Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Summary

Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Abstract

Viele DNA-Bindungsassays, wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), chemilumineszenten Assays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierte Assays und Multiwell-basierten Assays verwendet werden, um Transkriptionsfaktor-Aktivität zu messen. Allerdings sind diese Tests nicht-quantitative, fehlt die Spezifität, kann die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotide beinhalten und kann nicht für das Screening von Inhibitoren der DNA-Bindung anpassungsfähig sein. Auf der anderen Seite, unter Verwendung einer quantitativen DNA-bindende Enzyme-linked Immunosorbent Assay (D-ELISA-Test) zeigen wir, nukleäres Protein-Wechselwirkungen mit DNA unter Verwendung des RUNX2 Transkriptionsfaktor, der auf spezifische Assoziation mit Konsensus-DNA-Bindungssequenzen auf Biotin vorliegenden hängen markierte Oligonukleotide. Vorbereitung der Zellen, die Gewinnung von Kernprotein, und das Design der Doppelstrang-Oligonukleotiden beschrieben. Avidin-beschichteten 96-well Platten mit alkalischen Puffer fixiert und mit Kernproteinen in Nukleotid-Blockierungspuffer inkubiert. Folldurch ausgiebiges Waschen der Platten spezifischen primären Antikörper und sekundären Antikörper-Inkubationen werden durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-Substrat und der Entwicklung der Farbreaktion verfolgt. Stop-Reaktionsmodus oder kontinuierliche Überwachung kinetische wurden verwendet, um quantitativ zu messen Protein-Wechselwirkung mit DNA. Wir diskutieren entsprechende Spezifität Kontrollen, einschließlich der Behandlung mit nicht-spezifischen IgG-oder Protein oder ohne primären Antikörper. Anwendungen des Assays sind beschrieben, einschließlich ihrer Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening und repräsentativen positiven und negativen Ergebnisse diskutiert.

Introduction

DNA-Bindungs-Assays sind nützlich bei der Messung der Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA zu interagieren. Assays für die DNA-Bindung sind elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA), die auf radioaktiv markierten Oligonukleotide ¹ oder ² Chemilumineszenzassays abhängen. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays ³ sowie Assays, die ^96-Well-4 wurden auch beschrieben. Jedoch ist die EMSA eine nicht-quantitativer Assay, der die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotiden erfordert. Als Kernproteine ​​assoziieren mit den spezifischen Nukleotid-Promotor-Sequenzen, sind Bindungskomplexe auf Polyacrylamid-Gelen verzögert und die spezifische Transkriptionsfaktor kann mit einem Antikörper "Supershift" validiert werden. Wir haben eine quantitative DNA-Bindungsassay unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Format (D-ELISA), die in der Lage, die Interaktion von RUNX2 mit DNA-Bindungssequenzen entsprechend definierten Promotorelemente zu messen, ist entwickelt in RUNX2 Zielgene. Verwendung eines Anti-Antikörpers enthält RUNX2 Spezifität des Assays und der Mangel an Radiomarkierung zeichnen diesen Assay vom herkömmlichen ^{Gel-Shift-Assay-5.} Nachweis von Bindungskomplexen ist mit der Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine HRP-Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) in ein gefärbtes Produkt spektrophotometrische Analyse umwandelt möglich. Der Test hier berichtet die Verwendung von mutierten DNA-Oligonukleotide als Kontrolle übernehmen und kann zum Nachweis von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren der DNA-Bindung verwendet werden. Das Screening von neuen Anti-Tumor-Verbindungen ist ebenfalls mit diesem Assay möglich.

Protocol

Mehrere Schritte werden vor der Zeit durchgeführt und mehrere Reagenzien hergestellt und gelagert, bevor das Verfahren: (1) Zellkultur und Proteinisolierung, (2) Herstellung von Oligonukleotid (3) Herstellung von 96-Well-Platten (4) Kernextrakt Inkubation über Nacht. Vorgehensweise benötigt 2 Tagen wegen der Inkubation über Nacht von Kernprotein mit DNA-Oligonukleotiden.

