatozoa deponun dibinde (derin noktası) seviyesinde yer alan ise sperm fiş, kabın en üst ya da en dış kısmını kaplar. Bu bir derinlikten numune kabını delinerek kan kirlenmiş numunesi neden olabilir dikkat etmek önemlidir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

3. Sperm Tak Penetran

  1. Başlangıçtaki yerleştirme sonrası, (vücut eksenine dik olarak) yaklaşık dikey iğne açısını yükselmek ve çok yavaş çalışmaya başlaraşağı kabın içine.
  2. Uç kuyruk doğru hafifçe işaret edilmektedir, böylece belirli bir açıda eğimli iğne tutun. Sonunda matris içine nüfuz kadar bu durumda, iğne ucu, tıpanın üst sıkıştırma edilir.
  3. Direnç kez daha hissedilir kadar yavaş yavaş aşağıya doğru itmek için iğne devam - bu kabın alt ve numune alınır burada.

4. Sperm Kaldırma

  1. Haznenin dibinden bir örnek (çoğunlukla katı fiş madde, sıvı, sperm ve diğer sıvı) çıkarın ve 2.0 ml işaretlenmiş bir plastik tüpe örnek yatırmak.
  2. Soğuk deniz suyu ~ 0.1-0.5 ml yuvasını yıkayın.
  3. Aynı tüp içerisinde sıvı ve yeri, yaklaşık 0.3 ml çıkarın.
  4. Buz üzerinde mağaza sperm numuneleri laboratuvarda incelenir kadar.
    Bölüm B: Lab Sperm Örneklerinin İncelenmesi
    Not: Bireysel l seminal kapların kaldırılır Örnekler obsters sperm hücreleri mevcut veya yok olmadığını belirlemek için muayene edilmelidir.
  5. Her plastik tüp, bir kapak kayma ile bir cam slayt üzerinde bir yerde, ve bir bileşik mikroskop ile 100X at görünümünde ~ sıvının 50 ul çıkarın.
  6. Gibi örnekler Puan: kıt sayıda, ya da hiç sperm (bu çalışmada gerçek sperm sayıları, Şekil 2 ölçmek vermedi).

Şekil 2,
Şekil 2. Istakoz sperm örneği görüntüler. 40X büyütmede bir bileşik mikroskop ile bakıldığında, bir dişinin seminal priz alınan ıstakoz sperm örneklerinin Görüntüler. Soldaki resim, diğer (sağ), seyrek bir örneği (ölçek bar = 10 mikron) göstermektedir ise çok sayıda sperm bulunan bir örnek gösterir.. Jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada bildirilen veriler nearshore ve offshore yerlerde hem kökenli kadın ıstakoz bir alt kümesi için vardı. Nearshore grup Cape Ann, Massachusetts yakın kıyı sularında yakalanan ve inceleme için laboratuvara soğutucularda taşınan 44 ıstakoz oluşuyordu. 186 deniz ıstakoz toplam George Bank yakalanan ve New Hampshire'da bir ticari tutma tesiste örneklenmiştir.

Sperm numuneleri yukarıda tarif edilen yöntemlere göre tüm hayvanların elde edilmiş ve hemen sperm varlığı ya da yokluğu için incelenmiştir. Bu gruptaki tüm kadınların% 90.3 toplam seminal kaplarda sperm vardı. Şaşırtıcı bir şekilde, sperm yoksun olanlardır boyut aralığının daha küçük olan ucunda (Şekil 3) zorunlu olarak değil.

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50498/50498fig3.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 3,. Istakoz sperm varlığı için örnekleme sonuçları çiftleşme bir göstergesi olarak seminal kaplarda sperm vardı 5 mm CL büyüklüğü sınıfı bidonları (yüzde pozitif) kadın ıstakoz. Yüzde. Dişiler sulardan Cape Ann, MA (71-83 mm CL) yakın ve George Bankası (89-154 mm CL) ele geçirildi. Çubukların içindeki sayılar o kutu için toplam örneklem boyutunu temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu video ve kağıt anahat ve dişi ıstakoz başarıyla evlendirilen varsa belirlemek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yaklaşım kullanıcıların çeşitli denizde ıstakoz büyük ölçekli örnekleme için kullanılabilir olması yeterince basittir. Bu yöntem çiftleşme sırasında erkek ikinci dişi ıstakoz geçirilen seminal hazne içinde bir spermatofor varlığını tespit dayanmaktadır. Bu spermatophores kısmen da hazne içinde yatırılır kısa bir süre sonra, bir sperm fiş halinde sertleşmesi, bu yüzden, bir sperm tıpanın varlığı da çiftleşme başarı göstergesidir. Bu çalışma, hem de bir sonraki daha büyük bir çalışmada, sperm fişlerini en sperm onlarla 11 ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Bir fiş varlığı çiftleşme aktivitesinin güvenilir bir göstergesi iken Ancak, onun yokluğu değildir.

