Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

قمنا بتطوير الحمض النووي ملزم، فحص ELISA الكمية استنادا لقياس التفاعلات عامل النسخ مع الحمض النووي. وقد تحقق خصوصية عالية للبروتين RUNX2 مع إجماع قليل النوكليوتيد الحمض النووي الاعتراف والأضداد وحيدة النسيلة محددة. تم رصد الكشف اللونية مع رد فعل الأجسام المضادة الركيزة جانب انزيم في الوقت الحقيقي.

Abstract

وتستخدم العديد من فحوصات الحمض النووي ملزم مثل فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA)، المقايسات chemiluminescent، مناعي لونين (رقاقة) القائم على المقايسات، ومقرها المقايسات multiwell لقياس النشاط عامل النسخ. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات هي nonquantitative، تفتقر إلى الدقة، قد تنطوي على استخدام أليغنوكليوتيد رديولبلد، وربما لا تكون قابلة للتكيف لفحص مثبطات الحمض النووي ملزمة. من ناحية أخرى، وذلك باستخدام الحمض النووي ملزم انزيم مرتبط المناعي فحص الكمية (D-ELISA) الفحص، ونحن لشرح التفاعلات البروتين النووي مع الحمض النووي باستخدام عامل النسخ RUNX2 التي تعتمد على الجمعيات محددة مع الإجماع تسلسل الحمض النووي ملزم موجودة على البيوتين- [أليغنوكليوتيد المسمى. إعداد الخلايا، وصفت استخراج البروتين النووي، وتصميم أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم إصلاحها لوحات 96 جيدا المغلفة أفيدين مع العازلة القلوية وحضنت مع البروتينات النووية في النوكليوتيدات عرقلة العازلة. الفلبسبب الغسيل واسعة من لوحات، والأجسام المضادة الأولية محددة وحضانات الضد الثانوية تليها إضافة الركيزة البيروكسيداز الفجل وتطوير رد الفعل اللونية. واستخدمت طريقة تفاعل توقف أو الرصد المستمر لقياس الحركية كميا البروتين التفاعل مع الحمض النووي. نناقش ضوابط خصوصية المناسبة، بما في ذلك العلاج مع مفتش غير محددة أو بدون البروتين أو الأجسام المضادة الأولية. موصوفة التطبيقات للمقايسة بما في ذلك فائدته في فحص المخدرات وتناقش النتائج الإيجابية والسلبية ممثل.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

فحوصات الحمض النووي ملزم لها فائدة في قياس قدرة عوامل النسخ للتفاعل مع الحمض النووي. وتشمل فحوصات الحمض النووي لربط الكهربي المقايسات التحول التنقل (EMSA) التي تعتمد على أليغنوكليوتيد رديولبلد 1 أو 2 المقايسات معان كيميائي. كما تم وصفها المقايسات لونين immuneprecipitation (رقاقة) استنادا 3 وكذلك فحوصات توظيف الأشكال 96 جيدا 4. ومع ذلك، فإن EMSA هو فحص غير الكمية التي يتطلب استخدام أليغنوكليوتيد رديولبلد. عندما ربط البروتينات النووية مع تسلسل النوكليوتيدات محددة المروج والمجمعات الملزمة هي المتخلفين على المواد الهلامية بولكرلميد ويمكن التحقق من صحة عامل النسخ محددة مع الأجسام المضادة "supershift". قمنا بتطوير فحص الحمض النووي ملزم الكمي باستخدام شكل انزيم مرتبط المناعي (D-ELISA)، والتي هي قادرة على قياس تفاعل RUNX2 مع تسلسل الحمض النووي ملزم المقابلة لعناصر المروج تعريف طالجينات المستهدفة ن RUNX2. استخدام الأضداد المضادة للRUNX2 يوفر خصوصية للفحص وعدم التمييز radiolabel هذا الاختبار من تحول جل مقايسة التقليدية 5. الكشف عن المجمعات ملزم هو ممكن مع استخدام الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب أن الفجل البيروكسيداز (HRP)، والذي يحول الركيزة HRP، ميثيل البنزيدين (تمب) إلى منتج للتحليل الطيفي اللون. مقايسة ذكرت هنا يمكن دمج استخدام أليغنوكليوتيد] الحمض النووي تحور والضوابط، ويمكن استخدامها للكشف عن مثبطات تنافسية أو غير تنافسية من الحمض النووي ملزمة. فحص المركبات المضادة للورم الرواية من الممكن أيضا مع هذا الاختبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم تنفيذ عدة خطوات في وقت سابق ويتم إعداد العديد من الكواشف وتخزينها قبل الإجراء: (1) زراعة الخلايا والبروتين العزلة، (2) إعداد نيوكليوتيدات دقيقة، (3) إعداد لوحات 96 بشكل جيد، (4) استخراج النووية الحضانة بين عشية وضحاها. الإجراء يتطلب 2 أيام بسبب الحضانة بين عشية وضحاها من البروتين النووي مع الحمض النووي [أليغنوكليوتيد.

1. إعداد المخازن المؤقتة

1.1 البروتين النووي العزلة

  1. ناقص التوتر العازلة: لتحضير 100 مل من العازلة منخفض التوتر، إضافة 1 مل (1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9)، و 150 ميكرولتر (1 M MgCl 2)، 333 ميكرولتر (3 M بوكل) إلى 98.3 مل H 2 O. تركيزات النهائي: 10 ملي HEPES، 1.5 ملي MgCl 10 ملي بوكل. لعازلة منخفض التوتر + NP40 (للاستخدام في الخطوة 2.11): إضافة 0.5 مل (10٪ NP40) إلى 9.5 مل العازلة منخفض التوتر لنهائي 0.5٪ NP40.
  2. منخفض الملح العازلة: لتحضير 100 مل من العازلة منخفضة الملح (للاستخدام في الخطوة 2.15)، إضافة 1 مل (1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9)، 25 مل الجلسرين، و 150 ميكرولتر (1 M MgCl 2)، 666 ميكرولتر (3 M بوكل)، و 40 ميكرولتر (0.5 M EDTA) إلى 73 مل H 2 O. تركيزات النهائي: 10 ملي HEPES، 25٪ الجلسرين، و 1.5 ملي MgCl 20 ملي بوكل، 0.2 ملي EDTA.
  3. الملح العازلة عالية: إعداد 100 مل من العازلة عالية من الملح (للاستخدام في الخطوة 2.15)، إضافة 1 مل (1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9)، 25 مل الجلسرين، و 150 ميكرولتر (1 M MgCl 2)، 26.7 مل (3 M بوكل)، و 40 ميكرولتر (0.5M EDTA) إلى 47 مل H 2 O. تركيزات النهائي: 10 ملي HEPES، 25٪ الجلسرين، و 1.5 ملي MgCl 800 ملي بوكل، 0.2 ملي EDTA.
  4. 10٪ NP40 منظفات: 10 مل إلى 90 مل NP40 H 2 O
  5. البروتيني والفوسفاتيز مثبطات [تضاف إلى المخزن المؤقت ناقص التوتر + NP40 (الخطوة 2.11)، إلى انخفاض عازلة الملح (الخطوة 2.15)، والعازلة عالية من الملح (الخطوة 2.15) فقط قبل استخدامها]: إضافة 2.5 ميكرولتر (1 M DTT) و 50 ميكرولتر من مثبطات الأنزيم البروتيني (100X) إلى 5 مل من كل العازلة للتركيز النهائي من 0.5 ملي DTT ومثبطات الأنزيم البروتيني 1X. ومثبط البروتياز خليط الأسهم 100X تشمل ما يلي:فلوريد الصوديوم (سر / الثريونين، phosphatases الحمضية)، orthovanadate الصوديوم (صور، phosphatases القلوية)، β-جليسروفوسفات (phosphatases سر / الثريونين)، بيروفوسفات الصوديوم (phosphatases سر / الثريونين)، أبروتينين (سر البروتياز)، Bestatin (أمينو peptidases )، E64 (البروتياز سيستين)، Leupeptin (البروتياز سر / السيستئين)، EDTA (metalloproteases).

1.2 إعداد لوحات مقايسة

  1. لوحة تحديد الحل: لتحضير 500 مل من الحل، إضافة 5.25 غ كربونات الصوديوم إلى 500 مل H 2 O، وتخلط جيدا وضبط درجة الحموضة إلى 9.7 لتركيز النهائي من 0.1 M كربونات الصوديوم.
  2. لوحة عرقلة الحل: لإعداد الأوراق المالية بولي دي / تيار مستمر نيوكليوتيدات دقيقة، في resuspend 1 وحدة (~ 50 ملغ) من بولي دي / تيار مستمر في 1 مل من 10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9 ملي EDTA تحتوي على 1 لتركيز الأسهم من 50 ميكروغرام / ميكرولتر. غير المخفف الأسهم إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر قبل استخدامها.

1.3 مخازن غسل والتخفيفات الضد

ملاحظة: غسل العازلة Streptavidin هو تستخدم لغسل الأطباق في ما بين الإضافات وتمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية.

  1. لتحضير 1 لتر من Streptavidin غسل العازلة، إضافة 2.4 ز تريس / حمض الهيدروكلوريك، 37.5 مل (4 M كلوريد الصوديوم)، و 10 مل (10٪ BSA)، 5 مل (10٪ توين 20)، إلى 1 الماء المصفى L ميليبور معقمة ، ودرجة الحموضة 7.18. تخزين عند 4 درجات مئوية. تركيزات النهائي: 20 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1٪ BSA، 0.05٪ توين 20.

1.4 العازلة ملزم الحمض النووي

ملاحظة: يتم تخزين هذه العازلة في -20 درجة مئوية.

  1. لتحضير 15 مل من العازلة ملزمة الحمض النووي، إضافة 180 ميكرولتر (1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9)، و 300 ميكرولتر (3 M بوكل)، و 12 ميكرولتر (0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.0)، 7.5 ميكرولتر (1 M DTT)، 3.0 مل (60٪ الجلسرين)، 300 ميكرولتر (50 ميكروغرام / ميكرولتر بولي دي / تيار مستمر) المخفف مع منزوع الأيونات / المقطر H 2 O (12 مل). تركيزات النهائي: 12 ملي HEPES / درجة الحموضة 7.9 و 60 ملي بوكل، 0.4 ملي EDTA، 0.5 ملي DTT، الجلسرين 12٪، 1 ميكروغرام / ميكرولتر بولي دي / تيار مستمر.

2. الثقافة الخلية وعزل بروتين النووية

ر "> ملاحظة: إعداد يتطلب حوالي 3 ساعة سوف تحفيز الخلايا تعتمد على التجربة وعدد الخلايا المستخدمة في كل تجربة تختلف وكافة وحدات التخزين تعكس تجربة نموذجية باستخدام 3 × 10 7 خلية / نقطة ضبط كميات لاستيعاب.. عدد الخلايا المستخدمة فعليا في التجربة 6.

  1. لإعداد البروتين النووي لفحوصات الحمض النووي ملزم والثقافة الخلايا البشرية التي تعبر عن RUNX2 (البطانية، عظمية، وخلايا سرطان الثدي) في وسائل الإعلام المناسبة 6.
  2. علاج الخلايا subconfluent مع نوكودازول (0.2 ميكروغرام / مل لمدة 16 ساعة) لاعتقال الخلايا في G2 / M دورة الخلية الحدود 6. في ظل هذه الظروف، واستقرت ويتحقق الحمض النووي القصوى ملزمة البروتين RUNX2. في هذه الطريقة، ما يكفي من البروتين النووي هو متاح لفحوصات ومثبطات متعددة يمكن مقارنة من نفس الإعداد.
  3. لكل خطوة، قبل تبريد أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية، وإعداد مخازن وهدئ 20 دقيقة على 4 درجات مئوية قبل الحصاد الخلية.
  4. الخلايا البرد (4 درجات مئوية) وإجراء الإجراءات على الجليد.
  5. خلايا الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 15 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع.
  6. غسل 1X مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة (كا 2 + والمغنيسيوم 2 + مجاني).
  7. الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل طاف PBS.
  8. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة منخفض التوتر دون مثبطات الأنزيم البروتيني، والحرص ل resuspend تماما بيليه الخلية.
  9. نقل المحتويات إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
  10. أجهزة الطرد المركزي على الفور في 5،500 دورة في الدقيقة ل5.5 دقيقة، تجاهل طاف والحفاظ على بيليه الخلية.
  11. resuspend الكرية خلية في 500 ميكرولتر من العازلة منخفض التوتر التي تحتوي على 0.5٪ NP40. إضافة البروتيني ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز و 0.5 ملي DTT (كما هو موضح في الخطوة 1.1.5).
  12. السماح للعينة للراحة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  13. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
  14. تجاهل طاف (يحتوي على البروتينات عصاري خلوي).
  15. resuspend الكرية النووي في 60 ميكرولتر كل من سال منخفضةر العازلة (التي تم إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني و 0.5 ملي DTT من الخطوة 1.1.5) وعالية عازلة الملح (الذي تم إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني و 0.5 ملي DTT من الخطوة 1.1.5) لما مجموعه 120 ميكرولتر. إضافة 60 ميكرولتر من العازلة منخفضة الملح لبيليه و resuspend الأولى، ثم إضافة 60 ميكرولتر من العازلة عالية من الملح. دوامة بيليه للمساعدة في إعادة تعليق.

ملاحظة: هذه الخطوة يساعد على التخلص من بعض البروتينات الغشاء النووي وإعداد للخطوة تحلل: الملح المنخفضة أولا (بيليه resuspend، الدوامة)، ثم الملح عالية (الدوامة) يحسن هذه الخطوة. الحفاظ على استخراج على الجليد لمدة 30 دقيقة، مع vortexing لبعد 10 دقيقة الأولى.

  1. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة، تبقي طاف تحتوي على البروتين النووي.
  2. قياس تركيز البروتين (في محاولة للحفاظ على عينات 2-5 ملغ / مل)، قسامة بكميات مناسبة (10 ميكرولتر / أنبوب) وتخزينها في -80 درجة مئوية.

ملاحظة: العائد المقدر: 30 × 10 6 سلوسوف تسفر يرة سورية 5 ميكروغرام / ميكرولتر البروتين في 120 ميكرولتر. 5 × 10 6 خلايا سيحقق 2.2 ميكروغرام / ميكرولتر البروتين في 40 ميكرولتر.

3. إعداد مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل قليل النوكليوتيد

  1. تصميم أليغنوكليوتيد] تكميلية مع مواقع نصف متوافق على الغايات. لRUNX2 هذه هي: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA تابعين TCG-3'البيوتين (معنى) و5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T-GTGGTT AATACG 3'البيوتين (العقاقير).

ملاحظة: تجارب رائدة قرر أن ثلاثة مواقع ملزمة RUNX2 ونهاية واحدة البيوتين المسمى أسفرت عن نتائج أكثر استنساخه.

  1. إعداد العازلة الصلب 5X: إضافة 300 ميكرولتر (1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6)، و 30 ميكرولتر (1 M MgCl 2)، و 10 ميكرولتر (1 M DTT) إلى 260 ميكرولتر H 2 O (600 ميكرولتر النهائي).
  2. إلى 200 بمول كل olig واحد الذين تقطعت بهم السبلonucleotide (3 ميكرولتر)، إضافة 12 ميكرولتر من 5X العازلة الصلب و 45 ميكرولتر H 2 O لما مجموعه 60 ميكرولتر (200 pmol/60 ميكرولتر).
  3. الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة في كتلة التدفئة.
  4. بارد إلى 65 درجة مئوية ببطء (عن طريق تحديد درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية، ويستغرق 15 دقيقة)، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة ببطء عن طريق إيقاف قوة كتلة التدفئة (أو عن طريق وضع في 50 مل من الماء 65 ° C في دورق على الجليد، وهذا يأخذ 15-20 دقيقة).

4. إعداد لوحات 96 جيد

ملاحظة: لا تستخدم بروتينات الحليب في مخازن يغسل.

  1. إصلاح اللوحة مع الحل تثبيت (0.1 M كربونات الصوديوم): إضافة 300 ميكرولتر / جيد.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة بواسطة هزاز في درجة حرارة الغرفة (RT)، أو أي هزاز في 4 درجات مئوية (O / N).
  3. غسل 3X وحة مع غسل العازلة streptavidin (WB): إضافة 300 ميكرولتر / جيد في كل مرة.
  4. إضافة قليل النوكليوتيد المسمى البيوتين المزدوج تقطعت بهم السبل (مواقع الربط 3 الإجماع في النوكليوتيدات) لمدة 2 ساعة ثإيث هزاز (1.25 نانومول / جيد؛ 100 ميكرولتر / جيد).
  5. غسل 3X مع WB الباردة: إضافة 300 ميكرولتر / جيد ومن ثم عكس فورا لوحة في بالوعة وصمة عار على حواف على منشفة ورقية بعد كل إضافة.

ملاحظة: لا تستخدم نصائح ماصة لإزالة السائل من لوحات لأن هذا قد كشط أفيدين: البيوتين: المجمعات الحمض النووي من الآبار. نفعل ذلك لجميع الخطوات اللاحقة غسل.

5. الحضانة مع استخراج النووية

ملاحظة: لا بديلا أو السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية الرنجة للبولي دي / تيار مستمر عازلة حظر. تجنب عرقلة لوحات مع بروتينات الحليب. كل من هذه العوامل تؤدي إلى عرقلة القيم خلفية عالية.

  1. احتضان مع عامل النسخ محددة أعدت من استخراج النووية (90 ميكرولتر / جيد). إعداد مزيج الرئيسي تحتوي على مستخلص النووي (DNA البروتين ملزمة؛ 3-9 ميكروغرام / جيد) + بولي دي / تيار مستمر (1 ميكروغرام / ميكرولتر من ميكروغرام / شباط الأسهم 50) في الحمض النووي 1X العازلة ملزمة. وحسب الحاجة لحجم العدد الإجمالي للالآبار المطلوبة (90 ميكرولتر / جيد).
  2. أي المانع المحتملة، مثل فيتامين D3 (الشكل 2) أو CADD مجمع 5221975 (الشكل 3)، أو التخفيف المناسبة للتحكم المذيبات، مثل الإيثانول، وأضاف في هذه الخطوة.
  3. مكان وحة على منصة هزاز، O / N عند 4 درجة مئوية.
  4. غسل 3X مع البنك الدولي: إضافة 300 ميكرولتر / جيد

6. إضافة الأجسام المضادة الأولية

ملاحظة: يجب أن تكون مستعدة التخفيفات الأجسام المضادة الأولية الطازجة - لا ينصح التخزين.

  1. تمييع RUNX2 محددة وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (الأسهم 1 ميكروغرام / ميكرولتر) 1/5، 000 في Streptavidin غسل العازلة. إعداد ما يكفي لإضافة إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا (90 ميكرولتر / جيد) في ثلاث نسخ.
  2. احتضان لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
  3. غسل 3X مع البنك الدولي؛ إضافة 300 ميكرولتر / جيد.

7. إضافة الأجسام المضادة الثانوية

ملاحظة: يمكن التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية تكون ستوالأحمر في 4 درجات مئوية خلال الليل إذا لزم الأمر في اليوم التالي.

  1. تمييع F أساسها محددة تقارب تنقيته-HRP الضد مترافق (7.1 ملغ / مل الأسهم) ل1:1،400 في Streptavidin غسل العازلة: العازلة 3.5 ميكرولتر antibody/5.0 غسل مل. إعداد ما يكفي لإضافة إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا (90 ميكرولتر / جيد) في ثلاث نسخ.
  2. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT على منصة هزاز.
  3. غسل 6X مع البنك الدولي من خلال قلب وحة في بالوعة (300 ميكرولتر / جيد).

8. HRP الركيزة وتطوير المنتجات

  1. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة TMB لكل بئر مباشرة من زجاجة الأسهم.
  2. احتضان 10-20 دقيقة في RT في الظلام (توقف طريقة رد فعل) أو قياس الامتصاصية مباشرة (الرصد المستمر الحركية).

9. قياس رد الفعل

  1. وقف أسلوب رد الفعل: رد الفعل لوقف بصرية، تحقق من تغير لونها إلى اللون الأزرق من الواضح ووقف رد الفعل مع 50 ميكرولتر حامض الكبريتيك.
  2. قياس الامتصاصية في 450 نانومتر معالقارئ لوحة مرئية Biotrak الثاني الطيف (أمرشام العلوم البيولوجية؛ GE للرعاية الصحية العلوم البيولوجية كورب بيسكاتواي نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) أو أداة مماثلة.
  3. طريقة الرصد المستمر الحركية: إضافة الركيزة بعد غسل الماضي وقبيل وضع في معمل (لا وقف رد الفعل).
  4. قياس الامتصاصية في 635 نانومتر مع بيو تيك التآزر HT متعدد رد فعل القارئ صفيحة ميكروسكوبية الطيف (بيو تيك الآلات، وشركة؛ ينوسكي، VT، الولايات المتحدة الأمريكية) أو أداة مماثلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

طريقة D-ELISA هو محددة للغاية للبروتين الحمض النووي ملزم المعينة طالما تم استخدام، المزدوج تقطعت بهم السبل قليل النوكليوتيد تسلسل معين يحتوي على ثلاثة نسخ من موقع ملزم RUNX2 الآراء (ACACCA). الأجسام المضادة الأولية الاعتراف عامل البروتين يعزز أيضا خصوصية. يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة تساهميا-الفجل البيروكسيداز (HRP) الذي يحول ركيزة واضحة (ميثيل البنزيدين) إلى منتج ملون لسهولة الكشف عن (الشكل 1). لهذه الأسباب، تحتاج العديد من الضوابط خلفية مهمة ليتم تضمينها في كل لوحة فحص الحمض النووي لضمان محددة ملزمة. وتشمل هذه قياس المنتج اللونية من رد فعل الأجسام المضادة الثانوية HRP في الآبار التي تحتوي على إما (1) لا البروتين النووي، (2) لا الأجسام المضادة الأولية، أو (3) مفتش الماوس غير محددة بدلا من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة. في القياسات الروتينية لدينا، وطرح الضوابط لا البروتين من بروتين معينأعرب الثانية كما صافي ناتج التفاعل. علاوة على ذلك، عند استخدام تصميم الأدوية بمساعدة الحاسوب (CADD) لاكتشاف مركبات ويتم اختبار المخدرات في فحوصات الحمض النووي ملزم، تأثير المذيبات المستخدمة لذوبان يجب تحديد المركبات في آبار منفصلة. عادة، سوف فحص المخدرات تتطلب استخدام المياه، والإيثانول، ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو إلى ذوبان مركبات. يتم اختبار كل من هذه المذيبات بشكل منفصل وعلى تركيزات مناسبة. بعض الشاشات المخدرات حددت المركبات التي يكون لها أثر يذكر على الحمض النووي ملزم، كما هو موضح ليجند مستقبلات فيتامين (د)، 1α ،25-OH فيتامين D3 (الشكل 2). لم هذا المركب لا تمنع الحمض النووي ملزمة حتى في تركيزات أعلى (100 نانومتر إلى 100 ميكرومتر). شاشات المخدرات الأخرى الكشف عن المركبات التي تمنع بروتين: الحمض النووي ملزم (الشكل 3). استنادا إلى تحليل القياسات الحركية وزيادة مبالغ المانع CADD5221975 أدى إلى منحنى تثبيط السيني تعتمد على الجرعة، ثإيث المانع تركيزات أعلى من 10 -3 M تثبيط فعالية الحمض النووي ملزم، في حين أظهرت تركيزات أقل من 10 -11 M تثبيط القليل جدا. كان EC 50 (تركيز الذي المانع تسبب في انخفاض بنسبة 50٪ في ربط RUNX2 لDNA) 10 نانومتر لهذا المركب. وقد نشرت التحليلات الإحصائية لهذا الاختبار سابقا والبساطة، ويظهر بشكل جيد واحد فقط من سلسلة ثلاث نسخ من الآبار في أرقام ممثل 2 و 3.

الشكل 1
الشكل 1. تدفق الرسم البياني للبروتوكول D-ELISA. (أ) عزل البروتينات النووية من خلايا الثدييات. ومجزأة الخلايا تنمو بنسبة تحلل المنظفات وطرق الملح عالية لاستخراج البروتينات المرتبطة بشكل وثيق مع الحمض النووي (B) إعداد دقليل النوكليوتيد الذين تقطعت بهم السبل ouble. وأعدت RUNX2 موقع ACACCAA ملزمة في ثلاث نسخ مع علامة البيوتين في نهاية 3'. (C) إعداد لوحات 96 جيدا. ويتم الحصول على لوحات مع طلاء أفيدين، ولكن يجب أن تكون ثابتة مع ارتفاع درجة الحموضة قبل أن يضيف [أليغنوكليوتيد المسمى البيوتين (D) احتضان مقتطفات النووي مع الحمض النووي. يتم حظر لوحات مع poly-dI/dC غير محددة قبل إضافة استخراج البروتينات النووية. (E) إضافة الأجسام المضادة الأولية. يتم تحضير الأجسام المضادة الطازجة قبل الحضانة مع لوحة (F) إضافة الأجسام المضادة الثانوية. ويتبع الضد الثانوية عن طريق الغسيل واسعة النطاق. (G) إضافة HRP الركيزة وتطوير المنتج. المنتج اللونية مرئيا على طبق من ذهب. (H) قياس الامتصاصية المنتج على معمل. الامتصاصية 450 نانومتر هو إما (وقف رد الفعل) أو 635 نانومتر (المراقبة المستمرة). (I) قراءات مستمرة نموذجية في 635 نانومتر. المعروضة هي رد فعل وبا محددةckground (أي البروتين) يتحكم في ثلاث نسخ.

الرقم 2
الشكل 2. 1α ،25-OH فيتامين D3 له تأثير يذكر على RUNX2 الحمض النووي ملزمة. في هذا المثال ممثل، فيتامين D3 نشطة بيولوجيا، 1α ،25-OH فيتامين D3، ليس له أثر يذكر على RUNX2 الحمض النووي ملزمة. مركبات فيتامين D3 الأخرى، ومع ذلك، يكون لها آثار وخيمة على الحمض النووي ملزم 6.

الرقم 3
الرقم 3. تثبيط الحمض النووي ملزمة RUNX2 المفترضة: المخدرات الحمض النووي النشط في هذا المثال ممثل، وهو مركب التي تم تحديدها من التصميم بمساعدة الكمبيوتر المخدرات (CADD) شاشة أظهرت تثبيط تعتمد على الجرعة من RUNX2 الحمض النووي ملزم من 1 إلى 100 ​​نانومتر ميكرومتر. وقد حسبت تثبيط ملزمة باستخدام أساليب تأسيس 7وأسفرت عن EC 50 (تركيز مثبط التي أسفرت عن تثبيط 50٪ من الحمض النووي ملزمة) من 10 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتستخدم فحوصات الحمض النووي ملزم لقياس قدرة عوامل النسخ للتفاعل مع الحمض النووي. وتشمل فحوصات الحمض النووي ملزمة للتحول الكهربي التنقل (EMSA) 1 وimmuneprecipitation لونين (رقاقة) المقايسات مقرها 3 وكذلك فحوصات توظيف الأشكال 96-4 بشكل جيد مثل فحوصات chemiluminescent 2. وEMSA غير قابلة للكمية ويستخدم رديولبلد (32 P) أليغنوكليوتيد]. يتم تحضين هذه البروتينات النووية مع ويتم فصل المجمعات ملزمة للالاغاروز أو بولي أكريلاميد المواد الهلامية. في المقابل، فإن الكمية D-ELISA قادرة على قياس تفاعل RUNX2 مع تسلسل الحمض النووي ملزم المقابلة لعناصر محددة في المروج RUNX2 الجينات المستهدفة. استخدام الأضداد المضادة للRUNX2 زيادة خصوصية للمقايسة ويميز هذا الاختبار من تحول جل مقايسة التقليدية 5. في حين أن D-ELISA هو فحص في المختبر، ولا يمكن مسح الإشغال المروج في الخلايا الحية،وهو أمر ممكن مع المقايسات رقاقة، ويمكن استخدامه لفحص كميا عن المركبات التي تمنع المجمعات الحمض النووي ملزم. هذه المقايسات تقتصر على التفاعل الحمض النووي وتحاليل لا يمكن التنبؤ بما اذا تنشيط المروج معينة أو قمعها. نهج أخرى، مثل فحوصات مراسل المروج-luciferase المراسل والتي تكون ضرورية لتحديد النشاط النسخي من عامل النسخ محددة.

تم تعديل بروتوكول العام للطريقة D-ELISA وصفها هنا من الطريقة السابقة المستخدمة لقياس نشطة Nfkappa-B 8. يوفر هذا البروتوكول D-ELISA طريقة لقياس كميا البروتين: الحمض النووي ملزمة وهذا هو تسلسل محدد ولا تنطوي على استخدام النشاط الإشعاعي. إذا لزم الأمر، وسرعات رد فعل (V كحد أقصى) يمكن أيضا أن تحسب من رصد حركية مستمرة للتفاعل وهذا قد يوفر التمييز إضافية من مركبات الاختبار 7.

RUNX2 والعامل المساعد لتم العثور ß الاتحاد البرازيلي لتترافق مع أليغنوكليوتيد المسمى البيوتين وبالتالي التأكد من صحتها خصوصية الفحص والتأكيد على أنه من الممكن تحديد العوامل المساعدة التي قد اقترانه عوامل النسخ محددة ملزمة الحمض النووي أيضا. مع رصد حركية مستمرة، ويمكن تمديد الحضانة، وربما تكون هناك حاجة أقل من البروتين النووي للكشف عن تغيرات في الحمض النووي ملزمة. لذلك، من المتوقع أن تكون أكثر حساسية من طرق التفاعل توقف الرصد الحركية. ويشمل تطبيق هام من هذه الطريقة الحركية الكشف عن الأدوية التي تمنع أو تفعيل النسخ عامل الحمض النووي ملزم 6.

وتشمل المشاكل الأخرى المحتملة التي قد تنشأ في تنفيذ الفحص وجود القيم الأساسية عالية. القيم خلفية عالية يمكن أن يكون راجعا إلى: (1) تركيز الأجسام المضادة الثانوية عالية، (2) حجب كافية، (3) استخدام الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية كما مانع، (4) عدم وجود البروتين خطوة الحجب أو (5)الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية مع انخفاض خصوصية. إذا واجهت هذه، العديد من العلاجات الممكنة بما في ذلك: (1) تحسين تركيز الضد الثانوية في الدراسات التجريبية واستخدام أقل حجم الأجسام المضادة لكل بئر، (2) حجب لوحة بمحلول كربونات الصوديوم الأساسية (3) باستخدام دي / تيار ال DNA غير محددة بدلا من الحيوانات المنوية السلمون، والتي قد تحتوي على المروجين مع عناصر ملزمة النسخ، أو (4) باستخدام أزواج مختلفة من الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية من مصادر مختلفة.

من ناحية أخرى، يمكن أن يكون سبب انخفاض قوة الإشارة من قبل (1) كمية قليلة من البروتين المستهدفة، (2) تركيزات الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية ليست الأمثل، (3) الإثارة و / أو انبعاث موجات ليست الأمثل، و( 4) الأجسام المضادة لديهم سوء تقارب للركائز بهم. العديد من العلاجات لهذه المشاكل ما يلي: (1) وكجزء من استكشاف الأخطاء وإصلاحها، يمكن للمرء استخدام 30 ميكرولتر العازلة منخفضة الملح + 30 ميكرولتر العازلة عالية من الملح إذا الخلايا هي أقل جدوىقادرة والنووية عامل النسخ موجود بكميات عالية. أو يمكن للمرء استخدام 90 ميكرولتر العازلة منخفضة الملح + 90 ميكرولتر العازلة منخفضة الملح إذا هي أكثر الخلايا المتاحة. المزيد من الخلايا هي مفيدة عند التعبير عن عامل محدد لفحصها منخفضة. (2) تحسين تركيز الأجسام المضادة الأولية لزيادة إشارة. (3) رصد التصفية على الصك للتأكد من أنها يتم تعيين لإثارة الصحيح وماكسيما الانبعاثات لالركيزة TMB، ويمكن أيضا الفلورسنت بديلة أو ركائز chemiluminescent استخدامها. (4) إذا كانت الأجسام المضادة الأولية هو من انخفاض تقارب، وزيادة وقت الحضانة على لوحة.

من حيث اكتشاف المخدرات، تم استخدام RUNX2 الحمض النووي ملزم ELISA الحالي للكشف عن تعزيز ملزم من البروتين لهدف الحمض النووي والمركبات الطبيعية المحددة (مثل فيتامين D3) التي هي انتقائية جهري من الحمض النووي ملزمة. بعض هذه المركبات تظهر آليات غير التنافسية من العمل وتغيير الوظيفة البيولوجية بما يتفق معتثبيط نموذج بينية 9. مع القرار الأخير من تسلسل الحمض النووي الجيني، يمكن أن تشمل مزيدا من التطبيقات اكتشاف البروتينات الرواية التفاعل مع غير الترميز ("غير المرغوب فيه") DNA، الذي ينظم التعبير عن مناطق الترميز 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

المساعدة التقنية والأجهزة لمرفق مركز Greenebaum السرطان بالحركة الأساسية جامعة ميريلاند، وخصوصا الدكاترة. رينا لابيدوس ومارايولا Sadowska، واعترف بامتنان. وقد تم تمويل هذا العمل المسؤول عن تطوير هذا الاختبار في جزء من المعاهد الوطنية للصحة RO1CA108846، AHA المنح التي تقدم للمساعدة GRNT2130014، جائزة الاستحقاق VA لAP، وجامعة ماريلاند السجائر صناديق الاسترداد (CRF) التي قدمت إلى ومارلين ستيوارت مركز السرطان Greenebaum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter