En kvantitativ analyse til at studere Protein: DNA interaktioner, Discover transskriptionsregulatorer af genekspression, og identificere nye anti-tumor Agents

Summary

Vi har udviklet en kvantitativ DNA-bindende ELISA-assay til måling af transkriptionsfaktor interaktion med DNA. Høj specificitet for RUNX2 protein blev opnået med en konsensus DNA-genkendelse oligonukleotid og specifikt monoklonalt antistof. Kolorimetrisk detektion med et enzym-koblet antistof substrat Reaktionen blev overvåget i realtid.

Abstract

Mange DNA-bindende assays, såsom elektroforetisk mobilitet shift assays (EMSA), kemiluminescerende assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-baserede assays og multibrønds assays anvendes til at måle transkriptionsfaktoraktivitet. Men disse assays er nonquantitative mangler specificitet, kan involvere anvendelse af radioaktivt mærkede oligonucleotider og kan ikke tilpasses til screening af inhibitorer af DNA-bindende. På den anden side, ved hjælp af en kvantitativ DNA-bindende enzymkoblet immunosorbent assay (D-ELISA) assay demonstrerer vi nukleare interaktioner protein med DNA ved hjælp af RUNX2 transkriptionsfaktor, der afhænger af specifikke associering med konsensus DNA-bindende sekvenser til stede på biotin- mærkede oligonukleotider. Fremstilling af celler, ekstraktion af kerneprotein og design af dobbeltstrengede oligonucleotider beskrevet. Avidin-coatede 96-brønds plader er fastgjort med alkalisk buffer og inkuberet med kerneproteiner i nukleotid blokeringsbuffer. Follgrund omfattende vask af pladerne, bestemt primært antistof og sekundære antistofinkubationer efterfølges af tilsætning af peberrodsperoxidase substrat og udvikling af den kolorimetriske reaktion. Stop reaktionen mode eller kontinuerlig kinetisk kontrol blev anvendt til kvantitativt at måle protein-interaktion med DNA. Vi drøfte passende specificitet kontroller, herunder behandling med ikke-specifik IgG eller uden protein eller primære antistof. Anvendelser af assayet beskrevet herunder anvendelighed i lægemiddel-screening, og de repræsentative positive og negative resultater diskuteres.

Introduction

DNA-bindingsassays har anvendelighed til at måle evnen af ​​transkriptionsfaktorer til at interagere med DNA. Assays for DNA bindende indbefatter elektroforetiske mobilitet shift assays (EMSA), som er afhængige af radioaktivt mærkede oligonukleotider ¹ eller chemiluminescens assays ^2. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserede assays ³ samt analyser, der anvender 96-brønds formater ⁴ er også blevet beskrevet. Men EMSA er en ikke-kvantitativ analyse, der kræver brug af radiomærkede oligonukleotider. Når nukleare proteiner forbinder med de specifikke nukleotid promotorsekvenserne, bindende komplekser er retarderede på polyacrylamidgeler og den specifikke transskription faktor kan valideres med et antistof "supershift". Vi har udviklet en kvantitativ DNA-bindingsassay under anvendelse af et enzymbundet immunsorbentassay format (D-ELISA), som er i stand til at måle interaktionen af ​​RUNX2 med DNA-bindende sekvenser svarende til definerede promotorelementer in RUNX2 målgener. Anvendelse af et anti-RUNX2 antistof giver specificitet til assayet og den manglende radiomærke skelne dette assay fra den traditionelle gel shift assay ^5. Påvisning af bindende komplekser er muligt med anvendelse af et sekundært antistof koblet til peberrodsperoxidase (HRP), som omdanner et HRP-substrat, tetramethylbenzidin (TMB) til et farvet produkt til spektrofotometrisk analyse. Den her rapporterede assay kan inkorporere anvendelsen af ​​muterede DNA-oligonukleotider som kontroller og kan anvendes til påvisning af konkurrerende eller ikke-konkurrerende inhibitorer af DNA bindende. Screeningen af ​​hidtil ukendte anti-tumor-forbindelser er også muligt med dette assay.

Protocol

Flere trin udføres forud for tid og flere reagenser fremstilles og opbevares forud for fremgangsmåden: (1) cellekultur og proteinisolering, (2) fremstilling af oligonukleotid, (3) fremstilling af 96-brønds plader (4) kerneekstrakt inkubation natten over. Procedure kræver 2 dage på grund af den inkubation natten nuklear protein med DNA oligonukleotider.

1.. Fremstilling af buffere

1.1 Nuclear proteinisolering

1. Hypotonisk Buffer: Til fremstilling af 100 ml hypotonisk buffer, tilsættes 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 pi (1 M _MgCl2), 333 pi (3 M KCL) til 98,3 ml H ₂ O. Slutkoncentrationer: 10 mM HEPES, 1,5 mM _MgCl2, 10 mM KCl. For Hypotonisk buffer + NP40 (til brug i trin 2.11): Tilsæt 0,5 ml (10% NP40) til 9,5 ml Hypotonisk buffer til endelig 0,5% NP40.
2. Lavsaltbuffer: Til fremstilling af 100 ml puffer med lavt saltindhold (til brug i trin 2.15), der tilsættes 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol 150 pi (1 M _MgCl2), 666 pi (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) til 73 ml H ₂ O. Slutkoncentrationer: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM _MgCl2, 20 mM KCI, 0,2 mM EDTA.
3. High Salt Buffer: Til fremstilling af 100 ml puffer med højt saltindhold (til brug i trin 2.15), der tilsættes 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 pi (1 M _MgCl2), 26,7 ml (3 M KCL), 40 pi (0,5 M EDTA) til 47 ml H ₂ O. Slutkoncentrationer: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM _MgCl2, 800 mM KCI, 0,2 mM EDTA.
4. 10% NP40 Vaskemiddel: 10 ml NP40 til 90 ml H ₂ O
5. Protease og phosphataseinhibitorer [tilsat for hypotonisk buffer + NP40 (trin 2.11) til lavsaltbuffer (trin 2.15), og højsaltbuffer (trin 2.15) lige før brug]: Tilsæt 2,5 pi (1 M DTT) og 50 pi af proteaseinhibitorer (100x) til 5 ml af hver puffer til endelig koncentration på 0,5 mM DTT og 1x proteasehæmmere. Proteaseinhibitoren 100x lager blanding indeholder:natriumfluorid (Ser / Thr, sure phosphataser), natriumorthovanadat (Tyr, alkaliske phosphataser), β-glycerophosphat (Ser / Thr phosphataser), natriumpyrophosphat (Ser / Thr phosphataser), Aprotinin (Ser proteaser), Bestatin (amino-peptidaser ), E64 (Cysteinproteaser), leupeptin (Ser / Cys proteaser), EDTA (metalloproteaser).

1.2 Fremstilling af assayplader

1. Plate fikseringsopløsning: Til fremstilling af 500 ml af opløsningen, tilsættes 5,25 g natriumcarbonat til 500 ml _H2O, bland godt og justere pH til 9,7 til en endelig koncentration på 0,1 M natriumcarbonat.
2. Plate blokerende løsning: At forberede lager poly dI / DC oligonukleotid resuspender 1 Enhed (~ 50 mg) af poly dI / DC i 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 indeholdende 1 mM EDTA for en bestand koncentration på 50 pg / gl. Stock fortyndet til 1 pg / pl før brug.

1.3 Vask buffere og antistoffortyndinger

BEMÆRK: Streptavidin vaskepufferen bruges til at vaske pladerne mellem additioner og at fortynde primære og sekundære antistoffer.

1. For at forberede 1 L Streptavidin vaskepuffer tilsættes 2,4 g Tris / HCI, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), til 1 L Millipore-sterilfiltreret vand , pH 7.18. Opbevares ved 4 ° C. Slutkoncentrationer: 20 mM Tris / HCI, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA-bindingspuffer

BEMÆRK: Denne buffer er lagret ved -20 ° C.