Bu örnekleme yöntemi bir yumurtlamak için kadın ıstakoz yeteneği üzerinde olumsuz bir etkisi doğurur eğer biz tamamen belli olamaz rağmenbaşarıyla yumurta debriyaj döller d, hasar spermatofor veya kaseye birine minimal olacağını düşündürmektedir bu sperm numune alma protokolü gelmeyen boyutlar. Veri bazı ıstakoz, post-sperm örnekleme, hala yumurta döllenmiş clutches (n = 3) a'ya ve aynı spermatofor kullanarak yumurta birden debriyaj gübreleme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir (devam eden laboratuvar çalışmaları itibaren) vardır. Bu yumurtalar gelişir ve örneklenmiş henüz ıstakoz benzer yumurtadan. Buna ek olarak, bu teknik sadece örnekleme toplam sperm küçük bir kısmını örnek vermektedir. Bu kantitatif bir deponun tam içeriğini örnek için uygun değildir. Nedeniyle deponun 12,13 karmaşık fiziksel mimarisi, farklı bir tekniği (örneğin diseksiyon) sonuçlarının bu türlü elde etmek için gerekli olacaktır.

Spermatofor nispeten n olduğu olasılıkla sperm, bir sperm fiş yoksun örneklenmiş olan hayvanlardan bir dizi bulunduew, ve henüz bir fiş içine sertleştirilmiş olmasaydı, ya spermatofor önce yumurta bir veya daha fazla kavramaları döllemek için kullanılır olmuştu ve kötüleşmişti. Bu nedenle, çiftleşme başarının en doğru dizini elde etmek için sperm için bir sperm fiş ve örnek için hem kontrol için önemlidir.

Örnekleme işlemi sırasında iğnenin doğru yönlendirme çeşitli nedenlerle önemlidir. İlk olarak, iğne yanal gövde düzlemine paralel olduğu güvence seminal haznenin ince yan nüfuz etmesini önler. Tekniği doğru yapıldığında iğne aslında hiç vücut boşluğuna nüfuz gibi, bu, hiçbir mortaliteye neden olmaktadır. İkinci olarak, iğnenin bir dikleşme ve ardından 45 ° yerleştirme açısı, iğne spermatozoa spermatofor duvarını içinden nüfuz edebilmekte ve bitişik gövde sinüs girmeden konsantre edilir, haznenin alt (Şekil 1) ulaşmasını sağlamak için yardımcı olur .

13 bir sonucu olarak, oldukça kolay akrozomal reaksiyona tabi tutulur. Sperm reaksiyona sonra, bu numune içinde yıkmak ve tespit etmek zor olmaya başlar. Bu nedenle, örnek şişelerin çalkalama minimumda tutulmalıdır. Örnekleri serin tutulması da sperm bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için görünür. Son olarak, zaman örnek işleme steril deniz suyu kullanılması tavsiye edilir. Bu sperm zarar verebilecek bakteri ve diğer mikroorganizmaların büyümesini (36-48 üzerinde saat) en aza indirmek için hareket edebilir.

Örneklenmiş kadın ıstakoz (% 90.3) en seminal kaplarda sperm varlığına dayanarak, başarıyla evlendirdi etmişti. Onlar da cinsel olgunlaşmamış çünkü hayvanların kalan sperm fişler zamanla kötüleşti ya da olmak vardı, sperm olumlu olmayabilirditam yumurta bir veya daha fazla kavramaları döllemek için kullanılan, ya da onlar kendi tüy dökme döngüsü 11 doğru zamanda uygun bir erkek asla karşılaşmak muhtemelen, çünkü evlendirilen hiç tr. George Bankası bölgedeki kadın ıstakoz var, bir kadın yalnızca 50% 100 mm 14 yaşında olgun ile, boy-at-vadeye nispeten büyük. Cape Ann kadın kadınlarda% 50 CL 15 90 mm ​​olgun ile, deniz ıstakoz yapmak biraz daha küçük bir boyutta olgun. Bu nedenle, spermin fişleri eksik kadınlarda bazı muhtemel olgunlaşmamış ve böylece evlendirdi olmazdı olduğunu önermek mantıksız değildir, küçük dişiler 71 mm CL verilen bu. Böyle Bizim offshore altkümedeki örneklenmiş gibi birçok büyük kadın ıstakoz, tüy değiştirme ve 16 remating olmadan yıl üst üste doğurabilir.

