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Biology

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50512
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 3,5
1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Program in Molecular Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, 4Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine, 5Department of Pathology and Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Summary

Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.

Abstract

Muitos ensaios de ligação de ADN, tais como ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), ensaios quimioluminescentes, imunoprecipitação da cromatina (ChIP) à base de ensaios e ensaios baseados em múltiplos poços são usadas para medir a actividade do factor de transcrição. No entanto, estes ensaios são não quantitativa, carecem de especificidade, pode envolver o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente, e pode não ser adaptável para a triagem de inibidores de ligação de ADN. Por outro lado, utilizando uma enzima ligada ao ensaio quantitativo de ligação de ADN imunossorvente (ELISA-D) de ensaio, que demonstram as interacções de proteínas nucleares com ADN, usando o factor de transcrição RUNX2 que dependem associação específica com as sequências de consenso de ligação de ADN presentes em biotina- oligonucleótidos marcados. Preparação de células, a extracção de proteínas nucleares, e concepção de oligonucleótidos de cadeia dupla são descritos. Placas de 96 poços revestidas com avidina foram fixados com tampão alcalino e incubadas com as proteínas nucleares, em tampão de bloqueio de nucleótidos. Folldevido a uma lavagem exaustiva das placas, o anticorpo primário específico e as incubações do anticorpo secundário é seguida pela adição de substrato de peroxidase de rábano e o desenvolvimento da reacção colorimétrica. Modo de reação Parar ou monitoramento contínuo cinética foram usados ​​para medir quantitativamente a interação de proteínas com o DNA. Discute-se controlos adequados de especificidade, incluindo o tratamento com a IgG não específica ou sem proteína ou o anticorpo primário. Aplicações do ensaio encontram-se descritos, incluindo a sua utilidade na triagem de drogas e de resultados positivos e negativos representativos são discutidos.

Introduction

Os ensaios de ligação a DNA têm utilidade na medição da capacidade dos factores de transcrição que interagem com o ADN. Ensaios para DNA de ligação incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) que dependem de oligonucleotídeos radiolabeled 1 ou 2 ensaios de quimiluminescência. Ensaios de cromatina immuneprecipitation (ChIP) com base 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 poços 4 foram também descritas. No entanto, o EMSA é um ensaio quantitativo que não requer o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente. Quando as proteínas nucleares associar com as sequências de nucleótidos de promotores específicos, complexos de ligação são retardados em géis de poliacrilamida e o factor de transcrição específico pode ser validado com um anticorpo "supershift". Nós desenvolvemos um ensaio quantitativo de ligação de ADN utilizando um formato de imunossorvente ligado a enzima (ELISA-D), o qual é capaz de medir a interacção de RUNX2 com sequências de ligação de ADN correspondentes aos elementos promotores definidos igenes alvo n Runx2. Utilização de um anticorpo anti-RUNX2 fornece especificidade para o ensaio e a ausência de marcação radioactiva distinguir este ensaio a partir do teste de deslocamento em gel tradicional 5. Detecção de complexos de ligação é possível com a utilização de um anticorpo secundário acoplado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato de HRP, tetrametilbenzidina (TMB) a um produto de cor para a análise espectrofotométrica. O ensaio aqui relatado pode incorporar a utilização de oligonucleótidos de ADN mutados como controlo e pode ser utilizada para detecção de inibidores competitivos ou não-competitivos da ligação de DNA. O rastreio de compostos anti-tumorais novos também é possível com este ensaio.

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Protocol

Vários passos são realizados antes do tempo e vários reagentes são preparados e armazenados antes do procedimento seguinte: (1) cultura de células e isolamento de proteína, (2) preparação de oligonucleótido, (3) a preparação de placas de 96 poços, (4) o extracto nuclear durante a noite de incubação. Processo requer dois dias, devido à incubação durante a noite das proteínas nucleares com os oligonucleótidos de ADN.

1. Preparação de Amortecedores

1.1 isolamento de proteínas Nuclear

  1. Tampão hipotónico: Para preparar 100 ml de tampão hipotónico, adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl 2), 333 ul (3 M KCl) a 98,3 ml de H 2 O. As concentrações finais: 10 mM de HEPES, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl. Para tampão hipotónico + NP40 (para utilização no passo 2.11): Adicionar 0,5 ml (10% NP40) de 9,5 ml de tampão hipotónico por último NP40 a 0,5%.
  2. Baixo Sal Tampão: Para preparar 100 ml de tampão de sal baixo (para uso na etapa 2.15), adicionar 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl 2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 73 ml de H 2 O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM.
  3. Tampão de sal elevado: Para preparar 100 ml de tampão de elevado teor de sal (para utilização no passo 2.15), adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 47 ml de H 2 O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 800 mM, EDTA 0,2 mM.
  4. 10% de NP40 Detergente: 10 ml de NP40 a 90 ml de H2O
  5. Os inibidores de protease e fosfatase [adicionado ao tampão hipotônico + NP40 (passo 2.11), ao buffer de sal baixo (passo 2.15), e tampão elevado de sal (passo 2.15) pouco antes de usar]: Adicionar 2,5 mL (1 M DTT) e 50 ul de inibidores de protease (100x) de 5 ml de cada tampão para uma concentração final de DTT 0,5 mM e inibidores de protease de 1x. A mistura da pasta de 100x inibidor de protease inclui:fluoreto de sódio (Ser / Thr, fosfatases ácidas), ortovanadato de sódio (Tyr, fosfatase alcalina), β-glicerofosfato (fosfatases Ser / Thr), pirofosfato de sódio (fosfatases Ser / Thr), Aprotinina (Ser proteases), Bestatina (amino-peptidases ), E64 (proteases de cisteína), leupeptina (proteases Ser / Cys), EDTA (metaloproteases).

1.2 Preparação das placas de ensaio

  1. Placa de solução de fixação: Para preparar 500 ml de solução, adiciona-se carbonato de sódio a 5,25 g para 500 ml de H2O, misturar bem e ajustar o pH a 9,7 para uma concentração final de carbonato de sódio 0,1 M.
  2. Placa de solução de bloqueio: Para preparar estoque de poli dI / dC oligonucleótido, ressuspender 1 Unidade (~ 50 mg) de poli dI / dC em 1 ml de 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, contendo EDTA 1 mM para uma concentração de estoque de 50 mg / ul. Banco é diluída para 1 mg / mL antes da utilização.

1,3 buffers de lavagem e diluições de anticorpos

NOTA: tampão de lavagem é Streptavidin utilizada para lavar pratos, entre adições e para diluir os anticorpos primários e secundários.

  1. Para preparar 1 litro de tampão de lavagem de estreptavidina, adicionar 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), a 1 L de água filtrada Millipore estéril , pH 7,18. Armazenar a 4 ° C. As concentrações finais: 20 mM Tris / HCl, NaCl 150 mM, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 tampão de ligação ao DNA

NOTA: Este tampão é armazenado a -20 ° C.

  1. Para preparar 15 ml de tampão de ligação de ADN, adicionar 180 ul (1 M de HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 mL (1 M DTT), 3,0 ml (60% de glicerol), 300 uL (50 ug / mL de poli dI / dC) diluída com água desionizada / destilada H 2 O (12 ml). As concentrações finais: 12 mM HEPES / pH 7,9, KCl 60 mM, EDTA 0,4 mM, DTT 0,5 mM, 12% de glicerol, 1 ug / mL de poli dI / dC.

2. Cultura de Células e Isolamento Proteína Nuclear

t "> NOTA: A preparação requer cerca de 3 horas de estimulação de células dependerá de experiência O número de células utilizadas para cada experiência irá variar e todos os volumes de reflectir uma experiência típica usando 3 x 10 7 células / ponto Ajustar para acomodar volumes... o número de células realmente usado na experiência 6.

  1. Para preparar proteína nuclear para ensaios de ligação de DNA, células humanas de cultura que expressam RUNX2 (endotelial, osteossarcoma, células de câncer de mama) nos meios de comunicação apropriados 6.
  2. Tratamento de células confluentes com nocodazole (0,2 ug / ml para 16 horas), para reter as células na fase G2 / M do ciclo celular 6 fronteira. Sob estas condições, a proteína é estabilizada RUNX2 e ADN ligação máxima é alcançada. Desta forma, a proteína nuclear suficiente disponível para ensaios múltiplos e inibidores podem ser comparados a partir da mesma preparação.
  3. Para cada passo, pré-arrefecer a centrífuga a 4 ° C e preparar tampões e relaxar 20 min a 4 ° C antes da colheita de células.
  4. Células Frio (4 ° C) e procedimentos de conduta no gelo.
  5. Células centrifugar a 1.000 rpm por 5 min em 15 ml de polipropileno tubo de fundo redondo.
  6. Wash 1x com PBS gelado (Ca 2 + e Mg 2 + livre).
  7. Centrifugar novamente e descartar PBS sobrenadante.
  8. Adicionar 500 ul de tampão hipotónico, sem inibidores de protease, tendo o cuidado para ressuspender completamente o sedimento celular.
  9. Transferir o conteúdo para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml.
  10. Centrifugar imediatamente a 5.500 rpm para 5,5 min; desprezar o sobrenadante e manter o pellet celular.
  11. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão hipotónico contendo 0,5% de NP40. Adicionar protease e inibidores de fosfatase e DTT 0,5 mM (conforme descrito no passo 1.1.5).
  12. Deixar a amostra repousar em gelo durante 30 min.
  13. Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min.
  14. Descartar o sobrenadante (contém as proteínas citosólicas).
  15. Ressuspender o sedimento em 60 mL nuclear cada um baixo saltampão T (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) e tampão de elevado teor de sal (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) para um total de 120 ul. Adicionar 60 ul de tampão de baixa salinidade para o sedimento primeiro e ressuspender, em seguida, adicionar 60 ul de tampão de alto teor salino. Vortex a pelota para ajudar na re-suspensão.

NOTA: Este passo ajuda a se livrar de algumas das proteínas da membrana nuclear e configurar para a etapa de lise: baixo teor de sal primeiro (ressuspender pellet, vortex), depois de alta de sal (vórtice) otimiza este passo. Manter extracto em gelo durante 30 min, com agitação em vórtex após os primeiros 10 min.

  1. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min, manter-se o sobrenadante contendo a proteína nuclear.
  2. Medir a concentração de proteína (tentar manter amostras de 2-5 mg / ml), da alíquota em quantidades adequadas (10 mL / tubo) e armazenar a -80 ° C.

NOTA: rendimento estimado: 30 x 10 6 cells irá dar origem a 5 ug / mL de proteína em 120 pi. 5 x 10 6 células irá originar 2,2 ug / mL de proteína em 40 ul.

3. Preparação de Duplo Stranded Oligonucleotídeo

  1. Projete oligonucleotídeos complementares com sites meia compatíveis nas extremidades. Para RUNX2 estes são: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotina (sentido) e 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotina (antisense).

NOTA: As experiências-piloto determinou que três sítios de ligação Runx2 e single-end biotina marcada produziu os resultados mais reprodutíveis.

  1. Preparar tampão de emparelhamento 5x: Adicionar 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 ul (1 M MgCl 2), 10 ul (1 M DTT) a 260 mL de H 2 O (600 mL final).
  2. Para 200 pmol de cada oligo de cadeia simplesonucleotide (3 mL), adicionar 12 ul de tampão de emparelhamento 5x e 45 mL de H 2 O para um total de 60 uL (200 pmol/60 ul).
  3. Aquece-se a 95 ° C durante 5-10 min num bloco de aquecimento.
  4. Arrefecer até 65 ° C lentamente (ajustando a temperatura para 65 ° C, leva-se 15 minutos), depois arrefece-se até à temperatura ambiente lentamente ao desligar a energia do bloco de aquecimento (ou colocando em 50 ml de água a 65 ° C num copo com gelo, o que demora cerca de 15-20 minutos).

4. Preparação de placas de 96 poços

NOTA: Não use proteínas do leite nos buffers de lavagem.

  1. Fix placa com solução de fixação (carbonato de sódio 0,1 M): adicionam-se 300 ul / poço.
  2. Incubar durante 2 horas por balançar à temperatura ambiente (RT), ou sem balançar a 4 ° C (S / N).
  3. Lavar 3x com tampão de lavagem de placa de estreptavidina (WB): adicionam-se 300 ul / poço de cada vez.
  4. Adicionar oligonucleótido de cadeia dupla marcado com biotina (sítios de ligação de consenso por três nucleótidos) durante 2 h wom de balanço (1,25 nmol / poço, 100 uL / ​​poço).
  5. Lavar 3x com frio WB: adicionar 300 mL / poço e depois inverta imediatamente a placa em uma pia e secar as bordas sobre uma toalha de papel após cada adição.

NOTA: Não utilize pontas de pipeta para remover o líquido das placas, pois isso pode raspar avidina: biotina: complexos de DNA de poços. Faça isso para todos os passos de lavagem subsequentes.

5. Incubação com Extrato Nuclear

NOTA: Não substituir salmão ou arenque DNA do esperma para o poli tampão de bloqueio dI / DC. Evite bloquear placas com proteínas do leite. Ambos estes agentes bloqueadores resultar em elevados valores de fundo.

  1. Incubar com fator de transcrição específico à base de extrato nuclear (90 mL / poço). Prepare uma mistura de mestre contendo extrato nuclear (proteína de ligação de DNA; 3-9 mg / poço) tampão + poli dI / DC (1 mg / mL a partir de um estoque de 50 mg / ul) em DNA 1x vinculativo. O volume é tão necessária para o número total depoços necessários (90 ul / poço).
  2. Qualquer inibidor potencial, tais como a vitamina D3 (Figura 2) ou composto CADD 5.221.975 (Figura 3), ou a diluição apropriada do controlo de solvente, tal como etanol, é adicionado neste passo.
  3. Coloque placa de balanço plataforma, O / N a 4 ° C.
  4. Lavar 3x com WB: adicionar 300 uL / ​​poço

6. A adição de primário Anticorpo

NOTA: diluições anticorpo primário deve ser preparado - armazenamento não é recomendado.

  1. Dilui-se o anticorpo monoclonal específico para RUNX2 (estoque 1 mg / mL) 1/5, 000, em tampão de lavagem de estreptavidina. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado.
  2. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
  3. Lavar 3x com WB; adicionar 300 l / poço.

7. A adição de um anticorpo secundário

NOTA: diluições de anticorpos secundários podem ser stovermelho, a 4 ° C durante a noite, se necessário, no dia seguinte.

  1. Diluir F purificada por afinidade, anticorpo conjugado com HRP (7,1 mg / ml) de ab-específica para 1:1,400 em estreptavidina Tampão de lavagem: tampão de 3,5 ul antibody/5.0 ml de lavagem. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado.
  2. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
  3. Wash 6x com WB invertendo a placa em pia (300 mL / poço).

8. HRP Substrato e Desenvolvimento de Produto

  1. Adicionar 50 mL de substrato TMB por poço diretamente do frasco estoque.
  2. Incubar 10-20 minutos à temperatura ambiente no escuro (parar método de reação) ou medir absorção direta (monitoramento cinética contínua).

9. Medição Reaction

  1. Pare método de reação: Para reação parada visual, verificar se há mudança de cor de claro a azul e parar de reação com ácido sulfúrico 50 mL.
  2. Medir a absorvância a 450 nm como Biotrak II espectrofotômetro leitor de placa visível (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, EUA) ou um instrumento similar.
  3. Método cinético contínuo monitoramento: Adicionar substrato após a última lavagem e apenas antes de colocar no espectrofotômetro (não pare a reacção).
  4. Medir a absorvância a 635 nm com o Bio-Tek Synergy HT Multi-reação leitor de microplacas espectrofotômetro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, EUA) ou um instrumento similar.

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Representative Results

O método D-ELISA é altamente específico para a proteína de ligação de ADN designado enquanto, um oligonucleótido específico da sequência de cadeia dupla contendo três cópias do local de ligação de consenso RUNX2 (ACACCA) é usado. O anticorpo primário que reconhece o factor de proteína, também aumenta a especificidade. O anticorpo secundário contém covalentemente ligado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato transparente (tetrametil benzidina) para um produto corado para facilidade de detecção (Figura 1). Por estas razões, vários controlos importantes fundo têm de ser incluídos em cada placa de ensaio para garantir que o ADN de ligação específica. Estes incluem a medição do produto colorimétrico da reacção anticorpo-HRP secundário em poços contendo quer (1) nenhuma proteína nuclear, (2) nenhum anticorpo primário, ou (3) um IgG não específica do rato em vez do anticorpo monoclonal específico. Nas nossas medições de rotina, os controlos não-proteicos são subtraídos a partir da proteína de algumª expresso como produto de reacção net. Além disso, quando a concepção de fármacos assistida por computador (CADD) é utilizado para identificar compostos e os medicamentos são testados em ensaios de ligação a ADN, o efeito do solvente utilizado para solubilizar os compostos deve ser determinada em poços separados. Tipicamente, a selecção da droga irá requerer a utilização de água, etanol, ou dimetilsulfóxido, para solubilizar os compostos. Cada um desses solventes é testado separadamente, e nas concentrações adequadas. Algumas telas droga identificado compostos que têm pouco efeito sobre a ligação de ADN, como mostrado para o ligando do receptor de vitamina D, 1α ,25-OH vitamina D3 (Figura 2). Este composto não inibiu a ligação de DNA, mesmo em concentrações mais elevadas (100 nM a 100 uM). Outros ecrãs de droga detectada compostos que inibem a proteína: ligação de ADN (Figura 3). Com base em análises de medições cinéticas 7, aumentando as quantidades de inibidor CADD5221975 resultaram em, uma curva sigmoidal de inibição, dependente da dose, wom inibidor concentrações acima de 10 ~ 3 M de forma eficaz inibindo a ligação de ADN, enquanto que as concentrações inferiores a 10 -11 M mostrou muito pouca inibição. A EC50 (concentração de inibidor em que causou uma redução de 50% na ligação do RUNX2 de ADN) foi de 10 nM por este composto. As análises estatísticas para este ensaio foram publicados previamente 6 e, para simplificar, apenas uma cavidade de uma série de poços em triplicado é mostrado nas Figuras 2 e 3 representativos.

Figura 1
Figura 1. Fluxograma do protocolo D-ELISA. (A) Isolar as proteínas nucleares a partir de células de mamíferos. As células em crescimento são fraccionados por lise detergente e métodos elevados de sal para extrair proteínas estreitamente associadas com o ADN. (B) Prepara doligonucleotídeo encalhado ouble. O RUNX2 ACACCAA local de ligação em triplicado é preparado com uma etiqueta de biotina na extremidade 3 '. (C) Preparar placas de 96 poços. As placas são obtidas com revestimento avidina, mas tem de ser fixada com um pH elevado, antes de adicionar os oligonucleótidos marcados com biotina. (D) Incubar extractos nucleares com o ADN. As placas são bloqueadas com poly-dI/dC não específica antes da adição de proteínas de extracto nuclear. (E) Adicionar anticorpo primário. Anticorpo é preparada antes da incubação com a placa. (F) Adicionar anticorpo secundário. O anticorpo secundário é seguido por lavagem extensiva. (L) Adicionar substrato de HRP e desenvolver o produto. Produto colorimétrico é visível sobre a placa. (H) Medir a absorvância do produto de um espectrofotómetro. Absorbance é ou 450 nm (parar de reação) ou 635 nm (monitoramento contínuo). (I) leitura contínua típica a 635 nm. São mostrados reação e ba específicockground (sem proteína) controla em triplicado.

Figura 2
Figura 2. 1α ,25-OH vitamina D3 tem pouco efeito no DNA RUNX2 vinculativo. Neste exemplo representativo, a vitamina D3 biologicamente ativos, 1α ,25-OH vitamina D3, tem pouco efeito sobre RUNX2 ligação ao DNA. Outros compostos de vitamina D3, no entanto, ter efeitos dramáticos na ligação de ADN 6.

Figura 3
Figura 3. A inibição da ligação por RUNX2 putativo DNA:. DNA droga ativa Neste exemplo representativo, um composto que foi identificado a partir de um desenho de drogas assistido por computador (CADD) tela exibiu uma inibição dose-dependente de DNA RUNX2 vinculativo a partir de 1 nM a 100 mM. Inibição da ligação foi calculada usando métodos estabelecidos 7e obteve-se uma EC50 (concentração de inibidor que resultou numa inibição de 50% de ligação de ADN) de 10 nM.

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Discussion

Os ensaios de ligação de ADN são usadas para medir a capacidade de factores de transcrição que interagem com o ADN. Os ensaios para a ligação de ADN incluem deslocamento da mobilidade electroforética (EMSA) e 1 immuneprecipitation cromatina (ChIP) Ensaios baseados em 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 cavidades 4 tais como ensaios quimioluminescentes 2. A EMSA não é quantitativa e usa radioativo (32 P) oligonucleotídeos. Estas são incubadas com as proteínas nucleares e complexos de ligação são separados em agarose ou gel de poliacrilamida. Em contraste, a D-ELISA quantitativo é capaz de medir a interacção de RUNX2 com sequências de ligação de ADN que correspondem a elementos do promotor definidas em genes alvos Runx2. A utilização de um anticorpo anti-RUNX2 aumentou a especificidade do ensaio e distingue este ensaio do ensaio de desvio em gel tradicional 5. Enquanto a-D ELISA é um ensaio in vitro, e não podem levantar ocupação promotor em células vivas,que é possível com os ensaios de chip, que pode ser utilizado para rastrear quantitativamente para os compostos que inibem os complexos de ligação de ADN. Estes ensaios estão limitados a interação DNA analisa e não é possível prever se um promotor específico é ativado ou reprimido. Outras abordagens, tais como os ensaios de promotor-luciferase repórter, são necessários para definir a actividade de transcrição do factor de transcrição específico.

O protocolo geral do método D-ELISA descrito aqui foi adaptada a partir de um método anterior usado para medir ativo Nfkappa-B 8. Este protocolo D-ELISA fornece um método para medir quantitativamente a proteína: ligação de ADN que é específico da sequência e não envolve a utilização de radioactividade. Se necessário, as velocidades de reacção (Vmax) também pode ser calculado a partir da monitorização contínua da cinética da reacção e pode proporcionar uma discriminação adicional de compostos de teste 7.

RUNX2 e seu co-factorß CBF foram encontrados para ser associado com os oligonucleótidos marcados com biotina 6, validando assim a especificidade do ensaio, destacando ainda que é possível identificar os cofactores que pode associar com factores de transcrição específicos de ligação de ADN. Com o monitoramento contínuo cinética, a incubação pode ser estendido e menos proteína nuclear podem ser necessários para detectar mudanças no DNA de ligação. Portanto, o monitoramento cinética é esperado para ser mais sensível do que os métodos de reação de parada. Uma importante aplicação do presente método cinético inclui rastreio para drogas que inibem ou activam a transcrição factor de ligação de ADN 6.

Outros problemas possíveis que poderiam surgir na execução do ensaio incluem a presença de elevados níveis de fundo. Os valores elevados de fundo poderia ser devido a: (1) As concentrações de anticorpos secundários elevados, (2) bloqueio insuficiente, (3) o uso de DNA de esperma de salmão como bloqueador (4), a ausência de um passo de bloqueio de proteína ou (5)anticorpos primários ou secundários com baixa especificidade. Se estes forem encontrados, várias soluções são possíveis, incluindo: (1) optimização da concentração de anticorpo secundário em estudos-piloto e usando o menor volume de anticorpo por poço, (2) bloqueando a placa com uma solução básica de carbonato de sódio (3) usando dI / DC como DNA não-específico, em vez de esperma de salmão, que pode conter elementos de ligação com os promotores de transcrição, ou (4), utilizando pares diferentes de anticorpos primários ou secundários a partir de diversas fontes.

Por outro lado, a baixa intensidade do sinal poderiam ser causadas por (1) a baixa quantidade de proteína alvo, (2) as concentrações de anticorpos primários e secundários não são óptimas, (3) de excitação e / ou de emissão de comprimentos de onda não são ideais, e ( 4) Os anticorpos têm fraca afinidade para os seus substratos. Vários remédios para estes problemas incluem: (1) Como parte da solução de problemas, pode-se usar 30 mL de tampão de baixo sal + 30 mL de buffer de alta sal se menos células estão disponíveisfator de transcrição nuclear capaz e está presente em quantidades elevadas. Ou pode-se usar 90 mL de buffer sal baixo + 90 ul de tampão de baixo sal se mais células estão disponíveis. Mais células são úteis quando a expressão do factor específico a ser testado é baixo. (2) Optimização da concentração do anticorpo primário para aumentar o sinal. (3) Monitorar os filtros sobre o instrumento para se certificar de que estão definidas para a excitação correta e máximos de emissão para o substrato TMB; fluorescente alternativa ou substratos quimiluminescentes também pode ser usado. (4) Se o anticorpo primário é de baixa afinidade, aumentar o tempo de incubação na placa.

Em termos de descoberta de drogas, a corrente RUNX2 ELISA de ligação de ADN tem sido utilizada para detectar a ligação aumentada de uma proteína para o seu ADN alvo e compostos naturais identificados (tais como a vitamina D3) que sejam moduladores selectivos do ADN de ligação. Alguns destes compostos apresentam mecanismos não-competitivos de ação e alterar a função biológica de acordo comum paradigma inibição interfacial 9. Com a recente resolução do sequenciamento do DNA genômico, outras aplicações podem incluir a descoberta de novas proteínas que interagem com não-codificante ("junk") de DNA, que regula a expressão de regiões codificantes 10.

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Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgments

A assistência técnica e instrumentação do Mecanismo de Universidade de Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core, especialmente os drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, é altamente apreciada. O trabalho responsável pelo desenvolvimento deste ensaio foi financiado em parte pelo NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, um VA Prémio de Mérito a AP, e pela Universidade de Maryland cigarro fundos de reembolso (CRF), desde a Marlene & Stewart Centro de Câncer Greenebaum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

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References

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Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais
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Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

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