1. Herstellung von Puffern

1.1 Kernproteinisolierung

1. Hypotonischen Puffer: Zu 100 ml hypotonischen Puffer vorbereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl _2), 333 ul (3 M KCl) auf 98,3 ml H ₂ O. Endkonzentrationen: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl _2, 10 mM KCl. Für Hypotone Puffer + NP40 (für den Einsatz in Schritt 2.11): 0,5 ml (10% NP40) auf 9,5 ml hypotonischen Puffer für die letzten 0,5% NP40.
2. Niedrigsalzpuffer: Zu 100 ml Niedrigsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 &mgr; l (1 M MgCl _2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 73 ml H ₂ O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
3. Hochsalzpuffer: Zu 100 ml Hochsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 ul (1 M MgCl _2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 47 ml H ₂ O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl _2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
4. 10% NP40-Detergens: 10 ml NP40 bis 90 ml H ₂ O
5. Protease-und Phosphatase-Inhibitoren [zum hypotonischen Puffer + NP40 (Schritt 2.11), um Niedrigsalzpuffer (Schritt 2.15) und der hohen Salzpuffer (Schritt 2.15) unmittelbar vor der Verwendung]: In 2,5 ul (1 M DTT) und 50 ul Proteaseinhibitoren (100x), 5 ml jedes Puffers für Endkonzentration von 0,5 mM DTT und 1x Proteaseinhibitoren. Der Protease-Inhibitor 100x Stock Mischung beinhaltet:Natriumfluorid (Ser / Thr, saure Phosphatasen), Natriumorthovanadat (Tyr, alkalische Phosphatasen), β-Glycerophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Natriumpyrophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Aprotinin (Ser Proteasen), Bestatin (Amino-Peptidasen ), E64 (Cystein-Proteasen), Leupeptin (Ser / Cys Proteasen), EDTA (Metalloproteasen).

1.2 Vorbereitung der Testplatten

1. Plattenbefestigungslösung: So bereiten Sie 500 ml Lösung werden 5,25 g Natriumcarbonat in 500 ml H ₂ O, gut mischen und pH-Wert auf 9,7 für eine endgültige Konzentration von 0,1 M Natriumcarbonat.
2. Teller Blockierlösung: Zur Herstellung von Poly Lager dI / dC Oligonukleotid, resuspendieren 1 Unit (~ 50 mg) von Poly dI / dC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, der 1 mM EDTA für eine Stammkonzentration von 50 ug / ul. Stock ist bis 1 ug / ul vor der Verwendung verdünnt.

1.3 Waschpuffer und Antikörperverdünnungen

HINWEIS: Streptavidin Waschpuffer verwendet werden, um Platten zwischen den Zugaben zu waschen und auf Primär-und Sekundärantikörper verdünnen.

1. Um 1 l Streptavidin Waschpuffer, mit 2.4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), auf 1 Liter Millipore-Wasser sterilfiltriert , pH 7,18. Lagern bei 4 ° C Endkonzentration: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA-Bindungspuffer

HINWEIS: Dieser Puffer wird bei -20 ° C gelagert

1. Die Bereitstellung von DNA 15 ml Bindungspuffer, fügen 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 &mgr; l (1 M DTT), 3,0 ml (60% Glycerin), 300 &mgr; l (50 &mgr; g / &mgr; l poly dI / dC) mit entionisiertem / destilliertem H ₂ O (12 ml) verdünnt. Endkonzentrationen: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% Glycerin, 1 ug / ul Poly dI / dC.

2. Zellkultur und Kernproteinisolierung

t "> Hinweis: Die Herstellung erfordert etwa 3 h Stimulation von Zellen auf Experiment hängen die Anzahl der Zellen für jedes Experiment variieren und alle Volumen reflektieren ein typisches Experiment unter Verwendung von 3 × 10 ⁷ Zellen / Punkt einstellen Volumen unterzubringen... die Anzahl der Zellen tatsächlich in dem Experiment ⁶ verwendet.