1. Til fremstilling 15 ml DNA bindingspuffer tilsættes 180 pi (1 M HEPES, pH 7,9), 300 pi (3 M KCI), 12 pi (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 pi (1 M DTT), 3,0 ml (60% glycerol), 300 pi (50 pg / pl poly dI / dC) fortyndet med deioniseret / destilleret _H2O (12 ml). Endelige koncentrationer: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCI, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glycerol, 1 pg / pl poly dI / DC.

2. Celledyrkning og nuklear proteinisolering

t "> BEMÆRK: Præparatet kræver omkring 3 timer Stimulering af celler vil afhænge af eksperiment Antallet af celler, der anvendes for hvert forsøg, vil variere, og alle mængder afspejler et typisk forsøg ved anvendelse af 3 x 10 ⁷ celler / punkt Indstil volumen til at rumme... cellen nummer faktisk er anvendt i eksperimentet ^6.

1. For at forberede nukleare protein til DNA-bindende assays, kultur humane celler, der udtrykker RUNX2 (endotel, osteosarkom, brystkræftceller) i relevante medier ^6.
2. Forkæl subkonfluente celler med nocodazol (0,2 mg / ml i 16 timer) anholdelse celler ved G2 / M cellecyklus grænse ^6. Under disse betingelser er RUNX2 protein stabiliseret og maksimal DNA binding er opnået. På denne måde nok kerneprotein er tilgængelig for flere assays og inhibitorer kan sammenlignes fra det samme præparat.
3. For hvert trin, præ-køle centrifugen til 4 ° C og forberede buffere og chill 20 minutter ved 4 ° C før cellehøst.
4. Chill-celler (4 ° C) og gennemføre procedurer på is.
5. Centrifuger cellerne ved 1.000 rpm i 5 min i et 15 ml polypropylen rundbundet rør.
6. Vask 1x med iskold PBS (Ca ^{2 +} og Mg ^{2 +} gratis).
7. Centrifuge igen og kassér PBS supernatant.
8. Tilsæt 500 ul hypotonisk buffer uden proteasehæmmere, være omhyggelig med at helt at opblande cellepelleten.
9. Overfør indholdet til en 1,5 ml Eppendorf-rør.
10. Straks centrifugeres ved 5.500 rpm i 5,5 min; supernatanten og holde cellebundfaldet.
11. Resuspender cellepelleten i 500 pi hypotonisk puffer indeholdende 0,5% NP40. Tilføj protease og phosphataseinhibitorer og 0,5 mM DTT (som beskrevet i trin 1.1.5).
12. Lad prøven hvile på is i 30 minutter.
13. Centrifuger ved 13.000 rpm i 10 min.
14. Supernatanten (indeholder de cytosoliske proteiner).
15. Resuspender kernepellet i 60 pi af hver af lav salt-puffer (som proteasehæmmere og 0,5 mM DTT er blevet tilføjet fra trin 1.1.5) og højsaltbuffer (som proteasehæmmere og 0,5 mM DTT er blevet tilføjet fra trin 1.1.5) for i alt 120 ul. Tilføj 60 pi puffer med lavt saltindhold til pelleten først og resuspender, hvorefter der tilsættes 60 ul højsaltpuffer. Vortex pillen til støtte i resuspension.

BEMÆRK: Dette trin hjælper slippe af med nogle af de proteiner, kernemembranen og sat op til lysistrinnet: lav salt først (resuspender pellet, vortex), så højt salt (vortex) optimerer dette trin. Hold ekstrakt på is i 30 minutter, med hvirvelbehandling efter de første 10 min.

16. Der centrifugeres ved 12.000 rpm i 15 min; holde supernatanten indeholdende kerneprotein.
17. Mål proteinkoncentration (prøv at holde prøver på 2-5 mg / ml), alikvot i passende mængder (10 gl / tube) og opbevares ved -80 ° C.

BEMÆRK: Anslået udbytte: 30 x 10 ⁶ cells vil give 5 ug / ul protein i 120 pi. 5 x 10 ⁶ celler vil give 2.2 ug / ul protein i 40 ul.

3. Udarbejdelse af Double oligonukleotid

1. Design komplementære oligonukleotider med kompatible halvdelen sites på enderne. For RUNX2 disse er: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotin (forstand) og 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotin (antisense).

BEMÆRK: Piloteksperimenter bestemt, at tre RUNX2 bindingssteder og single-ende mærket biotin givet de mest reproducerbare resultater.

2. Forbered 5x annealingpuffer: Der tilsættes 300 pi (1 M Tris-HCI, pH 7,6), 30 pi (1 M _MgCl2), 10 pi (1 M DTT) til 260 pi _H2O (endelig 600 ul).
3. Til 200 pmol af hver enkelt-strenget oligonucleotide (3 ul), tilsættes 12 ul 5x annealingspuffer og 45 pi _H2O for i alt 60 pi (200 pmol/60 ul).
4. Opvarm til 95 ° C i 5-10 minutter i en varmeblok.
5. Afkøl til 65 ° C langsomt (ved at indstille temperaturen til 65 ° C, tager det 15 min), og derefter afkøles til stuetemperatur langsomt ved at slukke for strømmen til varmeblok (eller ved at placere i 50 ml 65 ° C varmt vand i et bæger på is, det tager 15-20 min.)

4.. Fremstilling af 96-brønds plader

BEMÆRK: Brug ikke mælkeproteiner i vaskebuffere.

1. Fix plade med fikseringsopløsning (0,1 M natriumcarbonat): Tilsæt 300 ul / brønd.
2. Inkuber i 2 timer ved at rokke ved stuetemperatur (RT) eller ingen rocking ved 4 ° C (O / N).
3. Vask plade 3x med streptavidin vaskebuffer (WB): Tilsæt 300 ul / brønd hver gang.
4. Tilføj biotin-mærket dobbelt-strenget oligonukleotid (3 konsensus bindingssteder pr nukleotid) i 2 timer wed rocking (1,25 nmol / brønd, 100 pl / brønd).
5. Vask 3x med koldt WB: tilføj 300 gl / brønd og derefter straks vendes pladen i en vask og duppes kanterne på en papirserviet efter hver tilsætning.

BEMÆRK: Brug ikke pipettespidser til at fjerne væske fra pladerne, da dette kan skrabe avidin: biotin: DNA-komplekserne fra brøndene. Gør dette for alle efterfølgende vaske trin.

5.. Inkubation med kerneekstrakt

BEMÆRK: Du må ikke erstatte laks eller sild sperm DNA for poly dI / DC blokering buffer. Undgå at blokere plader med mælkeproteiner. Begge disse blokerende midler resulterer i høje baggrundsværdier.

1. Inkuber specifikke transkriptionsfaktor fremstillet ud fra kerneekstrakt (90 ul / brønd). Forbered en master-blanding indeholdende nukleare ekstrakt (DNA bindende protein; 3-9 ug / brønd) + poly dI / DC (1 pg / pl fra en 50 ug / ul materiel) i 1x DNA bindende buffer. Volume er behov for det samlede antalbrønde, der kræves (90 gl / brønd).
2. Enhver potentiel inhibitor, såsom vitamin D3 (figur 2) eller CADD forbindelse 5.221.975 (figur 3), eller en passende fortynding af opløsningsmidlet kontrol, såsom ethanol, tilsættes på dette trin.
3. Place plade på vippeplatform, O / N ved 4 ° C.
4. Vask 3x med WB: tilføj 300 gl / brønd

6.. Tilsætning af primært antistof

BEMÆRK: Primære antistoffortyndinger skal tilberedes frisk - opbevaring kan ikke anbefales.

1. Fortynd RUNX2-specifikt monoklonalt antistof (lager 1 ug / ul) 1/5, 000 Streptavidin vaskepuffer. Forbered nok til tilsætning til hver brønd af 96-brønds plade (90 ul / brønd) in triplo.
2. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur på en vippende platform.
3. Vask 3x med WB, tilsæt 300 ul / brønd.

7.. Tilsætning af sekundært antistof

BEMÆRK: Sekundære antistoffortyndinger kan være storød ved 4 ° C natten over, hvis nødvendigt næste dag.

1. Fortynd F _ab-specifik affinitetsoprensede-HRP-konjugeret antistof (7,1 mg / ml lager) til 1:1,400 i Streptavidin vaske buffer: 3,5 ul antibody/5.0 ml vaskebuffer. Forbered nok til tilsætning til hver brønd af 96-brønds plade (90 ul / brønd) in triplo.
2. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur på en vippende platform.
3. Vask 6x med WB ved at vende pladen i vasken (300 gl / brønd).

8.. HRP substrat og produkt udvikling

1. Der tilsættes 50 pi TMB-substrat per brønd direkte fra lager flaske.
2. Inkuber 10-20 min ved RT i mørke (stop reaktion metode) eller måle absorbans direkte (konstant kinetisk overvågning).

9.. Reaktion Måling

1. Stop reaktion metode: Til visuel stop-reaktion, så tjek for farveskift fra klar til blå og stoppe reaktion med 50 ul svovlsyre.
2. Mål absorbansen ved 450 nm medBioTrak II Synlig pladelæser Spektrofotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) eller et lignende instrument.
3. Kontinuerlig kinetisk overvågning metode: Tilføj underlaget efter sidste vask og lige før anbringelse i spektrofotometret (ikke reaktionen stoppe).
4. Mål absorbansen ved 635 nm med Bio-Tek Synergy HT Multi-reaktion mikropladeaflæser Spektrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) eller et lignende instrument.

Representative Results

D-ELISA-metoden er meget specifik for den udpegede DNA-bindende protein, så længe en sekvens-specifik, dobbeltstrenget oligonukleotid, der indeholder tre kopier af konsensus RUNX2 bindingssted (ACACCA) anvendes. Det primære antistof, som genkender proteinet faktor øger også specificitet. Det sekundære antistof indeholder kovalent bundet peberrodsperoxidase (HRP), der konverterer et klart substrat (tetramethylbenzidin) til et farvet produkt for at lette detektion (Figur 1). Af disse grunde bør indgå i hvert assay plade flere vigtige baggrund kontrol for at sikre DNA binding. Disse omfatter måling af kolorimetrisk produkt fra det sekundære antistof-HRP-reaktionen i brønde indeholdende enten (1) ikke kerneprotein, (2) ingen primære antistof, eller (3) en ikke-specifik muse-IgG i stedet for det specifikke monoklonale antistof. I vores rutinemæssige målinger er de ikke-protein kontroller fratrækkes specifikt protein ennd, udtrykt som netto reaktion produkt. Yderligere, når computer-assisteret design af lægemidler (CADD) bruges til at opdage forbindelser og stoffer testes i DNA-bindingsassays virkningen af ​​opløsningsmiddel, der anvendes til at opløseliggøre forbindelserne skal bestemmes i separate brønde. Typisk vil drug screening kræve anvendelse af vand, ethanol eller dimethylsulfoxid at opløseliggøre forbindelser. Hver af disse opløsningsmidler er testet separat og på passende koncentrationer. Nogle narkotika skærme identificeret forbindelser, der har ringe effekt på DNA-binding, som vist for D-vitamin-receptor-ligand, 1α ,25-OH D3-vitamin (figur 2). Denne forbindelse inhiberede ikke DNA-binding selv ved højere koncentrationer (100 nM til 100 uM). Andre narkotika skærme opdaget forbindelser, som inhiberer protein: DNA-binding (figur 3). Baseret på analyser af kinetiske målinger ^7, at øge mængden af den CADD5221975 inhibitor resulterede i en dosisafhængig sigmoidal hæmningskurve, wed inhibitor koncentrationer over 10 ^-3 M effektivt hæmmer DNA-binding, mens koncentrationer under 10 ^-11 M viste meget lidt hæmning. _EC50 (koncentration, ved hvilken inhibitoren forårsagede en reduktion i bindingen af RUNX2 til DNA 50%) var 10 nM for denne forbindelse. De statistiske analyser for dette assay er blevet offentliggjort tidligere ⁶ og for nemheds skyld er kun én brønd i en tredobbelt række brønde er vist i de repræsentative figur 2 og 3..

Figur 1. Rutediagram af D-ELISA-protokol. (A) Isoler nukleare proteiner fra pattedyrceller. Voksende celler fraktioneret ved vaskemiddel lyse og høje salt metoder til at udvinde proteiner tæt forbundet med DNA. (B) Forbered double oligonukleotid. Den RUNX2 bindingssted ACACCAA i tre eksemplarer er parat med et biotin tag på 3'-enden. (C) Klargør 96-brønds plader. Pladerne opnået med avidin belægning, men skal være fastgjort med høj pH-værdi før tilsætning af biotin-mærkede oligonukleotider. (D) Inkuber kerneekstrakter med DNA. Pladerne blokeres med ikke-specifik poly-dI/dC før tilsætning af kerneekstrakt proteiner. (E) Tilføj primære antistof. Antistof er forberedt frisk før inkubering med plade. (F) Tilføj sekundært antistof. Sekundært antistof efterfulgt af grundig vask. (G) Tilføj HRP substrat og udvikle produktet. Kolorimetrisk produkt er synlig på pladen. (H) Mål produktets absorbans på et spektrofotometer. Absorbansen er enten 450 nm (stop reaktion) eller 635 nm (løbende overvågning). (I) Typisk kontinuerlig udlæsning ved 635 nm. Vist er specifikke reaktion og baGGRUND (ingen protein) styrer i tre eksemplarer.

Figur 2. 1α ,25-OH D3-vitamin har ringe effekt på RUNX2 DNA-binding. I dette repræsentative eksempel biologisk aktive vitamin D3, 1α ,25-OH D3-vitamin, har ringe effekt på RUNX2 DNA-binding. Andre vitamin D3-forbindelser har imidlertid dramatiske effekter på DNA binding ^6.

Figur 3. Inhibering af DNA-binding med formodet RUNX2:. DNA aktive stof I dette repræsentativt eksempel en forbindelse, der blev identificeret fra en computer-assisteret design af lægemidler (CADD) sigte udviste en dosisafhængig inhibering af RUNX2 DNA-binding fra 1 nM til 100 uM. Bindende hæmning blev beregnet ved hjælp af etablerede fremgangsmåder ⁷og gav en _EC50 (koncentration af inhibitor, som resulterede i en 50% hæmning af DNA-binding) 10 nM.

Discussion

DNA-bindende assays anvendes til at måle evnen af ​​transkriptionsfaktorer til at interagere med DNA. Analyser for DNA bindende inkluderer elektroforetiske mobilitet shift (EMSA) ¹ og kromatin immuneprecipitation (chip) baserede assays ³ samt analyser, der anvender 96-brønds formater ⁴ såsom kemiluminescerende assays ^2. EMSA er ikke kvantitativ og bruger radioaktivt ^(32P) oligonukleotider. Disse inkuberes med kerneproteiner og bindende komplekser separeres på agarose-eller polyacrylamidgeler. I modsætning hertil kvantitative D-ELISA er i stand til at måle interaktionen af ​​RUNX2 med DNA-bindende sekvenser svarende til definerede promotorelementer i RUNX2 målgener. Brugen af et anti-RUNX2 antistof øget specificitet analysen og adskiller denne analyse fra den traditionelle gel shift assay ^5.. Mens D-ELISA er en in vitro-assay og kan ikke overskue promotor belægning i levende celler,hvilket er muligt med chip assays, kan det anvendes til kvantitativt at screene for forbindelser, der inhiberer DNA-bindings-komplekser. Disse assays er begrænset til interaktion med DNA-analyser og kan ikke forudsige, om en specifik promotor aktiveres eller undertrykkes. Yderligere metoder, såsom promotor-luciferase reporter assays, er det nødvendigt at definere den transkriptionelle aktivitet af den specifikke transkriptionsfaktor.

Den almindelige protokol af D-ELISA-metoden beskrevet her blev tilpasset fra en tidligere metode, der anvendes til måling af aktiv Nfkappa-B ^8. Denne D-ELISA protokol giver en metode til kvantitativ måling af protein: DNA-binding, der er sekvens-specifikke og ikke indebærer brug af radioaktivitet. Hvis det er nødvendigt, kan reaktionshastigheder (V _max) også beregnes ud fra løbende kinetisk overvågning af reaktionen, og dette kan give yderligere diskrimination af testforbindelser ^7.

RUNX2 og dets cofaktorCBF ß blev fundet at være forbundet med de biotinmærkede oligonukleotider ^6, og dermed validere specificitet af analysen, og også at understrege, at det er muligt at identificere cofaktorer, der kan associere med specifikke DNA-bindende transkriptionsfaktorer. Med løbende kinetisk overvågning, kan inkubation udvides og mindre nukleare protein kan være nødvendig for at påvise ændringer i DNA bindende. Derfor er kinetisk overvågning forventes at være mere følsomme end stop-reaktionsmetoder. En vigtig anvendelse af denne kinetiske metode omfatter screening for lægemidler, der hæmmer eller aktiverer transskription faktor DNA binding ^6.

Andre mulige problemer, der måtte opstå i udførelsen af ​​analysen omfatter tilstedeværelsen af ​​høje baggrundsværdier. Høje baggrundsværdier kan skyldes: (1) høje sekundære antistof koncentrationer (2) utilstrækkelig blokering, (3) anvendelse af laks sperm DNA som blocker, (4) fraværet af en blokeringsprotein trin eller (5)primære eller sekundære antistoffer med lav specificitet. Hvis disse er stødt på, er mulige, herunder flere midler: (1) at optimere koncentrationen af ​​sekundært antistof i pilotundersøgelser og ved hjælp af lavere mængde antistof per brønd (2) blokering af pladen med en basisk natriumcarbonatopløsning (3) ved hjælp dI / dC som ikke-specifikt DNA snarere end laksesperma, som kan indeholde promotorer med transskription bindende elementer, eller (4) ved hjælp af forskellige par af primære eller sekundære antistoffer fra forskellige kilder.

På den anden side kan lave signalstyrke være forårsaget af (1) lav mængde målprotein (2) koncentrationerne af primære eller sekundære antistoffer ikke er optimale, (3) excitations-og / eller emissionsbølgelængder ikke er optimale, og ( 4) antistoffer har dårlig affinitet til deres substrater. Flere løsninger på disse problemer kan nævnes: (1) Som led i fejlfinding, kan man bruge 30 ul lavsaltbuffer + 30 pi højsaltbuffer hvis færre celler er tilgængeligestand og den nukleare transskriptionsfaktor er til stede i store mængder. Eller man kan bruge 90 pi lavsaltbuffer + 90 pi lavsaltbuffer hvis flere celler er tilgængelige. Flere celler er nyttige, når ekspression af den specifikke faktor, der skal testes, er lav. (2) optimere koncentrationen af ​​primært antistof for at øge signal. (3) Monitor filtrene på instrumentet for at sikre, at de er indstillet til korrekt excitation og emission maksima for TMB substrat, kan også anvendes alternative fluorescerende eller kemiluminescerende substrater. (4) Hvis det primære antistof er af lav affinitet, øge inkubationstiden på pladen.

Med hensyn til lægemiddelforskning, har den nuværende RUNX2 DNA-bindende ELISA blev anvendt til at påvise forøget binding af et protein til dets DNA-mål og identificerede naturlige forbindelser (såsom vitamin D3), som er selektive modulatorer af DNA-bindende. Nogle af disse forbindelser udviser non-kompetitive virkningsmekanismer og ændre biologiske funktion i overensstemmelse medet grænseflademiddel hæmning paradigme ^9. Med den seneste beslutning af genomisk DNA-sekventering, kan yderligere ansøgninger omfatte opdagelsen af nye proteiner interagerer med ikke-kodende ("junk") DNA, som regulerer ekspressionen af kodende regioner ^10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment