Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

We ontwikkelden een kwantitatieve DNA-bindende ELISA gebaseerde bepaling om transcriptiefactor interactie met DNA te meten. Hoge specificiteit voor de RUNX2 eiwit werd bereikt met een consensus DNA-herkenning oligonucleotide en specifieke monoklonale antilichaam. Colorimetrische detectie met een enzym-gekoppelde antilichaam substraat reactie werd gevolgd in real time.

Abstract

Vele DNA-bindende assays zoals elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA), chemiluminescente assays, chromatine immunoprecipitatie (ChIP)-gebaseerde testen en multiwell-gebaseerde bepalingen worden gebruikt om transcriptie factor activiteit te meten. Echter, deze tests zijn nonquantitative ontberen specificiteit, kan het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden omvatten, en kunnen niet aangepast voor het screenen van remmers van DNA-binding zijn. Anderzijds, toepassing van een kwantitatieve DNA-bindings-enzyme linked immunosorbent assay (D-ELISA) test tonen we eiwitinteracties kern met DNA met de RUNX2 transcriptiefactor die afhankelijk specifieke associatie met consensus-DNA-bindende sequenties aanwezig biotine- gelabelde oligonucleotiden. Voorbereiding van de cellen, de winning van nucleair eiwit, en het ontwerp van dubbelstrengs oligonucleotiden worden beschreven. Avidine gecoate 96-well platen zijn bevestigd met alkalische buffer en geïncubeerd met nucleaire eiwitten nucleotide blokkeerbuffer. Follwegens uitvoerig wassen van de platen, specifieke primair antilichaam en secundair antilichaam incubaties worden gevolgd door de toevoeging van mierikswortel peroxidase substraat en ontwikkeling van de colorimetrische reactie. Stop reactiewijze of continue kinetische controle werden gebruikt om kwantitatief te meten eiwit interactie met DNA. We bespreken geschikte specificiteit controles, waaronder behandeling met niet-specifiek IgG of eiwit of primaire antilichaam. Toepassingen van de test beschreven onder zijn nut in drug screening en representatieve positieve en negatieve resultaten worden besproken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bindende assays zijn nuttig bij het meten van het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA. Assays voor DNA-binding omvatten elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA) die afhankelijk zijn van radioactief gemerkte oligonucleotiden 1 of chemiluminescentie assays 2. Chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen 3 en bepalingen waarbij 96-well formaat 4 zijn ook beschreven. De EMSA een niet-kwantitatieve test die het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden vereist. Wanneer nucleaire eiwitten associëren met de specifieke nucleotide promoter sequenties, bindende complexen zijn vertraagd op polyacrylamidegelen en de specifieke transcriptiefactor kunnen worden gevalideerd met een antilichaam "supershift". We hebben een kwantitatieve DNA bindingstest met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent formaat (D-ELISA), die in staat is de interactie van RUNX2 meten DNA-bindende sequenties die overeenkomen met bepaalde promoter elementen ontwikkeld in RUNX2 doelwit genen. Gebruik van een anti-RUNX2 antilichaam verschaft specificiteit voor de bepaling en het ontbreken van radiolabel onderscheiden deze assay uit de traditionele gel shift assay 5. Detectie van binding complexen is mogelijk met het gebruik van een secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP), die een HRP substraat tetramethylbenzidine (TMB) wordt omgezet in een gekleurd product voor spectrofotometrische analyse. De test hier vermeld kan het gebruik van gemuteerde DNA-oligonucleotiden als controles opgenomen en kan worden gebruikt voor de detectie van competitieve of niet-competitieve remmers van DNA-binding. Het screenen van nieuwe anti-tumor verbindingen is ook mogelijk met deze assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Verschillende stappen vooruit zijn uitgevoerd tijd en verschillende reagentia bereid en opgeslagen om de procedure: (1) celkweek en eiwitisolatie, (2) bereiden van oligonucleotide (3) bereiding van 96-well platen (4) kernextract incubatie overnacht. Procedure vereist 2 dagen vanwege de overnacht incubatie van nucleair eiwit met DNA-oligonucleotiden.

1. Bereiding van Buffers

1.1 Kern eiwitisolatie

  1. Hypotonische buffer: Aan 100 ml hypotone buffer bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 gl (1 M MgCl2), 333 gl (3 M KCl) 98,3 ml H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl. Voor hypotonische buffer + NP40 (voor gebruik in stap 2.11) Voeg 0,5 ml (10% NP40) 9,5 ml hypotone buffer definitieve 0,5% NP40.
  2. Low Salt Buffer: Aan 100 ml buffer met laag zoutgehalte (voor gebruik in stap 2.15) te bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 gl (1 M MgCl2), 666 gl (3 M KCl), 40 gl (0,5 M EDTA) aan 73 ml H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  3. High Salt Buffer: Aan 100 ml buffer met hoog zoutgehalte (voor gebruik in stap 2.15) te bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 ul (1 M MgCl2), 26.7 ml (3 M KCl), 40 pl (0,5 M EDTA) aan 47 ml H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  4. 10% NP40 Wasmiddel: 10 ml NP40 90 ml H2O
  5. Protease en fosfatase remmers [toegevoegd hypotone buffer + NP40 (stap 2.11), lage zout buffer (stap 2.15), en hoge zout buffer (stap 2.15) juist voor gebruik] Voeg 2,5 gl (1M DTT) en 50 ui proteaseremmers (100x) tot 5 ml van elke buffer voor uiteindelijke concentratie van 0,5 mM DTT en 1 x proteaseremmers. De proteaseremmer 100x voorraad mengsel bestaat uit:natriumfluoride (Ser / Thr, zure fosfatasen), natriumorthovanadaat (Tyr, alkalische fosfatasen), β-glycerofosfaat (Ser / Thr fosfatasen), natriumpyrofosfaat (Ser / Thr fosfatasen), aprotinine (Ser proteasen), Bestatin (amino-peptidasen ), E64 (cysteïne proteasen), leupeptine (Ser / Cys proteasen), EDTA (metalloproteasen).

1.2 Bereiding van assayplaten

  1. Plaat fixeeroplossing: Ter voorbereiding 500 ml oplossing, voeg 5,25 g natriumcarbonaat 500 ml H2O, meng en pH 9,7 voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 M natriumcarbonaat.
  2. Plaat blokkerende oplossing: Om de balans op poly bereiden dI / DC oligonucleotide, resuspendeer 1 Unit (~ 50 mg) van poly dI / DC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 met 1 mM EDTA voor een voorraad concentratie van 50 ug / pl. Stock is verdund tot 1 ug / ul voor gebruik.

1.3 wasbuffers en antilichaam verdunningen

OPMERKING: Streptavidin wash buffer gebruikt om borden te wassen in tussen de toevoegingen en de primaire en secundaire antilichamen verdunnen.

  1. Om 1 liter Streptavidin wasbuffer bereiden, voeg 2,4 g Tris / HCI, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), tot 1 L Millipore-steriel gefiltreerd water , pH 7.18. Bewaren bij 4 ° C. Eindconcentratie: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA bindingsbuffer

Opmerking: Deze buffer wordt bewaard bij -20 ° C.

  1. Ter voorbereiding 15 ml DNA bindingsbuffer, voeg 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 gl (3 M KCl), 12 gl (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 gl (1M DTT), 3,0 ml (60% glycerol), 300 pi (50 pg / ul poly dI / dC) verdund met gedeïoniseerd / gedestilleerd H2O (12 ml). Eindconcentratie: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glycerol, 1 ug / ul poly dI / dC.

2. Cel Cultuur en Nucleaire eiwitisolatie

t "> NB: De bereiding vereist ongeveer 3 uur Stimulatie van cellen zal afhangen experiment Het aantal cellen voor elk experiment zal variëren en alle volumes weerspiegelen een typisch experiment met 3 x 10 7 cellen / bijzondere volumes aanpassen om tegemoet... het aantal cellen daadwerkelijk bij de proef 6.

  1. Nucleaire eiwit te bereiden voor DNA-binding assays, cultuur menselijke cellen dat RUNX2 (endotheel, osteosarcoom, borstkankercellen) uitdrukken in passende media 6.
  2. Behandel subconfluente cellen met nocodazol (0,2 ug / ml gedurende 16 uur) cellen arresteren de G2 / M celcyclus grens 6. Onder deze omstandigheden wordt de RUNX2 eiwit gestabiliseerd en maximaal DNA binding wordt bereikt. Zo hebben kerneiwit beschikbaar voor meerdere assays en remmers worden vergeleken van dezelfde bereiding.
  3. Bij elke stap vooraf koelen centrifuge tot 4 ° C en buffers bereiden en koelen 20 min bij 4 ° C vóór celoogst.
  4. Chill-cellen (4 ° C) en gedrag procedures op ijs.
  5. Centrifugeer cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min in een 15 ml polypropyleen buis met ronde bodem.
  6. Wassen 1x met ijskoude PBS (Ca 2 + en Mg 2 + gratis).
  7. Centrifuge opnieuw en PBS bovenstaande vloeistof.
  8. Voeg 500 ul van hypotone buffer zonder proteaseremmers, let daarbij goed op een volledige resuspensie van de cel pellet.
  9. Transfer inhoud naar een 1,5 ml Eppendorf buis.
  10. Onmiddellijk centrifuge bij 5.500 rpm voor 5,5 min; Verwijder de bovenstaande vloeistof en de cel pellet HOUDEN.
  11. Resuspendeer de celpellet in 500 ui hypotonische buffer die 0,5% NP40. Voeg protease en fosfatase remmers en 0,5 mM DTT (zoals beschreven in stap 1.1.5).
  12. Laat het monster rusten op ijs gedurende 30 minuten.
  13. Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten.
  14. Verwijder het supernatant (bevat de cytosolische eiwitten).
  15. Resuspendeer de nucleaire pellet in 60 ul elk van laag salt buffer (waaraan proteaseremmers en 0,5 mM DTT toegevoegd uit stap 1.1.5) en hoge zout buffer (waaraan proteaseremmers en 0,5 mM DTT toegevoegd uit stap 1.1.5) voor een totaal van 120 pi. Voeg 60 ul buffer met laag zoutgehalte aan de eerste en resuspendeer pellet, voeg 60 pl buffer met hoog zoutgehalte. Vortex de pellet om te helpen bij resuspensie.

OPMERKING: Deze stap helpt zich te ontdoen van een aantal van de membraaneiwitten nucleaire en is opgericht voor de lysisstap: zoutarm eerste (resuspendeer pellet, vortex), dan is een hoog zoutgehalte (vortex) optimaliseert deze stap. Houd extract op ijs gedurende 30 minuten, met vortexen na de eerste 10 minuten.

  1. Centrifugeer bij 12.000 rpm gedurende 15 min., houden de supernatant dat het kerneiwit.
  2. Meet eiwitconcentratie (proberen monsters 2-5 mg / ml te houden), aliquot in geschikte hoeveelheden (10 pl / buis) en bewaar bij -80 ° C.

OPMERKING: Geschatte opbrengst: 30 x 10 6 cells wordt 5 ug / ul eiwit op in 120 pl. 5 x 10 6 cellen 2,2 ug / ul eiwit op in 40 pl.

3. Voorbereiding van Double oligonucleotide

  1. Ontwerp van complementaire oligonucleotiden met compatibele halve plaatsen aan de uiteinden. Voor RUNX2 deze zijn: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotine (sense) en 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotine (antisense).

OPMERKING: Pilot experimenten vastgesteld dat drie RUNX2 bindingsplaatsen en single-end label biotine leverde de meest reproduceerbare resultaten.

  1. Bereid 5x annealing buffer: Voeg 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 pl (1 M MgCl2), 10 gl (1M DTT) aan 260 ui H2O (def 600 pi).
  2. 200 pmol van elk enkelstrengs oligonucleotide (3 ui), voeg 12 pl 5x hybridisatie buffer en 45 ui H2O in totaal 60 pl (200 pmol/60 ui).
  3. Verhit bij 95 ° C gedurende 5-10 minuten in een verwarmingsblok.
  4. Koel af tot 65 ° C langzaam (door het instellen van de temperatuur tot 65 ° C, het duurt 15 min), daarna afkoelen tot kamertemperatuur langzaam door de stroom van de verwarming blok (of door het plaatsen in 50 ml van de 65 ° C water af in een bekerglas op het ijs, dit duurt 15-20 minuten).

4. Bereiding van 96-well platen

OPMERKING: melkeiwitten niet in de wasbuffers.

  1. Fix plaat met bevestigings-oplossing (0,1 M natriumcarbonaat): voeg 300 ul / putje.
  2. Incubeer 2 uur bij schommelen bij kamertemperatuur (RT), of geen schommelen bij 4 ° C (O / N).
  3. Was plaat 3x met streptavidine wasbuffer (WB): voeg 300 ul / putje elke keer.
  4. Add-biotine-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotide (3 consensus bindingsplaatsen per nucleotide) gedurende 2 uur wet schommelen (1,25 nmol / goed; 100 ul / putje).
  5. Wassen 3x met koud WB: voeg 300 ul / putje en dan onmiddellijk keren de plaat in een gootsteen en dep de randen op een papieren handdoek na elke toevoeging.

OPMERKING: Gebruik geen pipet tips om vocht uit de platen te verwijderen, omdat dit avidine kan schrapen: biotine: DNA-complexen uit de putjes. Doe dit voor alle volgende wasbeurt stappen.

5. Incubatie met kernextract

OPMERKING: Gebruik geen vervanging zalm of haring sperma DNA voor de poly dI / DC blokkerende buffer. Vermijd het blokkeren van platen met melkeiwitten. Beide blokkerende middelen resulteren in hoge achtergrondwaarden.

  1. Incubeer met specifieke transcriptiefactor bereid uit kernextract (90 ul / putje). Bereid een master mix die kernmateriaal extract (DNA-bindend eiwit; 3-9 ug / putje) + poly dI / DC (1 ug / ul van een 50 ug / ul voorraad) in 1x DNA-binding buffer. Volume als nodig is voor het totale aantalputten vereist (90 ul / putje).
  2. Alle potentiële remmer, zoals vitamine D3 (Figuur 2) of CADD verbinding 5.221.975 (fig. 3) of de benodigde verdunning van de oplosmiddelcontrole, zoals ethanol, wordt toegevoegd in deze stap.
  3. Plaats plaat op schudplatform, O / N bij 4 ° C.
  4. Wassen 3x met WB: voeg 300 ul / putje

6. Toevoeging van primair antilichaam

OPMERKING: Primaire antilichaam verdunningen moet vers worden bereid - opslag wordt niet aanbevolen.

  1. Verdunnen RUNX2-specifieke monoklonale antilichaam (voorraad 1 ug / ul) 1/5, 000 in Streptavidin wassen buffer. Bereid voldoende voor toevoeging aan elk putje van de plaat met 96 putjes (90 ul / putje) in drievoud.
  2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.
  3. Wassen 3x met WB, voeg 300 ul / putje.

7. Toevoeging van secundair antilichaam

OPMERKING: Secundair antilichaam verdunningen kunnen sto zijnrood bij 4 ° C overnacht eventueel de volgende dag.

  1. Verdun F ab-specifieke affiniteitsgezuiverd-HRP geconjugeerd antilichaam (7,1 mg / ml voorraad) om 1:1,400 in Streptavidin wassen buffer: 3,5 pl antibody/5.0 ml wasbuffer. Bereid voldoende voor toevoeging aan elk putje van de plaat met 96 putjes (90 ul / putje) in drievoud.
  2. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform.
  3. Wash 6x met WB door het omkeren plaat in gootsteen (300 ul / putje).

8. HRP substraat en Product Development

  1. Voeg 50 ul van TMB substraat per putje direct uit voorraad fles.
  2. Incubeer 10-20 minuten bij kamertemperatuur in het donker (halte reactie methode) of direct te meten extinctie (continue kinetische monitoring).

9. Reactie Meting

  1. Stop reactie methode: Voor visuele stop reactie, controleren op kleurverandering van helder naar blauw en stoppen reactie met 50 pi zwavelzuur.
  2. Meet absorptie bij 450 nm metde Biotrak II Visible plaataflezer spectrofotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) of een vergelijkbaar instrument.
  3. Continue kinetische wijze van monitoring: substraat Voeg na de laatste wasbeurt en net voorafgaand aan het plaatsen in de spectrofotometer (niet de reactie te stoppen).
  4. Meet de absorptie bij 635 nm met de Bio-Tek Synergy HT Multi-reactie microplaatlezer spectrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) of een vergelijkbaar instrument.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De D-ELISA methode is zeer specifiek voor de aangegeven DNA-bindingseiwit zolang een sequentie-specifieke dubbelstrengs oligonucleotide dat drie kopieën van de consensus RUNX2 bindingsplaats (ACACCA) gebruikt. Het primaire antilichaam dat het eiwit factor versterkt ook de specificiteit. Het secundaire antilichaam bevat covalent gebonden mierikswortelperoxidase (HRP) dat een duidelijk substraat (tetramethylbenzidine) omgezet in een gekleurd product voor gemakkelijke detectie (fig. 1). Daarom moet een aantal belangrijke achtergrond controles worden in elke testplaat aan specifieke DNA binding waarborgen. Deze omvatten het meten van de colorimetrische product uit het secundaire antilichaam-HRP reactie in putjes bevattende ofwel (1) geen kerneiwit, (2) geen primair antilichaam, of (3) een niet-specifiek IgG in plaats van specifieke monoklonale antilichaam. In onze routine metingen worden de niet-eiwit controles afgetrokken van de specifieke proteïne eennd uitgedrukt als de netto reactie product. Wanneer verder computerondersteund geneesmiddelontwerp (CADD) wordt gebruikt om verbindingen te ontdekken en geneesmiddelen worden getest DNA bindingsassays, het effect van het oplosmiddel wordt gebruikt om de verbindingen oplosbaar moeten in afzonderlijke putjes bepaald. Typisch zal drug screening het gebruik van water, ethanol of dimethylsulfoxide verbindingen oplosbaar vereisen. Elk van deze oplosmiddelen afzonderlijk en op passend geteste concentraties. Sommige drugschermen geïdentificeerde verbindingen met weinig effect op DNA-binding, zoals voor de vitamine D receptor ligand, 1α ,25-OH vitamine D3 (Figuur 2). Deze verbinding remde DNA-bindende zelfs bij hogere concentraties (100 nM en 100 uM). Andere drugschermen gedetecteerd verbindingen die eiwitten remmen: DNA-binding (Figuur 3). Gebaseerd op analyses van kinetische metingen 7, waardoor de hoeveelheden van de CADD5221975 remmer resulteerde in een dosis-afhankelijke remming sigmoïdale curve, wet remmer concentraties boven 10 -3 M effectief remmen DNA-bindende, terwijl concentraties onder 10 -11 M vertoonden weinig remming. De EC50 (concentratie waarbij remmer veroorzaakte een 50% vermindering van de binding van RUNX2 aan DNA) was 10 nM voor deze verbinding. De statistische analyses van deze test zijn eerder gepubliceerd 6 en eenvoudigheidshalve is slechts een putje van een drievoudige reeks putjes getoond in representatieve figuren 2 en 3.

Figuur 1
Figuur 1. Stroomschema van de D-ELISA protocol. (A) Isoleer nucleaire eiwitten van zoogdiercellen. Groeiende cellen worden gefractioneerd door detergent lysis en hoge zout methoden om eiwitten strak geassocieerd met DNA te extraheren. (B) Bereid double oligonucleotide. De RUNX2 bindingsplaats ACACCAA in drievoud bereid met een biotine label aan het 3'-uiteinde. (C) Bereid 96-well platen. Platen worden verkregen met avidine coating, maar moet worden bevestigd met een hoge pH voor het toevoegen van biotine-gelabelde oligonucleotiden. (D) Incubeer kernextracten met het DNA. Platen worden geblokkeerd met niet-specifieke poly-dI/dC voorafgaand aan de toevoeging van het extract eiwitten nucleaire. (E) toevoegen primaire antilichaam. Antilichaam wordt vers bereid voorafgaand aan incubatie met plaat. (F) toevoegen secundair antilichaam. Secundair antilichaam wordt gevolgd door uitgebreid wassen. (G) Toevoegen HRP substraat en de ontwikkeling van het product. Colorimetrische product zichtbaar op de plaat. (H) Meet de absorptie product op een spectrofotometer. Absorptie is ofwel 450 nm (halte reactie) of 635 nm (continu toezicht). (I) Typische continue uitlezing bij 635 nm. Getoond zijn specifieke reactie en background (geen eiwit) regelt in drievoud.

Figuur 2
Figuur 2. 1α ,25-OH vitamine D3 heeft weinig effect op RUNX2 DNA binding. In deze representatieve voorbeeld het biologisch actief vitamine D3, 1α ,25-OH vitamine D3, heeft weinig effect op RUNX2 DNA binding. Andere vitamine D3-verbindingen hebben echter dramatisch effect op DNA-binding 6.

Figuur 3
Figuur 3. Remming van DNA-binding door vermoedelijke RUNX2. DNA geneesmiddel werkzame In dit representatief voorbeeld een verbinding die gekozen is uit een computerondersteund geneesmiddelontwerp (CADD) scherm vertoonde een remming van DNA RUNX2 dosis-afhankelijke binding van 1 nM tot 100 uM. Binding remming werd berekend met behulp van gevestigde methoden 7dit leverde een EC50 (concentratie van remmer die resulteerde in een 50% remming van DNA-binding) van 10 nM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bindende assays worden gebruikt om het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA te meten. Voor DNA binding omvatten elektroforetische mobiliteit verschuiving (EMSA) 1 en chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen 3 en bepalingen waarbij 96-well formaat 4 zoals chemiluminescente assays 2. Het EMSA is niet-kwantitatieve en maakt gebruik van radioactief gemerkt (32 P) oligonucleotiden. Deze worden geïncubeerd met nucleaire eiwitten en bindende complexen worden gescheiden op agarose of polyacrylamide gels. In tegenstelling, de kwantitatieve D-ELISA kan de interactie van RUNX2 meten DNA-bindende sequenties die overeenkomen met bepaalde promoter elementen RUNX2 doelgenen. Het gebruik van een anti-RUNX2 antilichaam verhoogde de specificiteit van de assay en onderscheidt deze assay van de traditionele gel shift assay 5. Hoewel het D-ELISA is een in vitro assay en kan niet overzien promotor bezetting in levende cellen,hetgeen mogelijk ChIP assays, kan het worden gebruikt om kwantitatief screenen op verbindingen die de DNA-bindende complexen remmen. Deze testen zijn beperkt tot DNA-interactie-analyses en kunnen niet voorspellen of een bepaalde promoter wordt geactiveerd of onderdrukt. Verder benaderingen, zoals promotor-luciferase reporter assays, nodig om de transcriptionele activiteit van de specifieke transcriptiefactor definiëren.

Het algemene protocol van de D-ELISA methode beschreven werd aangepast van een eerdere methode actieve Nfkappa-B 8 meten. Deze D-ELISA protocol een werkwijze voor het kwantitatief meten van eiwit: DNA-binding die sequentie-specifiek en het gebruik van radioactiviteit niet gepaard gaat. Indien nodig kan reactiesnelheden (Vmax) ook berekend uit continue kinetische controle van de reactie en kan extra discriminatie van testverbindingen 7 voorzien.

RUNX2 en de cofactorCbf ß bleken geassocieerd met biotine gemerkte oligonucleotiden 6, waardoor de specificiteit van de test te valideren en benadrukt ook dat het mogelijk is cofactoren die kunnen associëren met specifieke DNA-bindende transcriptiefactoren te identificeren. Bij continue kinetische controle, kan incubatie worden uitgebreid en minder kerneiwit nodig zijn om veranderingen in de DNA-binding te detecteren. Daarom wordt kinetische controle wordt gevoeliger dan stop reactie methoden. Een belangrijke toepassing van deze kinetische werkwijze omvat het screenen op geneesmiddelen die transcriptiefactor DNA binding 6 remmen of activeren.

Andere mogelijke problemen die zich kunnen voordoen bij de uitvoering van de test zijn de aanwezigheid van hoge achtergrondwaarden. Hoge achtergrondwaarden kan te wijten zijn aan: (1) hoge concentraties secundaire antilichaam, (2) onvoldoende blokkeren, (3) het gebruik van zalm sperma DNA als blocker, (4) het ontbreken van een blokkerend eiwit stap of (5)primaire of secundaire antilichamen met een lage specificiteit. Als deze worden aangetroffen, verschillende oplossingen mogelijk, waaronder: (1) het optimaliseren van de concentratie van secundaire antilichaam in modelstudies en door minder volume antilichaam per putje, (2) het blokkeren van de plaat met een basische oplossing van natriumcarbonaat (3) met dI / dC als niet-specifieke DNA plaats zalmsperma die promoters met transcriptie bindende elementen, of (4) met verschillende paren primaire of secundaire antilichamen van verschillende bronnen kan bevatten.

Anderzijds kunnen lage signaalsterkte worden veroorzaakt door (1) lage hoeveelheid doelwiteiwit, (2) de concentraties van primaire of secundaire antilichamen niet optimaal, (3) excitatie en / of emissie golflengten niet optimaal, en ( 4) antilichamen slechte affiniteit voor hun substraten. Verschillende oplossingen voor deze problemen zijn: (1) In het kader van het oplossen van problemen, kan men 30 ui laag zout buffer + 30 ui buffer met hoog zoutgehalte gebruiken als minder cellen zijn beschikbaarstaat en de nucleaire transcriptiefactor is aanwezig in grote hoeveelheden. Of men zou kunnen gebruiken 90 ul laag zout buffer + 90 pl laag zout buffer als er meer cellen zijn beschikbaar. Meer cellen zijn bruikbaar bij de expressie van de specifieke factor te beproeven laag. (2) Optimaliseren van de concentratie van primaire antilichaam om het signaal te verhogen. (3) Controleer de filters op het instrument om ervoor te zorgen dat ze zijn ingesteld voor de juiste excitatie en emissie maxima voor de TMB substraat; alternatief fluorescerende of chemiluminescerende substraten kunnen ook worden gebruikt. (4) Als het primaire antilichaam een ​​lage affiniteit, verhoging van de incubatietijd op de plaat.

In termen van het geneesmiddelenonderzoek, heeft de huidige RUNX2 DNA-bindende ELISA werd gebruikt voor het detecteren verhoogde binding van een eiwit aan het DNA-doel en geïdentificeerde natuurlijke verbindingen (zoals vitamine D3) dat selectieve modulatoren DNA binding zijn. Sommige van deze verbindingen vertonen niet-competitieve werkingsmechanismen en veranderen biologische functie in overeenstemming meteen grensvlak remming paradigma 9. Met de recente resolutie van genomisch DNA sequentie kan verder toepassingen omvatten ontdekking van nieuwe eiwitten die interageren met niet-coderende ("junk") DNA, dat expressie van coderende gebieden 10 regelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De technische bijstand en instrumentatie van de Universiteit van Maryland Greenebaum Cancer Center Translationeel Core Facility, vooral Drs. Rena Lapidus en Mariola Sadowska, worden bedankt. Het werk verantwoordelijk voor de ontwikkeling van deze test werd deels gefinancierd door NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, een VA Merit Award uit aan AP, en door de Universiteit van Maryland Cigarette Restitutie Funds (CRF) verstrekt aan de Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter