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Biology

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定:タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。

Abstract

このような電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、化学発光アッセイ、クロマチン免疫沈降法(ChIP)に基づくアッセイ、およびマルチウェルベースの​​アッセイなどの多くのDNA結合アッセイは、転写因子活性を測定するために使用される。しかしながら、これらのアッセイは、非定量的である特異性を欠いている、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を含み得る、DNAおよび結合の阻害剤のスクリーニングに適用可能でなくてもよい。一方、定量的DNA結合酵素結合免疫吸着アッセイ(D-ELISA)アッセイを用いて、我々は、ビオチンに存在するコンセンサスDNA結合配列と特異的会合に依存RUNX2転写因子を用いてDNAを有する核タンパク質相互作用を実証する標識されたオリゴヌクレオチド。細胞は、核タンパク質の抽出、および二本鎖オリゴヌクレオチドの設計の調製が記載されている。アビジン被覆96ウェルプレートを、アルカリ性緩衝液で固定し、ブロッキング緩衝液中のヌクレオチド、核タンパク質と共にインキュベートする。 Follプレートを十分に洗浄するため、特異的一次抗体および二次抗体のインキュベーションは、比色反応の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質及び現像を加えている。反応停止モードまたは連続的動力学的モニタリングを定量的DNAとタンパク質の相互作用を測定するために使用した。我々は、非特異的IgGとまたはタンパク質または一次抗体のない治療を含め、適切な特異性を制御し、議論する。アッセイのアプリケーションは、その薬剤スクリーニングにおける有用性​​と代表の正と負の結果が議論されているなど、記載されている。

Introduction

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DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するのに有用である。 DNA結合のためのアッセイは、放射性標識オリゴヌクレオチドは、1または化学発光アッセイ2に依存する電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を含む。 96ウェルフォーマット4を用いたクロマチンimmuneprecipitation法(ChIP)に基づくアッセイ3ならびにアッセイも記載されている。しかしながら、EMSA、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を必要とする非定量的アッセイである。核タンパク質は、特定のヌクレオチドプロモーター配列と会合する場合、結合複合体は、ポリアクリルアミドゲル上で遅角であり、特定の転写因子は、抗体「スーパーシフト」で検証することができる。我々は定義されたプロモーター要素iに対応するDNA結合配列とRUNX2の相互作用を測定することができる酵素結合免疫吸着フォーマット(D-ELISA)を用いて定量的DNA結合アッセイを開発したn個のRUNX2標的遺伝子。抗RUNX2抗体の使用は、アッセイに特異性を提供し、放射性標識の不足は、伝統的なゲルシフトアッセイ5からこのアッセイを区別する。結合複合体の検出は、分光測光分析のための着色生成物へのHRP基質テトラメチルベンジジン(TMB)を変換する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合された二次抗体を用いて可能である。ここで報告アッセイは、対照として変異したDNAオリゴヌクレオチドの使用を組み込むことができ、DNA結合の競合的又は非競合的阻害剤の検出のために使用することができる。新規な抗腫瘍化合物のスクリーニングは、このアッセイでも可能である。

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Protocol

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いくつかのステップは、前もって実行され、いくつかの試薬は、処置の前に調製され、記憶される:(1)細胞培養およびタンパク質の単離、(2)オリゴヌクレオチドの調製、(3)96ウェルプレートを調製する、(4)核抽出物インキュベーション一晩。手順が原因DNAオリゴヌクレオチドとの核タンパク質の一晩のインキュベーションの2日間を必要とします。

1。バッファーの調製

1.1核タンパク質の分離

  1. 低張緩衝液:98.3ミリリットルのH 2 Oに1ミリリットル(1 M HEPES、pHは7.9)、150μL(1 M MgCl 2)中 、333μL(3 MのKCl)を追加し、低張緩衝液100mlを調製するために最終濃度:10mMのHEPES、1.5mMのMgCl 2、10mMのKCl。低張性緩​​衝液+ NP40(ステップ2.11で使用するため)の場合:9.5ミリリットルに、最終的な0.5%NP40のための低張性緩衝液を0.5ミリリットル(10%NP40)を追加します。
  2. 低塩緩衝液:(ステップ2.15で使用するための)低塩緩衝液100mlを調製するには、1ミリリットル(1 M HEPES、pHは7.9)、25メートルを追加Lグリセロール、73ミリリットルのH 2 Oに150μL(1 M MgCl 2)中、666μL(3 MのKCl)、40μL(0.5M EDTA)最終濃度:10mMのHEPES、25%グリセロール、1.5mMのMgCl 2を 、20のKCl、0.2mMのEDTA。
  3. 高塩緩衝液:(ステップ2.15で使用するための)高塩緩衝液100mlを調製するには、1ミリリットル(1 M HEPES、pHは7.9)、25ミリリットルのグリセロール、150μL(1 M MgCl 2)中 、26.7ミリリットルを追加します(3男塩化カリウム)、47ミリリットルのH 2 Oに40μL(0.5M EDTA)最終濃度:10mMのHEPES、25%グリセロール、1.5のMgCl 2、800のKCl、0.2mMのEDTA。
  4. 10パーセントNP40洗剤:10ミリリットルNP40 90ミリリットルのH 2 O
  5. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤[低張緩衝液に加え+ NP40(ステップ2.11)、低塩緩衝液(ステップ2.15)に、高塩緩衝液に(ステップ2.15)使用直前]:2.5μL(1 M DTT)を追加し、50 0.5mMのDTTおよび1×プロテアーゼ阻害剤の最終濃度は、各緩衝液5mlにプロテアーゼ阻害剤(100倍)を含有した。プロテアーゼ阻害100Xストック混合物が含まれています:フッ化ナトリウム(セリン/スレオニン、酸性ホスファターゼ)、オルトバナジウム酸ナトリウム(Tyrを、アルカリホスファターゼ)、β-グリセロリン酸(セリン/スレオニンホスファターゼ)、ピロリン酸ナトリウム(セリン/スレオニンホスファターゼ)、アプロチニン(セリンプロテアーゼ)、ベスタチン(アミノペプチダーゼ)、E64(システインプロテアーゼ)、ロイペプチン(SER /システインプロテアーゼ)、EDTA(メタロプロテアーゼ)。

1.2アッセイプレートの調製を

  1. プレート定着液:500mlの溶液を調製した500mlのH 2 Oに5.25グラムの炭酸ナトリウムを追加し、よく混合し、0.1 Mの炭酸ナトリウムを最終濃度9.7にpHを調整する。
  2. ソリューション遮光板:株価ポリのdI / DCオリゴヌクレオチドを​​調製するためには、pHが7.9を50μgの/のストック濃度は1 mMのEDTAを含む、10mMトリス/ HClを1ミリリットル中のポリのdI / DCの1号機(〜50 mg)を再懸濁μL。ストックは/μlの使用前に1μgのに希釈する。

1.3洗浄バッファー、抗体希釈液

NOTE:ストレプト洗浄緩衝液である添加の間に、プレートを洗浄し、一次および二次抗体を希釈する。

  1. ストレプトアビジンを洗浄緩衝液1 Lを調製し、2.4グラムトリス/ HCl、37.5ミリリットル(4 M NaCl)を10mlの(10%BSA)を5ml(10%Tween-20)で、1 Lミリポア濾過滅菌水を追加、pHは7.18。 4℃で保存する最終濃度:20mMのトリス/ HCl、150mMのNaCl、0.1%BSA、0.05%のTween-20。