Aynı spermatofor kullanarak birden GÜBRELEMENİN sonunda fiş malzemenin bir arıza neden olabilir ve Recept bulunan sperm kadar kullanabilirsinizacle, negatif sonuç elde edilmiştir. Ancak, zaman içinde, sperm tıpanın mekanik arıza, bizim bilgimize göre, tarif edilmemiştir. Son olarak, kendi kaplarda sperm olmayanlar kadın bir eş bulmak için koyamadık mümkündür. Çarpık kadın cinsiyet oranları George Bankası ıstakoz stokta 17 dokümante edilmiştir, ve bu sperm kısıtlamaya neden olduğu olasılığı nedeniyle ıstakoz nüfusun üreme çıkışı için potansiyel sonuçlara daha fazla ilgiyi hakediyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgments

Onların işbirliği çok takdir - Yazarlar olan tekneler biz örnekleme için izin verildi, tüm New England ticari lobstermen teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, biz Little Bay Lobster Şirketi (Newington, NH) ve bize kendi tesislerinde örnekleme yapmak izin Champlains Seafood (Point Judith, RI) teşekkür ederim. Aşağıdaki UNH öğrenciler bu çalışma boyunca değerli yardım sağladı: Haley Beyaz, Françoise Morrison, Sarah HAVENER, Audra CHAPUT ve Mayıs grose. Bu proje whw (proje # R/CFR-11) ve JSG bir UNH Deniz Programı Hibe NH SeaGrant hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAO and Agriculture Organization of the United Nations). Fisheries and Aquaculture Department. Available from: http://www.fao.org (2012).
  2. MacDiarmid, A., Butler, M. J. Sperm economy and limitation in spiny lobsters. Behav. Ecol. Sociobiol. 46, 14-24 (1999).
  3. Kendall, M. S., Wolcott, D. L., Wolcott, T. G., Hines, A. H. Influence of male size and mating history on sperm content of ejaculates of the blue crab Callinectes sapidus. 230, 235-240 (2002).
  4. Sato, T., Ashidate, M., Goshima, S. Effects of male mating frequency and male size on ejaculate size and reproductive success of female spiny king crab, Parolithodes brevipes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 296, 251-262 (2005).
  5. Sato, T., Goshima, S. Impacts of male-only fishing and sperm limitation in manipulated populations of an unfished crab, Hapalogaster. 313, 193-204 (2006).
  6. Rondeau, A., Sainte-Marie, B. Variable mate-guarding time and sperm allocation by male snow crabs (Chionoecetes opilio) in response to sexual competition, and their impact on the mating success of females. Biol. Bull. 201, 204-217 (2001).
  7. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Mating and insemination in the Ameri can lobster,Homarus americanus. Crustacean sexual behavior. Bauer, R. T., Martin, J. W. Columbia University Press. NY. 126-144 (1990).
  8. Johnson, K. J., Goldstein, J. S., Watson, W. H. Two methods for determining the fertility status in early-stage American lobster, Homarus americanus, eggs. J. Crust. Biol. 31, 693-700 (2011).
  9. Aiken, D. E. Proecdysis, setal development, and molt prediction in the American lobster (Homarus). 30, 1337-1344 (1973).
  10. Aiken, D. E., Waddy, S. L. Cement gland development, ovary maturation, and reproductive cycles in the American lobster Homarus americanus. J. Crust. Biol. 2, 315-327 (1982).
  11. Pugh, T. L., Goldstein, J. S., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson, W. H. At-sea determination of female American lobsters (Homarus americanus) mating activity: Patterns vs. expectations. Fish. Res. 147, 327-337 (2013).
  12. Bauer, R. T. Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans. J. Crust. Biol. 6, 313-325 (1986).
  13. Talbot, P., Helluy, S. Reproduction and embryonic development. Biology of the Lobster: Homarus americanus. Factor, J. R. Academic Press. NY. 177-216 (1995).
  14. Cooper, R. A., Uzmann, J. R. Ecology of juvenile and adult Homarus. The biology and management of lobsters. Cobb, J. S. 2, Academic Press. NY. 97-142 (1980).
  15. Estrella, B. T., McKiernan, D. J. Catch-per-unit-effort and biological parameters from the Massachusetts coastal lobster (Homarus americanus) resource: description and trends. NOAA Tech. Rep. NMFS. 81, (1989).
  16. Waddy, S. L., Aiken, D. E. Multiple fertilization and consecutive spawning in large American lobster, Homarus americanus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 43, 2291-2294 (1986).
  17. Atlantic States Marine Fisheries Commission (ASMFC). American lobster stock assessment report for peer review. ASMFC Stock Assessment. Washington, D.C. (2009).
A Noninvaziv Yöntemi<em&gt; In situ</em&gt; Kadın American Istakoz&#39;ların çiftleşme Başarı (Belirlenmesi<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter