Summary
Desarrollamos una unión a ADN, ensayo basado en ELISA cuantitativo para medir las interacciones de los factores de transcripción con el ADN. Alta especificidad para la proteína RUNX2 se logró con un oligonucleótido de ADN consenso de reconocimiento y el anticuerpo monoclonal específico. Detección colorimétrica con una reacción anticuerpo-enzima-sustrato acoplado se monitorizó en tiempo real.
Abstract
Muchos ensayos de unión de ADN-tales como ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), ensayos de quimioluminiscencia, de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a base de ensayos, y ensayos basados en pocillos múltiples se utilizan para medir la actividad del factor de transcripción. Sin embargo, estos ensayos son no cuantitativos, carecen de especificidad, pueden implicar el uso de oligonucleótidos radiomarcados, y pueden no ser adaptables para el cribado de inhibidores de la unión del ADN. Por otro lado, el uso de una unión a ADN ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (D-ELISA), que demuestran las interacciones de proteínas nucleares con ADN utilizando el factor de transcripción RUNX2 que dependen de asociación específica con secuencias de unión al ADN consenso presentes en biotina- oligonucleótidos marcados. Preparación de las células, la extracción de proteína nuclear, y el diseño de oligonucleótidos de doble cadena se describen. Placas de 96 pocillos recubiertas con avidina se fijan con tampón alcalino y se incubaron con las proteínas nucleares en tampón de bloqueo de nucleótidos. Folldebido extenso lavado de las placas, el anticuerpo primario específico y las incubaciones de anticuerpos secundarios son seguidos por la adición de sustrato de peroxidasa de rábano picante y el desarrollo de la reacción colorimétrica. Modo de reacción de parada o un control cinético continuo se utilizaron para medir cuantitativamente la interacción de proteínas con el ADN. Se discuten controles de especificidad apropiadas, incluyendo el tratamiento con IgG no específica o sin proteína o anticuerpo primario. Aplicaciones del ensayo se describen incluyendo su utilidad en la detección de drogas y se discuten los resultados positivos y negativos representativos.
Introduction
Ensayos de unión al ADN tienen utilidad en la medición de la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para ADN de unión incluyen ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) que dependen de oligonucleótidos radiomarcados 1 o ensayos de quimioluminiscencia 2. Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) basadas 3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos 4 también se han descrito. Sin embargo, la EMSA es un ensayo de no cuantitativa que requiere el uso de oligonucleótidos radiomarcados. Cuando las proteínas nucleares se asocian con las secuencias específicas de nucleótidos promotora, complejos de unión están retrasados en geles de poliacrilamida y el factor de transcripción específico puede ser validado con una "supershift" anticuerpo. Hemos desarrollado un ensayo de unión de ADN-cuantitativa utilizando un formato de inmunoabsorción ligado a enzimas (D-ELISA), que es capaz de medir la interacción de RUNX2 con secuencias de unión al ADN que corresponden a elementos promotores definidos igenes objetivo n RUNX2. El uso de un anticuerpo anti-RUNX2 proporciona especificidad para el ensayo y la falta de radiomarcador distinguir este ensayo a partir del ensayo de desplazamiento en gel tradicional 5. La detección de complejos de unión es posible con el uso de un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP), que convierte un sustrato de HRP, tetrametil bencidina (TMB) en un producto coloreado para el análisis espectrofotométrico. El ensayo informado aquí puede incorporar el uso de oligonucleótidos de ADN mutadas como controles y se puede utilizar para la detección de inhibidores competitivos o no competitivos de la unión del ADN. La selección de compuestos antitumorales novedosos también es posible con este ensayo.
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Protocol
Varios pasos se llevan a cabo antes de tiempo y varios reactivos se preparan y se almacenan antes del procedimiento: (1) cultivo de células y proteínas de aislamiento, (2) preparación de oligonucleótido, (3) la preparación de placas de 96 pocillos, (4) extracto nuclear durante la noche de incubación. Procedimiento requiere 2 días debido a la incubación durante la noche de la proteína nuclear con oligonucleótidos de ADN.
1. Preparación de Buffers
1.1 aislamiento de proteínas nucleares
- Hipotónico Buffer: Para preparar 100 ml de tampón hipotónico, añadir 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 l (1 M MgCl 2), 333 l (3 M KCl) a 98,3 ml de H 2 O. Las concentraciones finales: 10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl. Para tampón hipotónico + NP40 (para su uso en el paso 2.11): Añadir 0,5 ml (10% NP40) a 9,5 ml de tampón hipotónico final de 0,5% NP40.
- Buffer Bajo en sal: Para preparar 100 ml de tampón de sal baja (para el uso en el paso 2.15), añadir 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 l (1 M MgCl 2), 666 l (3 M KCl), 40 l (0,5 M EDTA) a 73 ml de H 2 O. Las concentraciones finales: 10 mM de HEPES, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM.
- Salinidad Buffer: Para preparar 100 ml de tampón de sal de alta (para el uso en el paso 2.15), añadir 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml de glicerol, 150 l (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 l (0,5 M EDTA) a 47 ml de H 2 O. Las concentraciones finales: 10 mM de HEPES, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, 800 mM de KCl, 0,2 mM de EDTA.
- 10% de NP40 Detergente: 10 ml de NP40 a 90 ml de H2O
- Los inhibidores de proteasa y fosfatasa [añadido al tampón hipotónico + NP40 (paso 2,11), al tampón de baja sal (paso 2,15), y para tampón de alto contenido de sal (paso 2,15) justo antes de su uso]: Añadir 2,5 l (1 M DTT) y 50 l de inhibidores de la proteasa (100x) a 5 ml de cada tampón para concentración final de 0,5 mM de DTT y los inhibidores de la proteasa 1x. El inhibidor de la proteasa mezcla 100x valores incluye:fluoruro de sodio (Ser / Thr, fosfatasas ácidas), ortovanadato de sodio (Tyr, fosfatasas alcalinas), β-glicerofosfato (fosfatasas Ser / Thr), pirofosfato de sodio (fosfatasas Ser / Thr), aprotinina (Ser proteasas), bestatina (amino-peptidasas ), E64 (proteasas de cisteína), leupeptina (proteasas Ser / Cys), EDTA (metaloproteasas).
1.2 Preparación de placas de ensayo
- Placa de fijación de solución: Para preparar 500 ml de solución, añadir 5,25 g de carbonato de sodio a 500 ml de H2O, mezclar bien y ajustar el pH a 9,7 para una concentración final de carbonato de sodio 0,1 M.
- Placa de solución de bloqueo: Para preparar Stock poli dI / DC oligonucleótido, resuspender 1 Unidad (~ 50 mg) de poli dI / DC en 1 ml de 10 mM de Tris / HCl, pH 7,9 que contiene EDTA 1 mM para una concentración de solución madre de 50 mg / l. El stock se diluye a 1 g / l antes de su uso.
1.3 tampones de lavado y diluciones de anticuerpos
NOTA: tampón de lavado estreptavidina es utilizado para lavar platos en entre adiciones y para diluir los anticuerpos primarios y secundarios.
- Para preparar 1 l de tampón de lavado estreptavidina, añadir 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), a 1 L de agua filtrada Millipore estéril , pH 7,18. Almacenar a 4 ° C. Las concentraciones finales: 20 mM de Tris / HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20.
Tampón de unión a ADN 1,4
NOTA: Este tampón se almacenó a -20 ° C.
- Para preparar 15 ml de tampón de unión de ADN, añadir 180 l (1 M HEPES, pH 7,9), 300 l (3 M de KCl), 12 l (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 l (1 M DTT), 3,0 ml (60% de glicerol), 300 l (50 g / l de poli dI / DC) diluido con agua desionizada / destilada H 2 O (12 ml). Las concentraciones finales: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, EDTA 0,4 mM, DTT 0,5 mM, 12% de glicerol, 1 g / l de poli dI / DC.
2. Cultivo de células y aislamiento de proteínas nucleares
t "> NOTA: La preparación requiere alrededor de 3 horas de estimulación de las células dependerá de experimento El número de células utilizadas para cada experimento puede variar y todos los volúmenes refleja un experimento típico utilizando 3 x 10 7 células / punto de ajustar los volúmenes de acomodar... el número de células realmente utilizada en el experimento 6.- Para preparar la proteína nuclear para los ensayos de unión de ADN, células humanas de cultivo que expresan RUNX2 (endotelial, osteosarcoma, células de cáncer de mama) en los medios de comunicación adecuados 6.
- Tratar las células subconfluentes con nocodazole (0,2 mg / ml durante 16 horas) para detener las células en el ciclo celular límite G2 / M 6. En estas condiciones, la proteína RUNX2 se estabiliza y se consigue la unión de ADN máxima. De esta manera, suficiente proteína nuclear está disponible para múltiples ensayos y los inhibidores se pueden comparar a partir de la misma preparación.
- Para cada paso, pre-enfriar la centrífuga a 4 ° C y preparar tampones y enfriar 20 min a 4 ° C antes de la cosecha de células.
- Células Chill (4 ° C) y procedimientos de conducta en el hielo.
- Centrifugar las células a 1000 rpm durante 5 min en un tubo de fondo redondo de 15 ml de polipropileno.
- Lavar 1x con helado de PBS (Ca 2 + y Mg 2 + libre).
- Se centrifuga de nuevo y desechar PBS sobrenadante.
- Añadir 500 l de tampón hipotónico y sin inhibidores de la proteasa, teniendo cuidado para resuspender completamente el sedimento celular.
- Transferir contenido a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
- Inmediatamente centrifugar a 5.500 rpm durante 5,5 min; descartar el sobrenadante y mantener el sedimento celular.
- Resuspender el sedimento de células en 500 l de tampón hipotónico que contienen 0,5% de NP40. Añadir la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa y DTT 0,5 mM (tal como se describe en el paso 1.1.5).
- Permitir que la muestra para descansar en hielo durante 30 min.
- Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min.
- Descartar el sobrenadante (que contiene las proteínas citosólicas).
- Resuspender el botón nuclear en 60 l cada uno de baja salt tampón (a la que los inhibidores de la proteasa y DTT 0,5 mM, se han añadido de la etapa 1.1.5) y el tampón de sal alta (a la que los inhibidores de la proteasa y DTT 0,5 mM, se han añadido de la etapa 1.1.5) para un total de 120 l. Añadir 60 l de tampón de baja salinidad al sedimento primero y volver a suspender, a continuación, añadir 60 l de tampón de alta salinidad. Agite el pellet para ayudar en la resuspensión.
NOTA: Este paso ayuda a deshacerse de algunas de las proteínas de la membrana nuclear y prepara para el paso de lisis: baja en sal primero (pellet se resuspende, vórtice), a continuación, alto contenido de sal (vortex) optimiza este paso. Mantener extracto en hielo durante 30 min, con agitación con vórtex después de la primera 10 min.
- Centrifugar a 12000 rpm durante 15 min; mantener el sobrenadante que contiene la proteína nuclear.
- Medir la concentración de proteínas (trate de mantener las muestras a 2-5 mg / ml), la alícuota, en cantidades adecuadas (10 l / tubo) y se almacena a -80 ° C.
NOTA: El rendimiento estimado: 30 x 10 6 celLS producirán 5 g / l de proteína en 120 l. 5 x 10 6 células producirán 2,2 g / l de proteínas en 40 l.
3. Preparación de la doble cadena de oligonucleótidos
- Diseñar oligonucleótidos complementarios con los sitios de media compatibles en los extremos. Para RUNX2 estos son: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotina (sentido) y 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotina (antisentido).
NOTA: Los experimentos piloto determinó que tres sitios de unión RUNX2 y single-end marcado con biotina produjeron los resultados más reproducibles.
- Prepare el tampón de hibridación 5x: Añadir 300 l (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 l (1 M MgCl 2), 10 l (1 M DTT) a 260 l H 2 O (finales de 600 l).
- Para 200 pmol de cada olig monocatenarioonucleotide (3 l), añadir 12 l de tampón de recocido 5x y 45 l H 2 O para un total de 60 l (200 pmol/60 mu l).
- Se calienta a 95 ° C durante 5-10 min en un bloque de calentamiento.
- Enfriar a 65 ° C lentamente (ajustando la temperatura a 65 ° C, se tarda 15 min), luego se enfría a temperatura ambiente lentamente de desconectar la alimentación del bloque de calentamiento (o colocando en 50 ml de agua a 65 ° C en un vaso de hielo, lo que tarda 15-20 minutos).
4. Preparación de placas de 96 pocillos
NOTA: No utilizar proteínas de la leche en los tampones de lavado.
- Fijar la placa con solución de fijación (0,1 M de carbonato de sodio): añadir 300 l / pocillo.
- Incubar durante 2 horas, meciendo a temperatura ambiente (RT), o ninguna mecedora a 4 ° C (O / N).
- Lave la placa 3x con tampón de lavado estreptavidina (BM): añadir 300 l / pocillo cada vez.
- Añadir oligonucleótido de doble cadena marcado con biotina (3 sitios de unión de consenso por nucleótido) durante 2 horas wi-ésimo de balanceo (1,25 nmol / pocillo; 100 l / pocillo).
- Lave 3 veces con frío WB: añadir 300 l / pocillo y luego invertir inmediatamente la placa en un fregadero y borra los bordes en una toalla de papel después de cada adición.
NOTA: No utilice las puntas de pipeta para extraer líquido de las placas ya que esto puede raspar avidina: biotina: ADN de los pozos. Haga esto para todas las etapas de lavado posteriores.
5. La incubación con extracto nuclear
NOTA: No sustituya el salmón o el ADN de esperma de arenque para el poli tampón de bloqueo dI / DC. Evite bloquear las placas con proteínas de la leche. Ambos de estos agentes de bloqueo resultan en altos valores de fondo.
- Incubar con factor de transcripción específico preparado a partir de extracto nuclear (90 l / pocillo). Preparar una mezcla maestra que contiene extracto nuclear (proteína de unión a ADN, 3-9 mg / pocillo) + poli dI / DC (1 g / l de un mg / Stock ul 50) en el ADN de 1x tampón de unión. El volumen se como sea necesario para el número total depozos requeridos (90 l / pocillo).
- Cualquier inhibidor potencial, tales como la vitamina D3 (Figura 2) o compuesto CADD 5221975 (Figura 3), o la dilución apropiada del control de disolvente, tal como etanol, se añade en este paso.
- Colocar la placa en la plataforma oscilante, O / N a 4 ° C.
- Lave 3x con WB: añadir 300 l / pocillo
6. La adición de Anticuerpo Primario
NOTA: diluciones de anticuerpos primarios deben estar preparados frescos - No se recomienda el almacenamiento.
- Diluir el anticuerpo monoclonal-RUNX2 específica (acción 1 mg / l) 1/5, 000 en estreptavidina Tampón de lavado. Preparar suficiente para la adición a cada pocillo de la placa de 96 pocillos (90 l / pocillo) por triplicado.
- Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
- Lave 3x con WB, añadir 300 l / pocillo.
7. La adición de anticuerpo secundario
NOTA: diluciones de anticuerpos secundarios pueden ser storojo a 4 ° C durante la noche si es necesario el día siguiente.
- Diluir F purificado por afinidad-HRP anticuerpo conjugado (7,1 mg / ml) ab-específica a 1:1,400 en estreptavidina Tampón de lavado: tampón de lavado ml 3,5 l antibody/5.0. Preparar suficiente para la adición a cada pocillo de la placa de 96 pocillos (90 l / pocillo) por triplicado.
- Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
- Lave 6x con WB invirtiendo la placa en el fregadero (300 l / pocillo).
8. HRP Sustrato y Desarrollo de Productos
- Añadir 50 l de sustrato TMB por pocillo directamente desde el almacén botella.
- Incubar 10-20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (parada método de reacción) o medir la absorción directa (monitoreo cinética continua).
9. Reacción Medición
- Deje de método de reacción: Para la reacción de parada visual, compruebe el cambio de color de claro a azul y detener la reacción con ácido sulfúrico 50 l.
- Medir la absorbancia a 450 nm conel espectrofotómetro Biotrak II lector de placa visible (Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway NJ, EE.UU.) o un instrumento similar.
- Continuo método de monitoreo cinética: Añadir sustrato después del último lavado y justo antes de colocar en el espectrofotómetro (no detener la reacción).
- Medir la absorbancia a 635 nm con el Bio-Tek Sinergia HT multi-reacción lector de microplacas Espectrofotómetro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, EE.UU.) o un instrumento similar.
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Representative Results
El método D-ELISA es altamente específico para la proteína de unión a ADN designado, siempre y cuando se utiliza un oligonucleótido de doble cadena específica de la secuencia que contiene tres copias del sitio de unión consenso RUNX2 (ACACCA). El anticuerpo primario que reconoce el factor de proteína también aumenta la especificidad. El anticuerpo secundario contiene covalentemente unido a la peroxidasa de rábano picante (HRP) que convierte un sustrato transparente (tetrametil bencidina) en un producto coloreado para la facilidad de la detección (Figura 1). Por estas razones, varios controles de fondo importantes necesitan ser incluidos en cada placa de ensayo para asegurar la unión específica de ADN. Estos incluyen medir el producto colorimétrico a partir de la reacción secundaria de anticuerpo-HRP en los pocillos que contenían o bien (1) sin proteína nuclear, (2) sin anticuerpo primario, o (3) un IgG de ratón no específica en lugar del anticuerpo monoclonal específico. En nuestras mediciones de rutina, los controles no-proteína se restan de la proteína de una específicaND expresa como producto de la reacción neta. Además, cuando el diseño de fármacos asistido por ordenador (CADD) se utiliza para descubrir compuestos y los fármacos se ensayan en ensayos de unión de ADN, el efecto del disolvente utilizado para solubilizar los compuestos deben ser determinados en pocillos separados. Típicamente, la detección de drogas requerirá el uso de agua, etanol, o dimetilsulfóxido para solubilizar compuestos. Cada uno de estos disolventes se prueba por separado y en las concentraciones apropiadas. Algunas pantallas fármaco identificado compuestos que tienen poco efecto sobre la unión al ADN, como se muestra para el ligando receptor de la vitamina D, 1α ,25-OH vitamina D3 (Figura 2). Este compuesto no inhibió la unión al ADN incluso en concentraciones más altas (100 nM a 100 mM). Otras pantallas de drogas detectados compuestos que inhiben la proteína: unión al ADN (Figura 3). Con base en el análisis de las medidas cinéticas 7, aumentando las cantidades de inhibidor CADD5221975 resultado en una curva sigmoidal inhibición dependiente de la dosis, with inhibidor concentraciones superiores a 10 -3 M inhiben eficazmente la unión de ADN, mientras que concentraciones por debajo de 10 -11 M mostraron muy poca inhibición. La CE 50 (concentración a la que el inhibidor causado una reducción del 50% en la unión de RUNX2 a ADN) fue de 10 nM para este compuesto. Los análisis estadísticos para este ensayo se han publicado previamente 6 y, por simplicidad, sólo un pocillo de una serie por triplicado de pocillos se muestra en las figuras representativas 2 y 3.
Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo D-ELISA. (A) Aislar proteínas nucleares a partir de células de mamíferos. Las células en crecimiento se fraccionaron mediante lisis con detergente y métodos de alta sal para extraer proteínas fuertemente asociadas con el ADN. (B) Preparar doligonucleótido de cadena ouble. El RUNX2 ACACCAA sitio de unión por triplicado se prepara con una etiqueta de biotina en el extremo 3 '. (C) preparar placas de 96 pocillos. Las placas se obtuvieron con recubrimiento de avidina, pero deben fijarse con alto pH antes de la adición de oligonucleótidos marcados con biotina. (D) Incubar extractos nucleares con el ADN. Las placas se bloquean con poly-dI/dC no específica antes de la adición de extracto de proteínas nucleares. (E) Añadir anticuerpo primario. El anticuerpo se prepara fresca antes de la incubación con la placa. (F) Añadir anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario es seguido por un lavado extensivo. (G) Añadir sustrato de HRP y desarrollar el producto. Producto colorimétrico es visible en la placa. (H) Medir la absorbancia del producto en un espectrofotómetro. Absorbancia es o bien 450 nm (detener la reacción) o 635 nm (supervisión continua). (I) lectura continua típica a 635 nm. Se muestran reacción específica y background (sin proteínas) controla por triplicado.
Figura 2. 1α ,25-OH vitamina D3 tiene poco efecto sobre el ADN RUNX2 de unión. En este ejemplo representativo, la vitamina biológicamente activa D3, 1α ,25-OH vitamina D3, tiene poco efecto sobre el ADN RUNX2 de unión. Otros compuestos de vitamina D3, sin embargo, tienen efectos dramáticos en la unión al ADN 6.
Figura 3. Inhibición de la unión por RUNX2 putativo de ADN:. Fármaco activo ADN En este ejemplo representativo, un compuesto que se identificó a partir de un diseño de fármacos asistido por ordenador de pantalla (CADD) exhibió una inhibición dependiente de la dosis de ADN RUNX2 de unión de 1 nM a 100 mM. Inhibición de la unión se calculó usando métodos establecidos 7y produjo una CE 50 (concentración de inhibidor que dio como resultado una inhibición del 50% de la unión al ADN) de 10 nM.
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Discussion
Ensayos de unión al ADN se utilizan para medir la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para la unión del ADN incluyen cambio de la movilidad electroforética (EMSA) y 1 inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos basados 3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos 4 tales como ensayos quimioluminiscentes 2. La EMSA es no cuantitativa y utiliza radiomarcado (32 P) oligonucleótidos. Estos se incubaron con las proteínas nucleares y complejos de unión se separan en agarosa o de poliacrilamida geles. En contraste, el cuantitativa D-ELISA es capaz de medir la interacción de RUNX2 con secuencias de unión al ADN que corresponden a elementos promotores definidos en los genes diana RUNX2. El uso de un anticuerpo anti-RUNX2 aumentó la especificidad del ensayo y distingue este ensayo del ensayo de desplazamiento en gel tradicional 5. Mientras que el D-ELISA es un ensayo in vitro y no puede Encuesta de ocupación promotor en células vivas,que es posible con los ensayos de chip, que puede ser utilizado para detectar cuantitativamente para los compuestos que inhiben los complejos de unión al ADN. Estos ensayos se limitan a la interacción análisis de ADN y no se puede predecir si un promotor específico se activa o reprimida. Otros enfoques, tales como los ensayos de reportero de luciferasa promotor-, son necesarios para definir la actividad transcripcional del factor de transcripción específico.
El protocolo general del método D-ELISA descrito aquí fue adaptada de un método anterior utilizado para medir el activo Nfkappa-B 8. Este protocolo D-ELISA proporciona un método para la medición cuantitativa de la proteína: ADN vinculante es la secuencia específica y no implica el uso de la radiactividad. Si es necesario, las velocidades de reacción (V max) también se pueden calcular a partir de la supervisión continua cinética de la reacción y esto puede proporcionar la discriminación adicional de los compuestos de ensayo 7.