1.4 DNA結合バッファー

注:このバッファは、-20℃で保存する

  1. DNA結合緩衝液15ミリリットルを準備するために、180μL(1 M HEPES、pHは7.9)、300μL(3 MのKCl)、12μL(0.5M EDTA、pH8.0)を、7.5μL(1 M DTT)、3.0ミリリットルを追加蒸留/脱イオンH 2 O(12ml)で希釈した(60%グリセロール)を300μl(50μgの/μlのポリのdI / dCを)。最終濃度:12のHEPES / PH 7.9、60のKCl、0.4mMのEDTA、0.5mMのDTT、12%グリセロール、1μgの/μLポリのdI / DC。

2。細胞培養および核タンパク質の単離

T ">注:準備は約3時間を必要とする細胞の刺激は、実験に依存し、各実験のために使用される細胞の数は変化し、すべてのボリュームが3×10 7細胞/ポイントを使用して典型的な実験を反映し対応するためにボリュームを調整してください。。。実際に、実験6において使用される細胞数。

  1. DNA結合アッセイ、適切な培地中で6 RUNX2(内皮、骨肉腫、乳癌細胞)を発現する培養ヒト細胞について核タンパク質を調製した。
  2. G2 / M細胞周期境界6で細胞を停止させるためにノコダゾール(16時間0.2μg/ ml)をしてフルエント細胞を処理。これらの条件下で、RUNX2タンパク質を安定化し、最大結合DNAが達成される。このように、十分な核タンパク質は、同じ製剤から比較することができ、複数のアッセイおよび阻害剤の使用可能です。
  3. 各ステップについては、4℃に遠心分離を予め冷却して緩衝液を調製し、細胞採取前に4℃で20分間冷やす。
  4. チル細胞(4℃)し、氷上で行動手順。
  5. 15mlのポリプロピレン丸底チューブ内で5分間1,000 rpmで遠心分離細胞。
  6. 氷冷PBSで洗浄1X(Ca 2 +およびMg 2 +を含まない)。
  7. 再び遠心分離し、PBS上清を捨てる。
  8. 完全に細胞ペレットを再懸濁するように注意しながら、プロテアーゼ阻害剤なしで低張緩衝液500μlを追加します。
  9. 1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにコンテンツを転送します。
  10. すぐに5.5分間5,500 rpmで遠心、上清を捨て、細胞ペレットをキープ。
  11. 0.5%NP40を含む低張緩衝液500μl中で細胞ペレットを再懸濁します。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤および0.5mMのDTTを(ステップ1.1.5に記載のように)入れる。
  12. サンプルは30分間氷上で休むことができます。
  13. 10分間13,000 rpmで遠心分離する。
  14. 上清(細胞質ゾルのタンパク質を含む)を廃棄します。
  15. 60μlの低SALの各々における核ペレットを再懸濁120μLの合計(プロテアーゼ阻害剤および0.5mMのDTT、手順1.1.5から追加されたため)、Tバッファと高塩緩衝液(プロテアーゼ阻害剤および0.5mMのDTT、手順1.1.5から追加されたため)。最初にペレットを再懸濁し、低塩緩衝液60μl加え、次いで、高塩緩衝液60μlを加える。再懸濁を支援するために、ペレットをボルテックスする。

注:この手順は、核膜タンパク質のいくつかを取り除くのに役立ちますし、溶解工程のために設定:低塩一(ペレットを再懸濁し、ボルテックス)、次いで、高塩(渦)は、この手順を最適化します。最初の10分後にボルテックスしながら、30分間氷上で抽出しておいてください。

  1. 15分間12,000 rpmで遠心する。核タンパク質を含む上清を保つ。
  2. タンパク質濃度を測定します(2-5 mg / mlのでサンプルを維持しようとする)、-80℃で適切な量(10μL/管)や店舗での分量

注:推定収量:30×10 6セル画LSは、120μlの5μgの/μLタンパク質が得られます。 5×10 6個の細胞を40μlに2.2μgの/μLタンパク質が得られます。

3。二本鎖オリゴヌクレオチドの調製

  1. 両端の互換性のハーフサイトに相補的なオリゴヌクレオチドを​​設計します。 RUNX2のために、これらは、以下のとおりです。5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-ビオチン(センス)および5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-ビオチン(アンチセンス)。

注:3 RUNX2結合部位およびシングルエンドビオチン標識は、最も再現性のある結果が得られたと判断したパイロット実験。

  1. 5Xアニーリング緩衝液を準備します。260μlのH 2 O(最終600μL)に300μL(1 Mトリス塩酸、pH 7.6)、30μL(1 M MgCl 2)中 、10μL(1 M DTT)を追加します。
  2. 各一本鎖oligの200ピコモルへonucleotide(3μL)、60μL(200 pmol/60μL)、合計5倍アニーリング緩衝液12μlの45μlのH 2 Oを加える。
  3. 加熱ブロック内の5〜10分間95℃で加熱する。
  4. 加熱ブロックの電源をオフに(または65℃の水50ml中に配置することにより、徐々に室温に冷却し、ゆっくりと65°C(65°Cまで温度を設定することによって、それが15分を要する)、その後に冷却氷上のビーカー中の、これは15〜20分かかります)。

4。 96ウェルプレートの調製

注:洗浄バッファに乳タンパク質を使用しないでください。

  1. 定着液(0.1M炭酸ナトリウム)でプレートを修正:300μL/ウェルを追加。
  2. 室温(RT)で揺れていない場合、または4°C(O / N)で揺動させ、2時間インキュベートする。
  3. ストレプトアビジン洗浄バッファー(WB)でプレート3回洗浄:300μL/ウェルのたびに追加します。
  4. W 2時間、ビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチド(ヌクレオチドあたり3コンセンサス結合部位)を追加ITH(1.25ナノモル/ウェル;100μl/ウェル)ロッキング。
  5. 冷たいWBで洗浄3Xは:300μL/ウェルを追加してから、すぐに流しにプレートを反転し、各添加後にペーパータオルの上縁を吸い取る。

注:井戸からDNA複合体:ビオチン:これはアビジンをこすり可能性があるプレートから流体を除去するためにピペットチップを使用しないでください。それ以降のすべての洗浄ステップのためにこれを行う。

5。核抽出物とのインキュベーション

注:ポリのdI / DCブロッキングバッファ用のサケやニシン精子DNAを代用しないでください。乳タンパク質でプレートをブロックしないようにしてください。これらのブロッキング剤は、いずれも高いバックグラウンド値になる。

  1. 核抽出物(90μL/ウェル)から調製された特異的な転写因子でインキュベートする。結合緩衝液1X DNA中(50μgの/ ULストックから/μL1μg)を+ポリのdI / DC;核抽出物を含有するマスターミックスを調製(3-9μgの/ウェルのDNA結合タンパク質)。ボリュームは総数のために必要とされる必要なウェル(90μL/ウェル)。
  2. 例えばビタミンD3( 図2)又はCADD化合物5221975( 図3)、又はエタノールなどの溶媒対照、適切に希釈として任意の潜在的な阻害剤は、この工程で添加される。
  3. 4℃でO / N、プラットフォームをロッキングの上に置いてプレート
  4. WBで洗浄3Xは:300μL/ウェルを追加

6。一次抗体を加え

注:一次抗体希釈液を新たに調製する必要がある - ストレージはお勧めしません。

  1. RUNX2特異的モノクローナル抗体(株式1μgの/μL)1/5に希釈する、ストレプトアビジンでの000は、バッファを洗う。三重に(90μlの/ウェル)を96ウェルプレートの各ウェルに添加するために十分に準備する。
  2. ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間インキュベートする。
  3. WBで洗浄3Xは、300μL/ウェルを追加。

7。二次抗体の添加

注:二次抗体希釈はSTO可能4℃で一晩、赤であれば、次の日必要としていました。

  1. ストレプト洗浄緩衝液中で1:1,400に希釈F AB-特異的親和性精製し、HRP結合抗体(7.1 mg / mlのストック):3.5μLantibody/5.0 mlの洗浄バッファー。三重に(90μlの/ウェル)を96ウェルプレートの各ウェルに添加するために十分に準備する。
  2. ロッキングプラットフォーム上で室温で30分間インキュベートする。
  3. シンク(300μL/ウェル)にプレートを反転させてWBで洗浄6X。

8。 HRP基質および製品開発

  1. ストックボトルから直接ウェルあたりTMB基質50μlのを追加します。
  2. 暗闇の中で、室温で10〜20分インキュベートする(反応法を停止)または直接(連続運動モニタリング)の吸光度を測定します。

9。反応測定

  1. 反応方法を停止します。視覚的な停止反応のために、透明から青に色の変化を確認し、50μlの硫酸で反応を停止。
  2. 450 nmの吸光度を測定してバイオトラックII可視プレートリーダー分光光度計(Amersham Biosciences社、GEヘルスケアバイオサイエンス社ピスカタウェイNJ、USA)または類似の器具。
  3. 連続運動監視方法:最後の洗浄後に基板を追加して、直前に、分光光度計に配置する(反応を停止しないでください)​​。
  4. バイオテックシナジーHTマルチ反応マイクロプレートリーダー分光光度計を用いて635 nmの吸光度を測定(バイオテック·インスツルメンツ社、ウィヌースキ、バーモント州、米国)、または類似の楽器。

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Representative Results

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D-ELISA法であれば、コンセンサス結合部位RUNX2(ACACCA)の3つのコピーを含有する配列特異的二本鎖オリゴヌクレオチドが使用されているとして指定DNA結合タンパク質に高度に特異的である。タンパク質因子を認識し、一次抗体は、特異性を向上させます。二次抗体は、検出を容易にします( 図1)の着色生成物に明確な基質(テトラメチルベンジジン)に変換共有結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)が含まれています。これらの理由から、いくつかの重要なバックグラウンドコントロールは、特異的結合DNAを確実にするために各アッセイプレート内に含まれる必要がある。これらは、(1)は核タンパク質、(2)一次抗体なし、または(3)非特異的マウスIgGの代わりに特異的なモノクローナル抗体のいずれかを含有しないウェル中の二次抗体-HRP反応からの生成物を比色測定することを含む。私たちの日常的な測定では、非タンパク質のコントロールは、特定のタンパク質Aから減算されるNDは、ネットの反応生成物として表現。コンピュータ支援薬物設計(CADD)の化合物を発見するために使用され、薬物は、DNA結合アッセイで試験したとき、さらに、化合物を可溶化するために使用される溶媒の効果は、別々のウェルにおいて決定されなければならない。典型的には、薬物スクリーニング、化合物を可溶化するために、水、エタノール、ジメチルスルホキシドの使用を必要とする。これらの溶媒のそれぞれは、別々に適切な濃度で試験する。いくつかの薬物スクリーニングは、ビタミンD受容体リガンド、1α、25-OHビタミンD3( 図2)について示されるように、DNA結合にほとんど影響を及ぼさない化合物を同定した。この化合物は、さらに高濃度(100μMの100 nm)のDNA結合を阻害しなかった。他の薬物スクリーニングは、タンパク質を阻害する化合物を検出:DNA結合( 図3)。動態測定7の分析に基づいて、CADD5221975阻害剤の量を増加させると、用量依存的、シグモイド阻害曲線、重量をもたらした10 -11 M未満の濃度はほとんど阻害を示しながら、ITHは、効果的にDNA結合を阻害する10 -3 M以上の濃度を阻害。 EC 50(DNAへのRUNX2の結合の50%減少を引き起こした阻害する濃度)は、この化合物について10nMであった。このアッセイのための統計分析は、以前に公表されている6と、簡単にするために、三連のウェルの一連の一方のみウェル代表図2および図3に示されている。

図1
図1。 D-ELISAプロトコールのフローチャートを。 (A)は哺乳動物細胞から核タンパク質を分離する。増殖している細胞は、密接に、DNAに関連するタンパク質を抽出するために、界面活性剤溶解および高塩方法により分画している。(B)Dを準備ouble本鎖オリゴヌクレオチド。三重でのサイトACACCAA結合RUNX2は3 '末端にビオチンタグを用いて調製。(C)が 96ウェルプレートを準備している。プレートをアビジンコーティングで得られるが、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを追加する前に、高pHで固定しなければならない。(D)DNAと核抽出物をインキュベートする。プレートを前に、核抽出タンパク質のほかに非特異的poly-dI/dCでブロックする。(E)の一次抗体を追加します。抗体は、前版とのインキュベーションに新たに調製されている。(F)は 、二次抗体を追加します。二次抗体は、十分に洗浄が行われる。(G)は HRP基質を追加し、製品を開発しています。比色製品は、プレート上に表示されている。(H)は 、分光光度計の製品の吸光度を測定します。吸光度を450 nmの(反応を停止)または635 nmの(連続的な監視)のどちらかである。(I)635 nmでの典型的な連続読み出し。特異的反応とのBAも示されているckground(タンパク質なし)は三重に制御します。

図2
図2。 1α、25-OHビタミンD3は、この代表的なでは、 結合RUNX2のDNAにはほとんど影響を与え 、生物学的に活性型ビタミンD3、1α、25-OHビタミンD3は、バインディングのRunx2のDNAにはほとんど影響しない。他のビタミンD 3化合物は、しかし、6結合 DNAに対して劇的な効果を有する。

図3
図3。推定されるRUNX2によってDNA結合の阻害:DNAを活性薬剤は、この代表的な例では、コンピュータ支援薬物設計(CADD)画面から同定された化合物は、1 nMの〜100μMの結合RUNX2 DNAの用量依存的阻害を示した。結合阻害は、確立された方法を用いて算出した7および10nMのEC 50(DNA結合の50%阻害をもたらした阻害剤の濃度)を得た。

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Discussion

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DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するために使用される。 DNA結合のためのアッセイは、電気泳動移動度シフト(EMSA)1およびクロマチンimmuneprecipitation(チップ)に基づくアッセイ3だけでなく、このような化学発光アッセイ2として96ウェルフォーマット4を採用たアッセイが含まれる。 EMSAは、非定量的であり、放射性標識された(32 P)のオリゴヌクレオチドを使用しています。これらは、核タンパク質とインキュベートし、結合複合体は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で分離されています。対照的に、定量的なD-ELISAはRUNX2標的遺伝子で定義されたプロモーターエレメントに対応するDNA結合配列とRUNX2の相互作用を測定することができる。抗RUNX2抗体の使用は、アッセイの特異性を増加させ、従来のゲルシフトアッセイ5から、このアッセイを区別する。 D-ELISAは、in vitroアッセイで、生細胞内でプロモーター占有率を調査することはできませんが、それは、定量的DNA-結合複合体を阻害する化合物をスクリーニングするために使用することができ、ChIP解析が可能である。これらのアッセイは、分析し、特異的プロモーターがアクティブまたは抑制されているかどうかを予測することはできないDNAとの相互作用に限定されている。このようなプロモーター - ルシフェラーゼレポーターアッセイなどのさらなるアプローチは、特定の転写因子の転写活性を規定するために必要である。

ここで説明D-ELISA法の一般的なプロトコルは、アクティブNfkappa B-8を測定するために使用される従来の方法から適合させた。このD-ELISAプロトコルは、タンパク質を定量的に測定する方法を提供し、DNAはそれを結合は配列特異的であり、放射能の使用を含まない。必要であれば、反応速度(V max)は 、反応の連続的な運動モニタから計算することができ、これは、試験化合物7の付加的な識別を提供することができる。

RUNX2とその補因子CBFのß、従ってアッセイの特異性を検証し、また、特定のDNA結合性転写因子に関連付けることがあり補因子を同定することが可能であることを強調し、ビオチン標識オリゴヌクレオチド6と関連することが見出された。連続的な動力学的に監視しながら、インキュベーションを延長することができ、より少ない核タンパク質結合DNAの変化を検出するために必要とされ得る。したがって、動力学的監視は、停止反応法よりも感度が高いことが期待される。この速度論的方法の重要な用途は、6結合性転写因子DNAを阻害または活性化する薬物のスクリーニングを含む。

検定の実行で発生する可能性のある他の可能性のある問題は、高いバックグラウンド値の存在があります。 (2)不十分なブロッキング、ブロッカーとしてサケ精子DNA(3)の使用、タンパク質ブロッキング工程又は(5)(4)の非存在下で、(1)高い二次抗体濃度が高いバックグラウンド値が原因である可能性が低特異性を有する一次または二次抗体。これらが発生した場合、いくつかの救済が可能である含む:(1)パイロット研究において、二次抗体の濃度を最適化し、ウェル当たり抗体低いボリュームを使用して、(2)塩基性炭酸ナトリウム溶液でプレートをブロックし(3)のdIを用い/ dCはむしろ転写結合エレメント、又は(4)異なる供給源からの一次または二次抗体の異なる対を用いてプロモーターを含んでいてもよいサケ精子よりも非特異的DNAである。

一方、低信号強度は、標的タンパク質の(1)少量の、(2)一次または二次抗体の濃度が最適ではない、(3)励起および/または発光波長(最適ではない、とが原因で発生することが4)抗体は、それらの基質に対する乏しい親和性を有する。これらの問題には、いくつかの救済策は以下のとおり少ない細胞が利用されている場合(1)トラブルシューティングの一環として、1は30μlの低塩緩衝液+30μlの高塩緩衝液を使用することができますができ、核転写因子は、高量で存在する。より多くの細胞が利用可能かどうか、1は低塩緩衝液+90μlの低塩緩衝液90μLを使用することができます。試験されるべき特定の因子の発現が低い場合にはより多くの細胞が有用である。 (2)シグナルを増大させるために、一次抗体の濃度を最適化します。 (3)それらはTMB基質の正しい励起及び発光最大値に設定されていることを確認する器具に対するフィルタを監視し、別の蛍光又は化学発光基質を使用することもできる。一次抗体は、低親和性である場合(4)、プレート上のインキュベーション時間を増加させる。

薬物発見の観点から、現在のRUNX2 DNA結合ELISAは、そのDNA標的と結合するDNAの選択的モジュレーターである(例えばビタミンD3など)を同定天然化合物へのタンパク質の結合の増強を検出するために使用されている。これらの化合物のいくつかは、作用の非競合的なメカニズムを示し、と一致する生物学的機能を変化させる界面阻害パラダイム9。ゲノムDNA配列決定の最近の解像度で、さらにアプリケーションがコード領域10の発現を調節する非コード(「ジャンク」)DNAと相互作用する新規タンパク質の発見を含むことができる。

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Disclosures

我々は、開示することは何もありません。

Acknowledgments

メリーランド大学Greenebaumがんセンターのトランスレーショナル基盤施設、特に博士の技術支援および計測。レナLapidusはとMariola Sadowskaは、深く感謝している。このアッセイの開発を担当して作業がAHA費補助金GRNT2130014、APへのVA優秀賞、およびマレーネ·スチュワートに提供メリーランド大学のタバコ反発基金(CRF)により、NIH RO1CA108846によって部分的に資金を供給されたGreenebaumがんセンター。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

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References

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遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定:タンパク質を研究するために、定量的アッセイ
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Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

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