1. Um Kernprotein für die DNA-Bindungsassays, die Kultur, die menschliche Zellen RUNX2 (Endothel-, Osteosarkom, Brustkrebs-Zellen) in geeigneten Medien ⁶ exprimieren.
2. Gönnen subkonfluente Zellen mit Nocodazol (0,2 ug / ml für 16 Stunden) zu den Zellen in der G2 / M Zellzyklus Grenze ⁶ verhaften. Unter diesen Bedingungen wird das Protein stabilisiert RUNX2 und maximale DNA-Bindung erreicht wird. Auf diese Weise ist genug Kernprotein für mehrere Tests und Inhibitoren können aus dem gleichen Präparat verglichen werden, zur Verfügung.
3. Für jeden Schritt, Pre-kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C und bereiten Puffer und Chill 20 min bei 4 ° C vor der Zellernte.
4. Chill-Zellen (4 ° C) und die Durchführung Verfahren auf Eis.
5. Zentrifuge Zellen bei 1000 rpm für 5 min in einem 15 ml Polypropylen-Rundrohr.
6. Wash 1x mit eiskaltem PBS (Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +-frei).}
7. Zentrifuge wieder und entsorgen PBS Stand.
8. Add 500 ul hypotonischen Puffer ohne Protease-Inhibitoren, wobei darauf geachtet, das Zellpellet vollständig zu suspendieren.
9. Übertragen Inhalt in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
10. Unmittelbar bei 5.500 rpm für 5,5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und halten das Zellpellet.
11. Zellpellet in 500 ul hypotonischen Puffer, der 0,5% NP40. Hinzufügen Protease-und Phosphatase-Inhibitoren und 0,5 mM DTT (wie in Schritt 1.1.5 beschrieben).
12. Die Probe wird auf Eis für 30 Minuten ruhen.
13. Zentrifuge bei 13.000 rpm für 10 min.
14. Entsorgen Sie den Überstand (enthält die cytosolische Proteine).
15. Resuspendieren Sie das Kernpellet in jeweils geringer sal 60 ult-Puffer (um die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) und Hochsalz-Puffer (auf die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) für eine Gesamtmenge von 120 ul. In 60 ul Niedrigsalzpuffer zum Pellet ersten und resuspendieren, dann fügen Sie 60 ul Hochsalzpuffer. Mischen Sie den Pellet an der Aufwirbelung unterstützen.

HINWEIS: Dieser Schritt hilft loszuwerden einige der Kernmembran-Proteine ​​und bis zur Lyse Schritt gesetzt: niedrige Salz ersten (Pellet erneut, Vortex), so hohe Salz (Vortex) optimiert diesen Schritt. Halten Extrakt auf Eis für 30 min, unter Verwirbelung nach den ersten 10 min.

16. Zentrifuge bei 12.000 rpm für 15 min; halten den Überstand mit dem Kernprotein.
17. Messen Proteinkonzentration (versuchen, um Proben bei 2-5 mg / ml zu halten), aliquoten in entsprechenden Mengen (10 ul / Röhrchen) und bei -80 ° C

HINWEIS: Geschätzte Ausbeute: 30 x 10 ⁶ cells 5 ug / ul Protein in 120 ul ergeben. 5 x 10 ⁶ Zellen 2,2 ug / ul Protein in 40 ul ergeben.

3. Vorbereitung der Doppel Oligonukleotid

1. Entwerfen komplementäre Oligonukleotide mit kompatiblen Halbstellen an den Enden. Für RUNX2 diese sind: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-Biotin (Sinn) und 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-Biotin (Antisense).

HINWEIS: Pilotversuche festgestellt, dass drei RUNX2 Bindungsstellen und Single-Ende Biotin ergab die meisten reproduzierbare Ergebnisse.

2. 5x herzustellen Annealing-Puffer: In 300 &mgr; l (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 &mgr; l (1 M MgCl _2), 10 &mgr; l (1 M DTT) und 260 &mgr; l H ₂ O (600 &mgr; l final).
3. Zu 200 pmol von jedem Einzelstrang-oligonucleotide (3 ul), fügen Sie 12 ul 5x Annealing-Puffer und 45 ul H ₂ O für insgesamt 60 ul (200 pmol/60 ul).
4. Hitze bei 95 ° C für 5-10 min in einem Heizblock.
5. Abkühlen auf 65 ° C langsam (durch Einstellen der Temperatur auf 65 ° C, dauert es 15 min), dann auf Raumtemperatur langsam durch Abschalten der Leistung der Wärmeblock (oder indem Sie in 50 ml 65 ° C Wasser in einem Becherglas auf Eis, dies dauert 15-20 min).

4. Herstellung von 96-Well-Platten

HINWEIS: Verwenden Sie keine Milchproteine ​​in den Waschpuffer.

1. Fix Platte mit Befestigungslösung (0,1 M Natriumcarbonat): add 300 ul /.
2. Inkubation für 2 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur (RT) oder kein Schütteln bei 4 ° C (O / N).
3. Waschen Platte 3x mit Streptavidin Waschpuffer (WB): add 300 ul / jeder Zeit.
4. Hinzufügen Biotin-markierten doppelsträngigen Oligonukleotids (3 Konsensus-Bindungsstellen pro Nukleotid) für 2 h with Schaukel (1,25 nmol / gut; 100 ul / Vertiefung).
5. 3x Waschen mit kaltem WB: add 300 ul / und dann sofort die Platte umzukehren in eine Senke und tupfen Sie die Kanten auf einem Papiertuch nach jeder Zugabe.

HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipettenspitzen, um Flüssigkeit von den Platten zu entfernen, da dies zu kratzen Avidin: Biotin: DNA-Komplexe aus den Vertiefungen. Tun Sie dies für alle nachfolgenden Waschschritte.

5. Inkubation mit Kernextrakt

HINWEIS: Sie ersetzen nicht Lachs oder Hering-Sperma-DNA für die Poly dI / DC-Blockpuffer. Vermeiden Sperrplatten mit Milchproteinen. Beide Blockierungsmittel führen zu einer hohen Hintergrundwerten.

1. Inkubation mit spezifischen Transkriptionsfaktor aus der Kernextrakt (90 ul /) erstellt. Erstellen Sie einen Master-Mix mit Kernextrakt (DNA-bindendes Protein, 3-9 g / gut) + Poly dI / dC (1 ug / ul von einer 50 ug / ul Lager) in 1x DNA-Bindungspuffer. Volumen wird als die Gesamtzahl der benötigtenBrunnen erforderlich (90 ul / Vertiefung).
2. Einem potentiellen Inhibitor, wie z. B. Vitamin D3 (Fig. 2) oder CADD Verbindung 5221975 (Fig. 3) oder der geeigneten Verdünnung der Lösungsmittelkontrolle, wie Ethanol, wird in diesem Schritt zugegeben.
3. Legen Sie die Platte auf Schaukel Plattform, O / N bei 4 ° C
4. 3x Waschen mit WB: add 300 ul /

6. Zugabe des primären Antikörpers

HINWEIS: Primärantikörperverdünnungen sollte frisch zubereitet werden - Speicher wird nicht empfohlen.

1. Verdünnen RUNX2-spezifische monoklonale Antikörper (Lager 1 ug / ul) 5.1, 000 in Streptavidin-Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug.
2. Inkubation für 1 h bei RT auf einer Schwingplattform.
3. 3x Waschen mit WB, fügen Sie 300 ul /.

7. Zugabe von sekundärem Antikörper

HINWEIS: Sekundärantikörperverdünnungen können sto seinrot bei 4 ° C über Nacht bei Bedarf am nächsten Tag.

1. Verdünnen F _{ab-spezifische} Affinität gereinigt HRP-konjugierte Antikörper (7,1 mg / ml Stamm) bis 1:1,400 in Streptavidin-Waschpuffer: 3,5 ul antibody/5.0 ml Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug.
2. Inkubation 30 min bei RT auf einer Schwingplattform.
3. Wash 6x mit WB durch Umdrehen der Platte in Enke (300 ul / Vertiefung).

8. HRP-Substrat-und Produktentwicklung

1. In 50 ul TMB-Substrat pro Vertiefung direkt ab Lager Flasche.
2. Inkubation 10-20 min bei RT im Dunkeln (Stop-Reaktion-Methode) oder die Messung der Extinktion direkt (kontinuierliche Bewegungsüberwachung).

9. Reaktionsmessung

1. Stoppen Reaktionsverfahren: Für die visuelle Stopp-Reaktion, überprüfen Sie Farbwechsel von blau und klar zu stoppen Reaktion mit 50 ul Schwefelsäure.
2. Messung der Extinktion bei 450 nm mitdie Biotrak II Visible Plattenleser Spektralphotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) oder ein ähnliches Instrument.
3. Kontinuierliche Überwachung kinetische Methode: Fügen Substrat nach dem letzten Waschen und kurz vor der Platzierung im Spektralphotometer (nicht die Reaktion zu stoppen).
4. Extinktion bei 635 nm mit dem Bio-Tek Synergy HT Multi-Reaktionsmikroplatten-Reader Spektralphotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) oder ein ähnliches Instrument.

Representative Results

Die D-ELISA-Verfahren ist hochspezifisch für die bezeichnete DNA-Bindungsprotein, solange eine sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid drei Kopien des Konsensus RUNX2 Bindungsstelle (ACACCA) enthält, verwendet wird. Der primäre Antikörper, der das Protein Faktor erhöht auch die Spezifität. Der sekundäre Antikörper enthält kovalent gebundenen Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine klare Substrat (Tetramethylbenzidin) zu einem farbigen Produkt für einfache Erkennung (Abbildung 1) umwandelt. Aus diesen Gründen müssen einige wichtige Hintergrundkontrollen in jeder Testplatte eingeschlossen werden, um spezifische DNA-Bindung sicherzustellen. Diese umfassen die Messung des kolorimetrischen Produkts aus dem sekundären Antikörper HRP-Reaktion in Vertiefungen, die entweder (1) keine Kernprotein, (2) keine primären Antikörper, oder (3) einen nicht-spezifischen Maus-IgG anstelle des spezifischen monoklonalen Antikörpers. In unserem Routinemessungen werden die nicht-Protein-Steuerelemente aus dem spezifischen Protein ein subtrahiertnd ausgedrückt als Nettoreaktionsprodukt. Wenn ferner computergestützte Wirkstoffdesign (CADD) wird verwendet, um Verbindungen zu entdecken und die Medikamente in der DNA-Bindungsassays getestet, die Wirkung des Lösungsmittels verwendet werden, um die Verbindungen zu solubilisieren, müssen in getrennten Vertiefungen bestimmt werden. Typischerweise werden Wirkstoff-Screening die Verwendung von Wasser, Ethanol oder Dimethylsulfoxid zu Verbindungen Löslichmachen erforderlich. Jedes dieser Lösungsmittel getrennt und in den entsprechenden Konzentrationen getestet. Einige Arzneimittel Bildschirme identifiziert Verbindungen, die eine geringe Wirkung auf die DNA-Bindung haben, wie für die Vitamin-D-Rezeptor-Liganden gezeigt, 1α ,25-OH-Vitamin D3 (Abb. 2). Diese Verbindung nicht hemmen die DNA-Bindung auch bei höheren Konzentrationen (100 nM bis 100 uM). Andere Medikamentenverbindungen, die Bildschirme erkannt Proteins hemmen: DNA-Bindung (Fig. 3). Basierend auf der Analyse der kinetischen Messungen ^7, Erhöhung der Mengen des Inhibitors CADD5221975 führte zu einer dosisabhängigen Hemmung sigmoidalen Kurve wit-Inhibitor-Konzentrationen über 10 ^-3 M effektiv Hemmung der DNA-Bindung, während die Konzentrationen unter 10 ^-11 M zeigte sehr wenig Hemmung. Die EC ₅₀ (Konzentration, bei der Inhibitor verursacht eine 50% ige Reduktion in der Bindung der DNA an RUNX2) betrug 10 nM für diese Verbindung. Die statistischen Analysen für diesen Assay wurden bereits veröffentlicht und ⁶ der Einfachheit halber wird nur eine Vertiefung einer dreifachen Reihe von Vertiefungen in repräsentativen Figuren 2 und 3 gezeigt.

Fig. 1 ist. Flussdiagramm des D-ELISA-Protokoll. (A) Isolieren nukleäre Proteine ​​aus Säugerzellen. Wachsende Zellen werden durch Reinigungsmittel Lyse und hohen Salz Methoden, um Proteine ​​eng mit DNA assoziiert extrahieren fraktioniert. (B) Bereiten double Oligonukleotid. Die Bindungsstelle RUNX2 ACACCAA in dreifacher Ausfertigung mit einem Biotin-Tag am 3'-Ende vorbereitet. (C) vorbereiten 96-Well-Platten. Platten werden mit Avidin Beschichtung erhalten, muss jedoch mit hohen pH-Wert vor Zugabe von Biotin-markierten Oligonukleotide fixiert werden. (D) Inkubieren Kernextrakten mit der DNA. Die Platten werden mit nicht-spezifischen poly-dI/dC vor der Zugabe von Kernextrakt Proteine ​​blockiert. (E) hinzufügen primären Antikörper. Der Antikörper wird frisch zubereitet vor der Inkubation mit Platte. (F) Sekundäranti hinzufügen. Sekundäre Antikörper wird durch umfangreiche Waschen. (G) hinzufügen HRP-Substrat und die Entwicklung des Produkts. Farbmetrische Produkt ist sichtbar auf der Platte. (H) Messen Sie die Extinktion Produkt auf einem Spektrophotometer. Die Absorption ist entweder 450 nm (Stop-Reaktion) oder 635 nm (Dauerüberwachung). (I) Typische kontinuierliche Auslesen bei 635 nm auf. Gezeigt werden spezifische Reaktion und background (kein Protein) steuert in dreifacher Ausfertigung.

2. 1α ,25-OH Vitamin D3 hat wenig Einfluss auf die DNA-Bindung RUNX2. In diesem repräsentativen Beispiel, das biologisch aktive Vitamin D3, 1α ,25-OH-Vitamin D3, hat wenig Einfluss auf die DNA-Bindung RUNX2. Andere Vitamin-D3-Verbindungen haben jedoch dramatische Wirkungen auf die DNA-Bindung ^6.

3. Inhibierung der DNA-Bindung durch putative RUNX2:. DNA aktive Arzneimittel in diesem repräsentativen Beispiel eine Verbindung, die von einem computergestützten Wirkstoffdesign (CADD) Bild identifiziert wurde, zeigte eine dosisabhängige Hemmung der RUNX2 DNA-Bindung von 1 nM bis 100 uM. Binding-Hemmung wurde berechnet unter Verwendung erprobter Methoden ⁷und ergab einen EC ₅₀ (Konzentration des Inhibitors, die zu einer 50% Inhibierung der DNA-Bindung resultiert) von 10 nM.

Discussion

DNA-Bindungstests verwendet werden, um die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA in Wechselwirkung zu messen. Assays für die DNA-Bindung umfassen elektrophoretische Mobilitätsverschiebung (EMSA) ¹ und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays ³ sowie Assays, die ^96-Well-4 wie Chemilumineszenzassays ^2. Die EMSA ist nicht quantitative und verwendet radioaktiv markierte ⁽³² P) Oligonukleotiden. Diese sind mit Kernproteinen inkubiert und Bindungskomplexe werden auf Agarose-oder Polyacrylamid-Gelen getrennt. Im Gegensatz dazu ist die quantitative D-ELISA in der Lage, die Interaktion von RUNX2 mit DNA-Bindungssequenzen entsprechend definierten Promotorelemente in RUNX2 Zielgene zu messen. Die Verwendung eines Anti-Antikörpers RUNX2 erhöht die Spezifität des Assays und unterscheidet diesen Assay vom herkömmlichen ^{Gel-Shift-Assay-5.} Während die D-ELISA ist ein in vitro-Assay kann nicht Promotor Belegung Erhebung in lebenden Zellen,welche mit Chip-Tests möglich ist, kann es verwendet werden, um quantitativ Screening nach Verbindungen, die die DNA-Bindungskomplexe zu hemmen. Diese Assays sind DNA-Interaktion Analysen beschränkt und kann nicht vorhersagen, ob ein spezifischer Promotor aktiviert oder unterdrückt. Weitere Ansätze, wie Promotor-Luciferase-Reporter-Assays notwendig sind, um die Transkriptionsaktivität des spezifischen Transkriptionsfaktor definieren.

Das allgemeine Protokoll der hier beschriebenen D-ELISA-Methode wurde von einem früheren Verfahren verwendet werden, um aktiv Nfkappa-B ⁸ messen angepasst. Diese D-ELISA-Protokoll stellt ein Verfahren zur quantitativen Messung Protein: DNA-Bindung, die Sequenz-spezifisch und die Verwendung von Radioaktivität nicht um. Falls erforderlich, können Reaktionsgeschwindigkeiten (V _max) auch von der kontinuierlichen kinetischen Verfolgung der Reaktion berechnet werden, und dies kann zusätzliche Unterscheidung von Testverbindungen ⁷ bereitzustellen.

RUNX2 und seine Co-FaktorCBF-ß wurden als mit den Biotin-markierten Oligonukleotide ⁶ zugeordnet werden, wodurch die Validierung der Spezifität des Assays und auch betont, dass es möglich ist, Cofaktoren, die mit spezifischen DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren verknüpfen könnten. Bei kontinuierlicher Überwachung kinetische kann Inkubation verlängert und weniger Kernprotein erforderlich sein, um Änderungen in der DNA-Bindung nachzuweisen. Daher wird erwartet, kinetische Überwachung empfindlicher als Stoppreaktion Methoden. Eine wichtige Anwendung dieser kinetischen Verfahren umfasst Screening für Wirkstoffe, die Transkriptionsfaktor-DNA-Bindung ⁶ inhibieren oder aktivieren.

Andere mögliche Probleme, die bei der Durchführung des Tests auftreten können sind das Vorhandensein von hohen Hintergrundwerten. (1) hohe Konzentrationen sekundärer Antikörper, (2) nicht ausreichend blockiert, (3) die Verwendung von Lachssperma-DNA als Blocker, (4) das Fehlen einer blockierenden Protein oder Schritt (5): hohe Hintergrundwerte könnten darauf zurückzuführen seinprimären oder sekundären Antikörper mit geringen Spezifität. Wenn diese auftreten, sind mehrere Mittel möglich, einschließlich: (1) Optimierung der Konzentration des sekundären Antikörpers in Pilotstudien und mit geringeren Volumen an Antikörper pro Well, (2) die Blockierung der Platte mit einem Grund Natriumcarbonat-Lösung (3) mit dI / DC als nicht-spezifische DNA anstatt Lachssperma, die Promotoren mit Transkriptionsbindungselementen, oder (4) mit verschiedenen Paaren von primären oder sekundären Antikörper aus verschiedenen Quellen enthalten können.

Auf der anderen Seite könnte eine geringe Signalstärke von (1) geringe Menge an Zielprotein, (2) die Konzentrationen der primären oder sekundären Antikörpern nicht optimal sind, (3) Anregung und / oder Emissionswellenlängen nicht optimal sind, und (verursacht werden 4)-Antikörper haben eine schlechte Affinität für ihre Substrate. Mehrere Heilmittel für diese Probleme sind: (1) Im Rahmen der Fehlersuche, kann man 30 ul Niedrigsalzpuffer + 30 ul Hochsalzpuffer zu verwenden, wenn weniger Zellen sind freiLage und die Kerntranskriptionsfaktor ist in großen Mengen vorhanden ist. Oder ein 90 ul nutzen könnten Niedrigsalzpuffer + 90 ul Niedrigsalzpuffer, wenn mehr Zellen zur Verfügung stehen. Mehrere Zellen sind nützlich, wenn die Expression des bestimmten Faktor zu prüfenden niedrig ist. (2) Optimierung der Konzentration des primären Antikörpers, um das Signal zu erhöhen. (3) Überwachung der Filter auf dem Instrument, um sicherzustellen, dass sie für die korrekte Anregungs-und Emissionsmaxima für die TMB-Substrat gesetzt, alternative fluoreszierende oder chemilumineszierende Substrate können ebenfalls verwendet werden. (4) Wenn der primäre Antikörper ist von geringer Affinität, erhöhen Sie die Zeit der Inkubation auf der Platte.

Hinsichtlich der Wirkstoffforschung, der Strom RUNX2 DNA-Bindungs-ELISA wurde verwendet, um zu erfassen verstärkte Bindung eines Proteins an seine Ziel-DNA und bestimmte natürliche Verbindungen (wie z. B. Vitamin D3), die eine selektive Modulatoren der DNA-Bindung sind. Einige dieser Verbindungen zeigen eine nicht-kompetitiven Wirkmechanismen und biologische Funktion zu ändern, die miteine Grenzflächen Hemmung Paradigma ^9. Mit dem jüngsten Beschluss der genomischen DNA-Sequenzierung könnten weitere Anwendungen Entdeckung neuer Proteine ​​interagieren mit nicht-kodierenden ("Junk") DNA, die die Expression der kodierenden Regionen ¹⁰ regelt enthalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment