Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50512
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 3,5
1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Program in Molecular Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, 4Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine, 5Department of Pathology and Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Summary

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

Abstract

מבחני ה-DNA מחייבת רבים כגון מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA), מבחני chemiluminescent, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) המבוסס על מבחני, ומבחנים מבוססי multiwell משמשים למדידת פעילות גורם שעתוק. עם זאת, מבחני אלה הם nonquantitative, חסרי ייחוד, עשוי להיות כרוכים בשימוש בoligonucleotides רדיואקטיבי, ולא יכולים להיות ישים להקרנה של מעכבים של ה-DNA המחייבים. מצד השני, באמצעות assay כמותיים-DNA מחייבת צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA) assay, אנחנו מדגימים אינטראקציות חלבון גרעיניות עם ה-DNA באמצעות גורם שעתוק Runx2 שתלוי בקשר ספציפי עם רצפי ה-DNA מחייבת קונסנסוס נוכחי ביוטין oligonucleotides שכותרתו. הכנת תאים, מיצוי של חלבון גרעיני, ועיצוב של oligonucleotides גדילים הכפולה מתוארים. צלחות 96 היטב מצופה Avidin קבועות עם חיץ אלקליין וטופחו עם חלבונים גרעיניים במאגר נוקלאוטיד חסימה. Follבשל שטיפה נרחבת של הצלחות, נוגדן ראשוני ספציפי וincubations נוגדנים משני ואחריו התוספת של מצע חזרת peroxidase ופיתוח של תגובת colorimetric. מצב תגובת עצירה או ניטור רציף הקינטית שימש למדידת אינטראקציה חלבון עם DNA כמותית. אנחנו דנים בבקרות ספציפיות מתאימות, כוללים טיפול עם IgG אינו ספציפי או בלי חלבון או נוגדן ראשוני. יישומים של assay מתוארים כוללים השירות שלה בהקרנת סמים ותוצאות חיוביות ושליליות נציג הם דנו.

Introduction

יש מבחני ה-DNA מחייבת שירות במדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים לכלול מבחני electrophoretic משמרת ניידות (EMSA) שתלויים בoligonucleotides radiolabeled 1 או מבחני chemiluminescence 2. מבחני מבוססים immuneprecipitation הכרומטין (שבב) 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 גם תוארו. עם זאת, EMSA הוא assay שאינו כמותיים הדורש את השימוש של oligonucleotides רדיואקטיבי. כאשר חלבונים גרעיניים לקשר עם רצפי אמרגן נוקלאוטיד הספציפיים, מתחמי מחייבים הם מפגרים בג'לים polyacrylamide וגורמים שעתוק הספציפי יכול להיות מאומת עם "supershift" נוגדן. פיתחנו assay-DNA מחייבת כמותית באמצעות פורמט צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA), אשר מסוגל למדוד את האינטראקציה של Runx2 עם רצפי ה-DNA מחייבת המתאימים לאלמנטי אמרגן מוגדרים iגנים מטרת Runx2 n. שימוש בנוגדן אנטי Runx2 מספק סגוליות לassay וחוסר radiolabel להבחין assay זה מassay משמרת ג'ל המסורתי 5. איתור של מתחמים מחייבים אפשרי עם השימוש בנוגדנים משני מצמידים את חזרת peroxidase (HRP), אשר ממיר מצע HRP, tetramethyl benzidine (TMB) למוצר בצבע לניתוח spectrophotometric. Assay דיווח כאן ניתן לשלב את השימוש של oligonucleotides DNA מוטציה שולטת ויכול לשמש לזיהוי של מעכבים תחרותיים או לא תחרותיים של ה-DNA המחייב. ההקרנה של תרכובות אנטי סרטניים רומן אפשרי גם עם assay זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כמה צעדים מבוצעים מבעוד מועד וכמה חומרים כימיים מוכנים ומאוחסנים לפני ההליך: (1) בידוד תרבית תאים וחלבונים, (2) הכנת oligonucleotide, (3) הכנת צלחות 96 היטב, (4) תמצית גרעינית לילה דגירה. הליך דורש 2 ימים בגלל הדגירה הלילה של חלבון גרעיני עם oligonucleotides ה-DNA.

1. הכנת חוצצים

1.1 בידוד חלבון גרעיני

  1. Hypotonic הצפת: כדי להכין של חיץ hypotonic 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 150 μl (1 M MgCl 2), 333 μl (3 M KCl) ל98.3 מיליליטר H 2 O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ KCl. לחיץ hypotonic + NP40 (לשימוש בשלב 2.11): הוסף 0.5 מיליליטר (NP40 10%) ל9.5 חיץ hypotonic מיליליטר לNP40 0.5% סופיים.
  2. דלת מלח הצפת: כדי להכין של חיץ נמוך מלח (לשימוש בשלב 2.15) 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 25 מגליצרול ליטר, 150 μl (1 M MgCl 2), 666 μl (3 M KCl), 40 μl (0.5 M EDTA) ל73 מיליליטר H 2 O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ"מ, 25% גליצרול, 1.5 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ KCl, 0.2 mM EDTA.
  3. מלח גבוה הצפת: כדי להכין של חיץ מלח גבוה (לשימוש בשלב 2.15) 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 25 מיליליטר גליצרול, 150 μl (1 M MgCl 2), 26.7 מיליליטר (3 M KCl), 40 μl (0.5M EDTA) ל47 מיליליטר H 2 O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ"מ, 25% גליצרול, 1.5 מ"מ MgCl 2, 800 מ"מ KCl, 0.2 mM EDTA.
  4. 10% דטרגנט NP40: NP40 ל10 מיליליטר 90 מיליליטר H 2 O
  5. [+ NP40 (שלב 2.11), לחיץ מלח נמוך (שלב 2.15), וחיץ מלח גבוה (שלב 2.15) רק לפני השימוש מתווסף למאגר hypotonic] מעכבי פרוטאז ו phosphatase: הוסף 2.5 μl (1 M DTT) ו50 μl של מעכבי פרוטאז (100x) עד 5 מיליליטר של מאגר זה לריכוז סופי של 0.5 מ"מ DTT ומעכבי פרוטאז 1x. תערובת מניית 100x מעכבי פרוטאז כוללת:פלואוריד הנתרן (Ser / Thr, phosphatases חומצי), orthovanadate נתרן (Tyr, phosphatases אלקליין), β-glycerophosphate (phosphatases Ser / Thr), pyrophosphate נתרן (phosphatases Ser / Thr), Aprotinin (פרוטאזות Ser), Bestatin (אמינו-peptidases ), E64 (פרוטאזות ציסטאין), leupeptin (פרוטאזות Ser / Cys), EDTA (metalloproteases).

1.2 הכנת צלחות assay

  1. צלחת תיקון פתרון: כדי להכין 500 מיליליטר של תמיסה, להוסיף סודיום קרבונט 5.25 גרם ל500 מיליליטר H 2 O, ומערבב היטב ולהתאים את ה-pH ל 9.7 לריכוז סופי של M 0.1 סודיום קרבונט.
  2. צלחת חסימת פתרון: כדי להכין פולי מניית די / DC oligonucleotide, יחידת resuspend 1 (~ 50 מ"ג) של פולי די / DC ב 1 מיליליטר של 10 מ"מ טריס / HCl, pH 7.9 מכיל 1 mM EDTA לריכוז מניות של 50 מיקרוגרם / μl. המניה מדוללת ל1 מיקרוגרם / μl לפני השימוש.

1.3 מאגרים לשטוף ודילולי נוגדן

הערה: לשטוף חיץ Streptavidin הוא נהג לשטוף את הצלחות בין תוספות ולדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים.

  1. כדי להכין 1 ליטר של חיץ לשטוף Streptavidin, להוסיף 2.4 גרם טריס / HCl, 37.5 מיליליטר (4 M NaCl), 10 מיליליטר (BSA 10%), 5 מיליליטר (10% Tween-20), עד 1 ליטר מים מסוננים Millipore סטרילי , PH 7.18. חנות ב 4 ° C. ריכוזים סופיים: 20 מ"מ טריס / HCl, 150 mM NaCl, BSA 0.1% Tween-20 0.05%.