RUNX2 y su cofactorSe encontraron SS Cbf para ser asociado con los oligonucleótidos marcados con biotina 6, validando así la especificidad del ensayo y también haciendo hincapié en que es posible identificar cofactores que pueden asociar con factores de transcripción de unión a ADN específicas. Con la monitorización cinética continua, la incubación se puede extender y puede ser necesario menos proteína nuclear para detectar cambios en el ADN de unión. Por lo tanto, se espera que la supervisión cinética a ser más sensibles que los métodos de reacción en parada. Una aplicación importante de este método incluye cinética de cribado para fármacos que inhiben o activan el factor de transcripción de unión a ADN 6.
Otros posibles problemas que puedan surgir en la ejecución del ensayo incluyen la presencia de altos valores de fondo. Los valores altos de fondo podrían ser debido a: (1) concentraciones elevadas de anticuerpos secundarios, (2) de bloqueo insuficiente, (3) el uso de ADN de esperma de salmón como bloqueador, (4) la ausencia de una etapa de bloqueo de proteína o (5)anticuerpos primarios o secundarios con baja especificidad. Si éstos se encuentran, varios remedios son posibles, incluyendo: (1) la optimización de la concentración de anticuerpo secundario en estudios piloto y el uso de un menor volumen de anticuerpo por pocillo, (2) el bloqueo de la placa con una solución básica de carbonato de sodio (3) utilizando dI / dC como ADN no específico en lugar de esperma de salmón, que puede contener promotores con elementos de unión de la transcripción, o (4) usando diferentes pares de anticuerpos primarios o secundarios de diferentes fuentes.
Por otro lado, intensidad de la señal bajo podría ser causada por (1) baja cantidad de proteína diana, (2) las concentraciones de anticuerpos primarios o secundarios no son óptimas, (3) de excitación y / o emisión de longitudes de onda no son óptimas, y ( 4) anticuerpos tienen poca afinidad por sus sustratos. Varios remedios para estos problemas incluyen: (1) Como parte de la solución de problemas, se puede utilizar 30 l de tampón bajo en sal + 30 l de tampón de alta salinidad, si un menor número de células están disponiblesfactor de transcripción capaces y la nuclear está presente en altas cantidades. O uno podría utilizar 90 l bajo tampón salino + 90 l de tampón bajo en sal, si se dispone de más células. Más células son útiles cuando la expresión del factor específico para ser evaluados es baja. (2) optimizar la concentración de anticuerpo primario para aumentar la señal. (3) Controlar los filtros en el instrumento para asegurarse de que se establecen para una correcta excitación y emisión máxima para el sustrato de TMB; fluorescente alternativa o sustratos quimioluminiscentes se pueden utilizar también. (4) Si el anticuerpo primario es de baja afinidad, aumentar el tiempo de incubación en la placa.
En términos de descubrimiento de fármacos, la RUNX2 actual de unión a ADN de ELISA se ha utilizado para detectar la unión mejorada de una proteína para su diana de ADN y compuestos naturales identificados (tales como vitamina D3) que son moduladores selectivos de ADN de unión. Algunos de estos compuestos presentan mecanismos no competitivos de acción y alterar la función biológica en consonancia conun paradigma de inhibición interfacial 9. Con la reciente resolución de la secuenciación del ADN genómico, otras aplicaciones podrían incluir el descubrimiento de nuevas proteínas que interactúan con la no-codificación ("basura") de ADN, que regula la expresión de codificación de las regiones 10.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
La asistencia técnica y la instrumentación de la Universidad de Maryland Fondo para el Centro de Cáncer Greenebaum Traslacional Core, especialmente los Dres. Rena Lapidus y Mariola Sadowska, se agradece. El trabajo responsable de la elaboración de este ensayo fue financiado en parte por el NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un Premio al Mérito VA a AP, y por la Universidad de Maryland de cigarrillos fondos de reembolso (CRF) proporcionada a la Marlene y Stewart Centro del Cáncer de Greenbaum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
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