1.4 חיץ-DNA מחייבת

הערה: חיץ זה מאוחסן ב -20 ° C.

  1. כדי להכין 15 מיליליטר של חיץ מחייב DNA, להוסיף 180 μl (1 M HEPES, pH 7.9), 300 μl (3 M KCl), 12 μl (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 μl (1 M DTT), 3.0 מיליליטר (גליצרול 60%), 300 μl (50 מיקרוגרם / μl פולי די / DC) בדילול מלא עם H deionized / מזוקק 2 O (12 מיליליטר). ריכוזים סופיים: 12 HEPES מ"מ / pH 7.9, 60 מ"מ KCl, 0.4 mM EDTA, 0.5 מ"מ DTT, גליצרול 12%, 1 מיקרוגרם / μl פולי די / DC.

2. תרבית תאים ובידוד חלבון גרעיני

t "> הערה: ההכנה דורשת שעות על 3 גירוי של תאים יהיה תלויה בניסוי מספר התאים המשמשים עבור כל ניסוי ישתנה וכל הכרכים משקפים ניסוי טיפוסי באמצעות 3 x 10 7 תאים / נקודה התאם כרכים כדי להכיל... מספר התא למעשה השתמש בניסוי 6.

  1. כדי להכין חלבון גרעיני למבחנים מחייבים DNA, תאים אנושיים תרבות המבטאים Runx2 (אנדותל, אוסטאוסרקומה, תאי סרטן השד) בתקשורת המתאימה 6.
  2. טיפול בתאים subconfluent עם nocodazole (0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ל16 hr) לעצור את התאים בגבול מחזור תא G2 / M 6. בתנאים אלה, חלבון Runx2 הוא התייצב וה-DNA מחייב המקסימאלי מושגת. בדרך זו, חלבון גרעיני מספיק זמין עבור ניתן להשוות מבחני ומעכבים מרובים מאותה ההכנה.
  3. לכל שלב, מראש לקרר את צנטריפוגות כדי 4 מעלות צלזיוס ולהכין מאגרים ולצנן 20 דקות ב 4 ° C לפני קציר תא.
  4. תאי צ'יל (4 מעלות צלזיוס) ונהלי התנהגות על קרח.
  5. תאי צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות בצינור מסביב לתחתית 15 פוליפרופילן מיליליטר.
  6. לשטוף 1x עם PBS קר כקרח (Ca 2 + ו Mg 2 + חינם).
  7. שוב צנטריפוגה ולהשליך supernatant PBS.
  8. הוסף 500 μl של חיץ hypotonic ללא מעכבי פרוטאז, להיות זהיר, כדי resuspend התא גלולה לחלוטין.
  9. העבר את התוכן לצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf.
  10. מייד צנטריפוגות ב 5,500 סל"ד 5.5 דקות, לבטל את supernatant ולשמור על התא גלולה.
  11. Resuspend התא גלולה ב μl 500 של חיץ hypotonic המכיל NP40 0.5%. הוספת פרוטאז ומעכבי phosphatase ו0.5 מ"מ DTT (כמתואר בשלב 1.1.5).
  12. לאפשר המדגם לנוח על קרח למשך 30 דקות.
  13. צנטריפוגה ב 13,000 סל"ד 10 דקות.
  14. בטל supernatant (מכיל חלבוני cytosolic).
  15. Resuspend את הכדור הגרעיני ב60 μl כל אחד מסאל הנמוךחיץ לא (שלמעכבי פרוטאז ו0.5 מ"מ DTT נוספו מהצעד 1.1.5) וחיץ מלח גבוה (שלמעכבי פרוטאז ו0.5 מ"מ DTT נוספו מהצעד 1.1.5) עבור סכום כולל של 120 μl. הוסף 60 μl של חיץ מלח נמוך לגלולה ראשונה ו resuspend, לאחר מכן להוסיף 60 μl של חיץ מלח גבוה. מערבולת בגלולה כדי לסייע בresuspension.

הערה: שלב זה עוזר להיפטר מכמה מחלבוני קרום הגרעין ולהגדיר עבור שלב תמוגה: מלח נמוך הראשונה (גלולה resuspend, מערבולת), ולאחר מכן מלח גבוה (מערבולת) מייעל את הצעד הזה. שמור על תמצית על קרח למשך 30 דקות, עם vortexing אחרי הראשון 10 דקות.

  1. צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד במשך 15 דקות, לשמור את supernatant המכיל חלבון הגרעיני.
  2. למדוד את ריכוז חלבון (מנסה לשמור על דגימות ב2-5 מ"ג / מיליליטר), aliquot בכמויות מתאימות (10 μl / צינור) ולאחסן ב -80 ° C.

הערה: תשואה משוערת: 30 x 10 6 cells יניבו 5 מיקרוגרם / μl חלבון ב120 μl. 5 x 10 6 תאים יניבו 2.2 מיקרוגרם / μl חלבון ב40 μl.

3. הכנת הגדילים הכפול Oligonucleotide

  1. עיצוב oligonucleotides משלימה עם חצי אתרים תואמים בקצותיו. לRunx2 אלה הם: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-ביוטין (תחושה) ו5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-ביוטין (antisense).

הערה: ניסויי פיילוט קבעו כי שלושה אתרי קישור Runx2 וביוטין שכותרתו חד הסוף הניבו את התוצאות לשחזור ביותר.

  1. הכן את חיץ חישול 5x: הוסף 300 μl (1 M טריס-HCl, pH 7.6), 30 μl (1 M MgCl 2), 10 μl (1 M DTT) ל260 μl H 2 O (μl 600 הסופי).
  2. 200 pmol של כל olig חד גדיליםonucleotide (3 μl), להוסיף 12 μl של חיץ חישול 5x ו45 μl H 2 O עבור סכום כולל של 60 μl (200 pmol/60 μl).
  3. חום ב-C ° 95 ל5-10 דק בבלוק חימום.
  4. מגניב 65 מעלות צלזיוס לאט (על ידי הגדרת הטמפרטורה ל 65 מעלות צלזיוס, זה לוקח 15 דקות), ואז להתקרר לטמפרטורת חדר באיטיות על ידי כיבוי כוחו של בלוק החימום (או על ידי הצבת ב50 מיליליטר של המים 65 מעלות צלזיוס בכוס בקרח, זה לוקח 15-20 דק ').

4. הכנת צלחות 96 היטב

הערה: אל תשתמש בחלבוני חלב במאגרים לשטוף.

  1. תקן את הצלחת עם פתרון תיקון (M 0.1 סודיום קרבונט): להוסיף 300 μl / טוב.
  2. דגירה עבור שעה 2 על ידי נדנדה בטמפרטורת חדר (RT), או שלא מתנדנדים על 4 מעלות צלזיוס (O / N).
  3. לשטוף 3x צלחת עם חיץ לשטוף streptavidin (WB): להוסיף 300 μl / טוב בכל פעם.
  4. הוספת oligonucleotide שכותרתו ביוטין פעמיים תקועים (3 קונסנסוס אתרי קישור לכל נוקלאוטיד) במשך שעה 2 wה-i נדנדה (1.25 nmol / טוב; 100 μl / טובה).
  5. 3x לשטוף עם WB הקר: להוסיף 300 μl / טוב ולאחר מכן להפוך באופן מיידי את הצלחת לתוך כיור ולמחוק את הקצוות על מגבת נייר לאחר כל הוספה.

הערה: אל תשתמש בטיפי פיפטה כדי להסיר נוזל מהצלחות כמו זו עלולה לגרד avidin: ביוטין: מתחמי ה-DNA מהבארות. האם זה עבור כל הצעדים לשטוף לאחר מכן.

5. דגירה עם תמצית גרעינית

הערה: אין תחליף סלמון או DNA זרע הרינג לפולי מאגר חסימת di / DC. למנוע חסימת צלחות עם חלבוני חלב. שני סוכני חסימה אלה לגרום לערכי רקע גבוהים.

  1. דגירה עם גורם שעתוק ספציפי שהוכן מתמצית גרעינית (90 μl / טוב). הכן תערובת אב המכילה תמצית גרעינית (חלבון קושר DNA; 3-9 מיקרוגרם / טוב) + פולי די / DC (מיקרוגרם / μl 1 מ מיקרוגרם / מניית ul 50) ב1x-DNA מחייב חיץ. נפח נדרש כלמספר הכולל שלבארות הנדרשות (90 μl / טוב).
  2. כל מעכב פוטנציאלי, כגון ויטמין D3 (איור 2) או תרכובת CADD 5,221,975 (איור 3), או הדילול המתאים של שליטת הממס, כגון אתנול, הוא הוסיף בשלב זה.
  3. צלחת מניח על הנדנדה פלטפורמה, O / N ב 4 ° C.
  4. 3x לשטוף עם WB: להוסיף 300 μl / טוב

6. תוספת של נוגדן הראשוני

הערה: צריכים להיות מוכנים טריים דילולים נוגדן ראשוניים - האחסון אינו מומלץ.

  1. מדולל נוגדנים חד שבטיים Runx2 הספציפי (מיקרוגרם / μl מניות 1) 1/5, 000 בStreptavidin לשטוף חיץ. הכן מספיק לתוספת היטב בכל הצלחת 96 היטב (90 μl / טוב) בשלושה עותקים.
  2. דגירה עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
  3. 3x לשטוף עם WB; להוסיף 300 μl / טוב.

7. תוספת של נוגדנים משני

הערה: דילולים נוגדנים משני יכולים להיות stoאדום ב 4 ° C למשך הלילה במידת צורך ביום שלמחרת.

  1. מדולל נוגדנים מצומדות (7.1 מ"ג / מיליליטר מניות) F ab ספציפי זיקה מטוהרת-HRP ל1:1,400 בStreptavidin לשטוף חיץ: לשטוף חיץ מיליליטר antibody/5.0 3.5 μl. הכן מספיק לתוספת היטב בכל הצלחת 96 היטב (90 μl / טוב) בשלושה עותקים.
  2. דגירה במשך 30 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה.
  3. לשטוף 6x עם WB על ידי היפוך צלחת לכיור (300 μl / טוב).

8. HRP תשתית ופיתוח מוצרים

  1. הוסף 50 μl של מצע TMB לכל גם ישירות מבקבוק מניות.
  2. דגירה 10-20 דקות ב RT בחושך (להפסיק שיטת תגובה) או למדוד את הספיגה ישירות (ניטור רציף קינטית).

9. מדידת תגובה

  1. תפסיק שיטת תגובה: לתגובת ראייה תחנה, לבדוק לשינוי צבע ברור לכחולים ולהפסיק תגובה עם 50 חומצה גופרתית μl.
  2. למדוד הספיגה ב ננומטר 450 עםספקטרופוטומטר Biotrak השני צלחת גלויה הקורא (Biosciences Amersham; GE Healthcare Biosciences קורפ Piscataway ניו ג'רזי, ארה"ב) או מכשיר דומה.
  3. שיטה רציפה הקינטית ניטור: הוסף מצע לאחר השטיפה האחרונה ורק לפני הצבת בספקטרופוטומטר (לא לעצור את התגובה).
  4. למדוד הספיגה ב ננומטר 635 עם ספקטרופוטומטר Bio-Tek Synergy HT Multi-תגובת microplate הקורא (Bio-Tek מכשירים, Inc; Winooski, VT, ארה"ב) או מכשיר דומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת D-ELISA היא מאוד ספציפית לחלבון קושר DNA המיועד עוד, oligonucleotide פעמיים תקוע רצף ספציפי המכיל שלושה עותקים של אתר קישור Runx2 הקונצנזוס (ACACCA) משמש. הנוגדן הראשוני הכרה בגורם החלבון גם משפר את הספציפיות. הנוגדנים משני מכילים peroxidase חזרת קוולנטית צמודה (HRP) שממיר מצע ברור (tetramethyl benzidine) למוצר בצבע, כדי להקל על זיהוי (איור 1). מסיבות אלה, מספר פקדי רקע חשובים צריכים להיות כלולים בכל צלחת assay כדי להבטיח DNA הספציפי מחייב. אלה כוללים מדידת מוצר colorimetric מתגובת נוגדן HRP המשנית בבארות המכילות גם (1) אין חלבון גרעיני, (2) אין נוגדן ראשוני, או (3) IgG עכבר שאינו ספציפי, במקום נוגדן חד שבטי הספציפי. במדידות השגרתיות שלנו, שולט ללא חלבון מופחתים מחלבון המסויםnd הביע כמוצר תגובה נטו. יתר על כן, כאשר עיצוב בסיוע מחשב בסמים (CADD) משמש לגילוי תרכובות והתרופות נבחנות במבחנים מחייבים DNA, ההשפעה של הממס המשמשת לsolubilize התרכובות צריכה להיקבע בבארות נפרדות. בדרך כלל, הקרנת סמים תדרוש את השימוש במים, אתנול, או sulfoxide דימתיל לsolubilize תרכובות. כל אחד מממסים אלה נבדק בנפרד ובריכוזים המתאימים. מסכי סמים אחדים זיהו תרכובות שיש לו השפעה מועטת על ה-DNA מחייב, כפי שמוצג ליגנד קולטן ויטמין D, 1α ,25-OH ויטמין D3 (איור 2). תרכובת זו לא לעכב DNA מחייב גם בריכוזים גבוהים יותר (ל100 מיקרומטר 100 ננומטר). מסכי סמים אחרים זוהו תרכובות המעכבות חלבון: DNA מחייב (איור 3). בהתבסס על ניתוחים של מדידות הקינטית 7, הגדלת הכמויות של מעכב CADD5221975 הביאו, עקומה תלוית מינון sigmoidal עיכוב, Wה-i מעכבת ריכוזים מעל 10 -3 M ביעילות עיכוב DNA המחייב, ואילו ריכוזים מתחת 10 -11 M הראו עיכוב מעט מאוד. EC 50 (הריכוז שבו מעכב גרם לירידה 50% בכריכה של Runx2 ל-DNA) היה 10 ננומטר למתחם זה. הניתוחים הסטטיסטיים עבור assay זה כבר פורסמו בעבר 6 ו, לפשטות, רק אחד גם בסדרה שלושה עותקים של בארותיו מוצגים איורים נציג 2 ו -3.

איור 1
איור 1. תרשים זרימה של פרוטוקול D-ELISA. (א) לבודד את החלבונים גרעיניים מתאי יונקים. תאי גידול הם מופרדים על ידי תמוגה חומרי ניקוי ושיטות מלח גבוהות כדי לחלץ חלבונים הדוקים קשורים עם ה-DNA. (ב) הכין דoligonucleotide ouble תקוע. ACACCAA אתר הקישור Runx2 בשלושה עותקים מוכנים עם תג ביוטין בסוף 3'-. (C) הכן את צלחות 96 היטב. צלחות שהושגו עם ציפוי avidin, אבל חייבת להיות קבוע עם pH הגבוה לפני הוספת oligonucleotides יוטין, שכותרת. (ד ') דגירה תמציות גרעיניות עם ה-DNA. צלחות חסומות עם poly-dI/dC אינו ספציפי לפני תוספת של חלבוני תמצית גרעיניים. (E) הוסף נוגדן ראשוני. הנוגדן שהוכן טרי לפני דגירה עם צלחת. (F) הוסף נוגדנים משני. נוגדנים משני ואחריו שטיפה נרחבת. (G) הוסף מצע HRP ולפתח את המוצר. מוצר colorimetric גלוי על הצלחת. (H) מדוד את ספיגת המוצר בספקטרופוטומטר. הספיגה היא גם ננומטר 450 (קצות) או 635 ננומטר (ניטור רציף). Readout הרציף אופייני ב635 ננומטר (אני). מוצגים הם תגובה וba ספציפיותckground (לא חלבון) שולט בשלושה עותקים.

איור 2
איור 2. יש 1α ,25-OH ויטמין D3 השפעה מועטת על Runx2 DNA המחייבת. בדוגמא מייצגת זה, הוויטמין הפעיל מבחינה ביולוגית D3, ,25-OH ויטמין D3 1α, יש השפעה מועטת על ה-DNA Runx2 המחייב. תרכובות הוויטמין D3 אחרות, לעומת זאת, יש השפעה דרמטית על ה-DNA מחייבת 6.

איור 3
איור 3. עיכוב של ה-DNA המחייב ידי Runx2 המשוער:. תרופה פעילה ה-DNA בדוגמא מייצגת זה, מתחם שזוהה מתכנון תרופות בעזרת מחשב מסך (CADD) הציג עיכוב תלוי מינון של Runx2 DNA המחייב מננומטר 1 עד 100 מיקרומטר. עיכוב מחייב חושבה תוך שימוש בשיטות הוקמו 7והניב EC 50 (ריכוז המעכב שגרם לעיכוב 50% של ה-DNA המחייב) של 10 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מבחני ה-DNA מחייב משמשים למדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים כוללים משמרת electrophoretic ניידות (EMSA) 1 וimmuneprecipitation הכרומטין (שבב) מבוסס מבחני 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 כגון מבחני chemiluminescent 2. EMSA הוא שאינם כמותיים ומשתמש oligonucleotides radiolabeled (32 P). אלה הודגרו עם חלבונים גרעיניים ומתחמים מחייבים מופרדים על ג'ל agarose או polyacrylamide. בניגוד לכך, D-ELISA כמותית הוא מסוגל למדוד את האינטראקציה של Runx2 עם רצפי ה-DNA מחייבת המתאימים לאלמנטי אמרגן מוגדרים בגנים מטרת Runx2. השימוש בנוגדן אנטי Runx2 הגדיל את הספציפיות של assay ומבדיל assay זה מassay משמרת ג'ל המסורתי 5. בעוד D-ELISA הוא assay במבחנה ולא ניתן לסקור את תפוסת אמרגן בתאים חיים,וזה אפשרי עם מבחני שבב, הוא יכול לשמש מסך כמותית לתרכובות המעכבות את מתחמי ה-DNA מחייבת. מבחני אלה מוגבלים לאינטראקציה DNA מנתח ולא יכול לחזות אם אמרגן ספציפי מופעל או מודחק. גישות נוספות, כגון מבחני כתב האמרגן-לוציפראז, יש צורך להגדיר את פעילות תעתיק של גורם השעתוק הספציפי.

הפרוטוקול הכללי של שיטת D-ELISA המתואר כאן הותאם משיטה קודמת המשמשת למדידת Nfkappa-B הפעיל 8. פרוטוקול D-ELISA זה מספק שיטה למדידת כמותית חלבון: DNA מחייב שהוא רצף ספציפי ואינו כרוכים בשימוש בקרינה רדיואקטיבית. במידת צורך, מהירויות תגובה (מקסימום V) יכולות גם להיות מחושבים מניטור רציף הקינטית של תגובה וזו עשויה לספק אפליה נוספת של תרכובות מבחן 7.

Runx2 וcofactor שלהSS CBF נמצאו להיות מזוהה עם oligonucleotides יוטין, שכותרת 6, ובכך מאמת את הספציפיות של assay וגם מדגיש כי ניתן לזהות cofactors שעשוי לקשר עם גורמי שעתוק ה-DNA מחייבת ספציפיים. עם ניטור רציף הקינטית, דגירה יכולה להתארך וייתכן שיהיה צורך פחות חלבון גרעיני כדי לזהות שינויים ב-DNA המחייבים. לכן, ניטור הקינטית צפוי להיות רגיש יותר מהשיטות תגובת עצירה. יישום חשוב של שיטה הקינטית זה כולל הקרנה לתרופות המעכבות או להפעיל DNA גורם שעתוק מחייב 6.

בעיות אפשריות אחרות שעשויים להתעורר בביצוע של assay כוללות את נוכחותם של ערכי רקע גבוהים. ערכי רקע גבוהים יכולים להיות בגלל: (1) ריכוזים גבוהים משני נוגדנים, (2) חסימה לא מספיק, (3) השימוש בזרע DNA סלמון כחוסם, (4) עדר צעד חלבון חסימה או (5)נוגדנים ראשוניים או משניים עם סגוליות נמוכות. אם אלה הם נתקלו, כמה תרופות אפשריות, כולל: (1) אופטימיזציה של הריכוז של נוגדנים משני בלימודי טייס ושימוש בנפח נמוך יותר של נוגדנים לכל טוב, (2) חסימת הצלחת עם פתרון סודיום קרבונט בסיסי (3) באמצעות di / dC כמו DNA שאינו ספציפי ולא זרע סלמון, אשר עשוי להכיל יזמים עם גורמי שעתוק מחייב, או (4) שימוש בזוגות שונים של נוגדנים ראשוניים או משניים ממקורות שונים.

מצד השני, עוצמת אות נמוכה יכולה להיגרם על ידי (1) כמות נמוכה של חלבון המטרה של, (2) הריכוז של נוגדנים ראשוניים או משניים אינו אופטימלי, (3) באורכי גל עירור ו / או פליטה אינם אופטימליים, ו( 4) יש נוגדני זיקת עניים למצעים שלהם. כמה תרופות לבעיות אלו כוללות: (1) כחלק מפתרון הבעיות, אפשר להשתמש 30 μl חיץ מלח נמוך + 30 μl חיץ מלח גבוה אם פחות תאים הם לשוואגורם שעתוק מסוגל והגרעיני הוא מצויים בכמויות גבוהות. או אחד יכול להשתמש 90 μl חיץ נמוך מלח + 90 חיץ מלח μl נמוך אם יותר תאים זמינים. יותר תאים שימושיים כאשר הביטוי של הגורם הספציפי להיבדק הוא נמוך. (2) ייעל את הריכוז של נוגדן ראשוני כדי להגדיל את האות. (3) לפקח על המסננים במכשיר כדי לוודא שהם הציבו לעירור נכון ומקסימום פליטה למצע TMB; גם ניאון חלופי או מצעי chemiluminescent ניתן להשתמש. (4) אם הנוגדן הראשוני הוא של זיקה נמוכה, להאריך את משך הזמן של דגירה על הצלחת.

במונחים של גילוי תרופות, ELISA-DNA מחייבת Runx2 הנוכחי נעשה שימוש כדי לזהות משופר מחייב של חלבון ליעד ה-DNA שלו וזיהו תרכובות טבעיות (כגון ויטמין D3), כי הם מאפננים סלקטיבית של ה-DNA המחייב. חלק מתרכובות אלו מפגינות מנגנונים הלא תחרותיים של פעולה ולשנות את התפקוד ביולוגי עולה בקנה אחד עםהפרדיגמה עיכוב interfacial 9. עם הרזולוציה האחרונה של רצף הדנ"א הגנומי, יישומים נוספים יכולים לכלול גילוי של חלבונים חדשים באינטראקציה עם ה-DNA ללא קידוד ("זבל"), אשר מווסתת את הביטוי של אזורי קידוד 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

סיוע טכני והמכשור של מתקן Greenebaum המרכז לחקר סרטן Translational Core אוניברסיטת מרילנד, במיוחד בני הזוג. רינה לפידוס וMariola Sadowska, הם הכירו בהכרת תודה. העבודה אחראית לפיתוח של assay זה מומנה בחלקו על ידי NIH RO1CA108846, AHA GRNT2130014 גרנט-in-Aid, פרס הצטיינות VA לסוכנות הידיעות AP, ועל ידי האוניברסיטה של ​​כספי פיצויי סיגריות מרילנד (CRF) הניתן למרלן וסטיוארט מרכז לחקר סרטן Greenebaum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 78 גורמי שעתוק ויטמין D גילוי תרופות immunosorbent assay (ELISA) צמוד אנזים ה-DNA מחייבת גורם שעתוק הקרנת סמים נוגדן
כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T.,… More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter