Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En kvantitativ analys för att studera protein: DNA-interaktioner, Discover transkriptionsregulatorer av genuttryck, och identifiera nya antitumörmedel

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

Vi utvecklade en kvantitativ DNA-bindning ELISA-baserad analys för att mäta transkriptionsfaktor interaktion med DNA. Hög specificitet för Runx2 protein uppnåddes med en konsensus-DNA-erkännande oligonukleotiden och specifik monoklonal antikropp. Kolorimetrisk detektion med en enzym-kopplad antikropp substratreaktionen övervakades i realtid.

Abstract

Många DNA-bindande analyser, såsom elektroforetisk mobilitetsförskjutningsanalyser (EMSA), kemiluminescenta analyser, kromatin immunoprecipitation (chip)-baserade analyser och flerbrunnsbaserade analyser används för att mäta transkriptionsfaktoraktivitet. Emellertid har dessa analyser är nonquantitative, saknar specificitet, kan innebära användning av radiomärkta oligonukleotider, och får inte vara anpassningsbar för screening av inhibitorer för DNA-bindning. Å andra sidan, med hjälp av en kvantitativ DNA-bindande enzym-linked immunosorbent assay (D-ELISA)-analys visar vi nukleära protein-interaktioner med DNA genom att använda Runx2 transkriptionsfaktor som beror på specifik association med konsensus-DNA-bindande sekvenser närvarande på biotin- märkta oligonukleotider. Framställning av celler, extraktion av nukleärt protein, och design av dubbelsträngade oligonukleotider som beskrivits. Avidin-belagda 96-brunnsplattor är fasta med alkalisk buffert och inkuberades med nukleära proteiner i nukleotid blockeringsbuffert. Follgrund omfattande tvättning av plattorna, specifik primär antikropp och sekundära inkubationer antikropps följt av tillsats av pepparrotsperoxidas-substrat och utveckling av den kolorimetriska reaktionen. Stopp reaktionssätt eller kontinuerlig kinetisk övervakning användes för att kvantitativt mäta protein interaktion med DNA. Vi diskuterar lämpliga specificitet kontroller, inklusive behandling med icke-specifikt IgG eller utan protein eller primär antikropp. Tillämpningar av analysen är beskrivna inklusive dess användbarhet vid läkemedelsscreening och representativa positiva och negativa resultat diskuteras.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bindningsanalyser vara användbara vid mätning av förmågan hos transkriptionsfaktorer att interagera med DNA. Analyser för DNA-bindande inkluderar elektro mobilitet shift analyser (EMSA) som är beroende av radiomärkta oligonukleotider 1 eller kemiluminescens analyser 2. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserade analyser 3 liksom analyser som utnyttjar 96-brunnars format 4 har också beskrivits. Dock är EMSA en icke-kvantitativ analys som kräver användning av radiomärkta oligonukleotider. När nukleära proteiner associerar med de specifika nukleotid promotorsekvenser, bindande komplex är efterbliven på polyakrylamidgeler och specifika transkriptionsfaktor kan valideras med en antikropp "supershift". Vi har utvecklat en kvantitativ DNA-bindningsanalys med användning av en enzymkopplad immunosorbent-format (D-ELISA), som är i stånd att mäta interaktionen av Runx2 med DNA-bindande sekvenser som motsvarar definierade promotorelement in Runx2 målgener. Användning av en anti-Runx2 antikropp ger specificitet till analysen och avsaknaden av radiomarkör särskilja denna analys från den traditionella gelskiftanalys 5. Detektion av bindningskomplex som är möjligt med användning av en sekundär antikropp kopplad till pepparrotsperoxidas (HRP), som konverterar ett HRP-substrat, tetrametylbensidin (TMB) till en färgad produkt för spektrofotometrisk analys. Analysen rapporteras här kan införliva användningen av muterade DNA-oligonukleotider som kontroller och kan användas för detektion av kompetitiva eller icke-kompetitiva hämmare av DNA-bindning. Screeningen av nya antitumörföreningar är också möjligt med denna analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flera steg utförs i förväg och flera reagens bereds och lagras före förfarandet: (1) cellkultur och proteinisolering, (2) framställning av oligonukleotid, (3) framställning av 96-brunnsplattor (4), kärnextrakt inkubering över natten. Tillvägagångssätt kräver 2 dagar på grund av den över natten inkubation av kärn protein med DNA-oligonukleotider.

1. Beredning av buffertar

1.1 Kärnproteinisolering

  1. Hypoton buffert: För att bereda 100 ml av hypoton buffert, tillsätt 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 | il (1 M MgCl2), 333 | il (3 M KCl) till 98,3 ml H2O Slutkoncentrationer: 10 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl. För Hypoton buffert + NP40 (för användning i steg 2.11): Lägg till 0,5 ml (10% NP40) till 9,5 ml hypoton buffert för slutlig 0,5% NP40.
  2. Buffert med låg salthalt: För framställning av 100 ml av en buffert med låg salthalt (för användning i steg 2,15), tillsätt 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerol, 150 | il (1 M MgCl2), 666 | il (3 M KCl), 40 | il (0,5 M EDTA) till 73 ml H2O Slutliga koncentrationer: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  3. Buffert med hög salthalt: För framställning av 100 ml av en buffert med hög salthalt (för användning i steg 2,15), tillsätt 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 | il (1 M MgCl2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 | il (0,5 M EDTA) till 47 ml H2O Slutliga koncentrationer: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  4. 10% NP40 Detergent: 10 ml NP40 till 90 ml H2O
  5. Proteas och fosfatasinhibitorer [sattes till hypoton buffert + NP40 (steg 2,11), till buffert med låg salthalt (steg 2,15) och buffert med hög salthalt (steg 2,15) precis före användning]: Tillsätt 2,5 | il (1 M DTT) och 50 il av proteashämmare (100x) för att 5 ml av varje buffert för slutlig koncentration av 0,5 mM DTT och 1x proteasinhibitorer. Den proteashämmare 100x lager blandning innehåller:natriumfluorid (Ser / Thr, sura fosfataser), natriumortovanadat (Tyr, alkaliska fosfataser), β-glycerofosfat (Ser / Thr fosfataser), natriumpyrofosfat (Ser / Thr fosfataser), aprotinin (Tj proteaser), Bestatin (amino-peptidaser ), E64 (Cysteinproteaser), Leupeptin (Ser / Cys proteaser), EDTA (metalloproteaser).

1.2 Beredning av analysplattor

  1. Plansch fixeringslösning: För att bereda 500 ml lösning, tillsätt 5,25 g natriumkarbonat till 500 ml H2O, blanda väl och justera pH till 9,7 till en slutlig koncentration av 0,1 M natriumkarbonat.
  2. Plate blockerande lösningen: att förbereda lager poly dl / dC oligonukleotid, resuspendera 1 Unit (~ 50 mg) av poly dl / DC i 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 innehållande 1 mM EDTA för ett lager koncentration av 50 mikrogram / il. Stock späds till 1 ng / | il före användning.

1.3 Tvätta buffertar och spädantikropps

OBSERVERA: Streptavidin tvättbuffert är användes för att tvätta plattorna i mellan tillsatserna och att späda primära och sekundära antikroppar.

  1. För att framställa ett L av Streptavidin tvättbuffert, tillsätt 2,4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20) till en L Millipore-sterilt filtrerat vatten , pH 7,18. Förvaras vid 4 ° C. Slutliga koncentrationer: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA-bindningsbuffert

NOTERA: Denna buffert förvarades vid -20 ° C.

  1. För framställning av 15 ml av DNA-bindningsbuffert, tillsätt 180 | il (1 M HEPES, pH 7,9), 300 | il (3 M KCl), 12 | il (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 | il (1 M DTT), 3,0 ml (60% glycerol), 300 | il (50 | ig / | il poly dI / dC) utspäddes med avjoniserat / destillerat H2O (12 ml). Slutliga koncentrationer: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glycerol, 1 mikrogram / l poly dl / DC.

2. Cell Culture och Nuclear Protein Isolering

t "> OBS: Beredningen kräver ca 3 tim Stimulering av celler beror på experiment Antalet celler som används för varje experiment kommer att variera och alla volymer återspeglar ett typiskt experiment med hjälp av 3 x 10 7 celler / punkt Justera volym för att rymma... antalet celler som faktiskt används i försöket 6.

  1. För att förbereda nukleära protein för DNA-bindningsanalyser, kultur mänskliga celler som uttrycker Runx2 (endotel, osteosarkom, bröstcancerceller) i lämpliga media 6.
  2. Behandla subkonfluenta celler med nokodazol (0,2 | ig / ml under 16 timmar) för att stoppa celler i G2 / M-cellcykelgräns 6. Under dessa betingelser är den Runx2 proteinet stabiliserat och maximal DNA-bindning har uppnåtts. På detta sätt är tillräckligt nukleärt protein tillgängligt för multipla analyser och inhibitorer kan jämföras från samma beredning.
  3. För varje steg i förväg kyla centrifug till 4 ° C och förbereda buffertar och kyla 20 minuter vid 4 ° C före cellskörd.
  4. Chill-celler (4 ° C) och genomföra förfaranden på is.
  5. Centrifugera cellerna vid 1000 rpm under 5 min i en 15 ml polypropylen rundbottnad röret.
  6. Tvätta 1x med iskall PBS (Ca 2 + och Mg 2 + free).
  7. Centrifugera igen och kasta PBS supernatanten.
  8. Lägg till 500 l av hypoton buffert utan proteashämmare, är noga med att helt resuspendera cellpelleten.
  9. Överför innehållet till en 1,5 ml Eppendorf-rör.
  10. Centrifugera omedelbart vid 5500 rpm i 5,5 minuter, kassera supernatanten och BEHÅLL cellpelleten.
  11. Resuspendera cellpelleten i 500 | il av hypoton buffert innehållande 0,5% NP40. Lägg proteas och fosfatasinhibitorer och (såsom beskrivs i steg 1.1.5) 0,5 mM DTT.
  12. Tillåt provet att vila på is under 30 min.
  13. Centrifugera vid 13000 rpm under 10 min.
  14. Kasta bort supernatanten (innehåller de cytosoliska proteiner).
  15. Resuspendera nukleära pelleten i 60 pl vardera låg salT-buffert (till vilken proteasinhibitorer och 0,5 mM DTT har tillsatts från steg 1.1.5) och buffert med hög salthalt (till vilken proteasinhibitorer och 0,5 mM DTT har tillsatts från steg 1.1.5) för en summa av 120 | il. Addera 60 pl av buffert med låg salthalt till pelleten första och återsuspendera, tillsätt sedan 60 ^ il buffert med hög salthalt. Vortexa pelleten för att underlätta resuspension.

OBS: Detta steg hjälper till att bli av med några av de nukleära membranproteiner och ställa upp för lys steg: låg salt först (resuspendera pellet, virvel), då hög salthalt (vortex) optimerar detta steg. Förvara extraktet på is under 30 min, med virvling efter första 10 min.

  1. Centrifugera vid 12000 rpm under 15 min; hålla supernatanten innehållande det nukleära proteinet.
  2. Mät proteinkoncentrationen (försöka hålla prover på 2-5 mg / ml), alikvot i lämpliga mängder (10 pl / rör) och förvara vid -80 ° C.

OBS: Beräknad avkastning: 30 x 10 6 cells kommer att ge 5 mikrogram / l protein i 120 pl. 5 x 10 6 celler kommer att ge 2,2 ug / ul protein i 40 | il.

3. Beredning av Double oligonukleotid

  1. Design komplementära oligonukleotider med kompatibla halvplatser på ändarna. För Runx2 dessa är: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotin (sens) och 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotin (antisens).

OBS: Pilot experiment fastställt att tre Runx2 bindningsställen och singel-end märkt biotin gav de mest reproducerbara resultat.

  1. Förbered 5x pamingsbuffert: Lägg till 300 | il (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 | il (1 M MgCl2), 10 | il (1 M DTT) till 260 | il H2O (slutlig 600 | il).
  2. Till 200 pmol av varje enkelsträngad oligonucleotide (3 | il), tillsätt 12 ul av 5x parningsbuffert och 45 | il H2O under totalt 60 | il (200 pmol/60 pl).
  3. Värm vid 95 ° C under 5 till 10 min i ett värmeblock.
  4. Kyl till 65 ° C långsamt (genom att ställa in temperaturen till 65 ° C, det tar 15 min) och sedan svalna till rumstemperatur långsamt genom att stänga av strömmen till värmeblock (eller genom att placera i 50 ml av 65 ° C vatten i en bägare på is, vilket tar 15 till 20 min).

4. Framställning av 96-brunnsplattor

OBS: Använd inte mjölkproteiner i tvättbuffertar.

  1. Fäst plattan med fixeringslösning (0,1 M natriumkarbonat): add 300 | il / brunn.
  2. Inkubera i 2 h genom att vagga vid rumstemperatur (RT), eller ingen gungande vid 4 ° C (O / N).
  3. Tvätta plattan 3 x med streptavidin tvättbuffert (WB): tillsätt 300 | il / brunn varje gång.
  4. Lägg biotinmärkt dubbelsträngad oligonukleotid (3 konsensusbindningsställen per nukleotid) under 2 h with rocking (1,25 nmol / brunn, 100 pl / brunn).
  5. Tvätta 3x med kallt WB: lägga 300 l / brunn och sedan omedelbart vända plattan i ett handfat och blot kanterna på en pappershandduk efter varje tillsats.

OBS: Använd inte pipettspetsar för att ta bort vätska från plattorna eftersom det kan skrapa avidin: biotin: DNA-komplex från brunnarna. Gör detta för alla efterföljande tvättsteg.

5. Inkubation med Nuclear Extract

OBS: Använd inte ersätta lax eller sill spermie-DNA för poly dl / dC blockerande buffert. Undvik att blockera plattor med mjölkproteiner. Båda dessa blockerande medel resultera i höga bakgrundsvärden.

  1. Inkubera med specifik transkriptionsfaktör ställdes från nukleära extrakt (90 ^ il / brunn). Förbered en huvudblandning som innehåller kärnextrakt (DNA-bindande protein, 3-9 ng / brunn) + poly dl / DC (1 mikrogram / l från 50 ug / ul lager) i 1x DNA-bindande buffert. Volymen som krävs för det totala antaletbrunnar som behövs (90 pl / brunn).
  2. Varje potentiell inhibitor, såsom vitamin D3 (figur 2) eller CADD förening 5.221.975 (Figur 3), eller lämplig utspädning av lösningsmedelskontroll, såsom etanol, tillsätts vid detta steg.
  3. Placera plattan på den svängbara plattformen, O / N vid 4 ° C.
  4. Tvätta 3x med WB: lägga till 300 l / brunn

6. Tillsats av primär antikropp

OBS: Primära antikroppsspädningar bör beredas på nytt - lagring rekommenderas inte.

  1. Späd Runx2-specifik monoklonal antikropp (lager 1 | ig / | il) 1/5, 000 i Streptavidin tvättbuffert. Bered tillräckligt för tillsats till varje brunn i 96-brunnar (90 pl / brunn) i triplikat.
  2. Inkubera under en timme vid RT på en gungande plattform.
  3. Tvätta 3x med WB, lägga till 300 l / brunn.

7. Tillsats av sekundär antikropp

OBSERVERA: Sekundära utspädningar antikropp kan storöd vid 4 ° C över natten om det behövs nästa dag.

  1. Späd F ab-specifika affinitetsrenad-HRP-konjugerad antikropp (7,1 mg / ml lager) till 1:1,400 i Streptavidin tvättbuffert: 3,5 l antibody/5.0 ml tvättbuffert. Bered tillräckligt för tillsats till varje brunn i 96-brunnar (90 pl / brunn) i triplikat.
  2. Inkubera under 30 min vid RT på en vaggande plattform.
  3. Tvätta 6x med WB genom att vända plattan i sink (300 pl / brunn).

8. HRP Substrat och produktutveckling

  1. Tillsätt 50 | il av TMB-substrat per brunn direkt från förrådsflaskan.
  2. Inkubera 10-20 minuter vid rumstemperatur i mörker (stoppreaktionsmetod) eller mät absorbansen direkt (kontinuerlig kinetisk övervakning).

9. Reaktion Mätning

  1. Stoppa reaktionen metod: För visuell stoppreaktion, kontrollera färgförändring från klart till blått och stoppa reaktionen med 50 ^ svavelsyra.
  2. Mät absorbansen vid 450 nm medden Biotrak II Synlig plattläsare spektrofotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) eller ett liknande instrument.
  3. Kontinuerlig kinetisk övervakningsmetod: Lägg substrat efter den sista tvätten och strax innan den placeras i spektrofotometern (inte stoppa reaktionen).
  4. Mät absorbansen vid 635 nm med Bio-Tek Synergy HT Multi-reaktion mikroplattläsare spektrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA) eller ett liknande instrument.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

D-ELISA-metoden är mycket specifikt för den utsedda DNA-bindande proteinet så länge som en sekvensspecifik, dubbelsträngad oligonukleotid innehållande tre kopior av konsensus Runx2 bindningsstället (ACACCA) används. Den primära antikropp som känner igen proteinfaktor ökar också specificiteten. Den sekundära antikroppen innehåller kovalent länkad pepparrotsperoxidas (HRP) som omvandlar ett klart substrat (tetrametylbensidin) till en färgad produkt för att underlätta detektering (figur 1). Av dessa skäl har flera viktiga bakgrundskontroller måste inkluderas i varje analysplatta för att säkerställa specifik DNA-bindning. Dessa omfattar mätning av kolorimetrisk produkt från den sekundära antikropp-HRP-reaktionen i brunnar innehållande antingen (1) ingen nukleärt protein, (2) ingen primär antikropp, eller (3) ett icke-specifikt mus-IgG i stället för den specifika monoklonala antikroppen. I vår rutinmässiga mätningar är de no-protein kontroller subtraheras från det specifika proteinet and uttryckt som nettoreaktionsprodukt. Vidare, när datorstödd läkemedelsdesign (CADD) används för att upptäcka föreningar och droger testas i DNA-bindningsanalyser, effekten av det lösningsmedel som användes för att solubilisera de föreningar som skall bestämmas i separata brunnar. Typiskt kommer läkemedelsscreening kräver användning av vatten, etanol eller dimetylsulfoxid för att solubilisera föreningar. Var och en av dessa lösningsmedel testas separat och vid lämpliga koncentrationer. Vissa läkemedels skärmar identifierat föreningar som har liten effekt på DNA-bindning, såsom visas för vitamin D-receptorligand, 1α ,25-OH-vitamin D3 (figur 2). Denna förening inhiberade inte DNA-bindningen även vid högre koncentrationer (100 nM till 100 | iM). Andra läkemedels skärmar upptäckt substanser som hämmar protein: DNA-bindning (Figur 3). Baserat på analyser av kinetiska mätningar 7, ökande mängderna av CADD5221975 hämmaren resulterade i en dosberoende, sigmoidal hämningskurva, wed hämmare koncentrationer över 10 -3 M effektivt hämmar DNA-bindning, medan koncentrationer under 10 -11 M visade mycket liten hämning. EC 50 (koncentration vid vilken inhibitor orsakade en minskning i bindningen av Runx2 till DNA 50%) var 10 nM för denna förening. De statistiska analyserna för denna analys har publicerats tidigare 6 och för enkelhets skull visas endast en brunn i en triplikat serie av brunnar som visas i representativa figurer 2 och 3.

Figur 1
Figur 1. Flödesschema av D-ELISA-protokollet. (A) Isolera nukleära proteiner från däggdjursceller. Växande celler fraktion av tvättmedel lys och höga salt metoder för att extrahera proteiner tätt förknippade med DNA. (B) Förbered d.ouble oligonukleotid. Den Runx2 bindningsstället ACACCAA i triplikat framställes med en biotin-tag vid 3'-änden. (C) Förbered 96-brunnsplattor. Plattorna som erhölls med avidin ytskikt, men skall vara fäst med högt pH före tillsats av biotin-märkta oligonukleotider. (D) Inkubera nukleära extrakt med DNA. Plattorna blockerades med ospecifik poly-dI/dC före tillsats av nukleärt extrakt proteiner. (E) till primär antikropp. Antikropp framställs färsk före inkubering med plattan. (F) till sekundär antikropp. Sekundär antikropp följt av omfattande tvättning. (G) till HRP-substrat och utveckla produkten. Kolorimetrisk produkten är synlig på plattan. (H) Mät produktens absorbans på en spektrofotometer. Absorbansen är antingen 450 nm (stoppa reaktion) eller 635 nm (kontinuerlig övervakning). (I) Typisk kontinuerlig avläsning vid 635 nm. Visade är specifik reaktion och baBAKGRUND (ingen protein) styr i triplikat.

Figur 2
Figur 2. 1α ,25-OH-vitamin D3 har liten effekt på Runx2 DNA-bindning. I detta representativa exempel den biologiskt aktiva vitamin D3, 1α ,25-OH-vitamin D3, har liten effekt på Runx2 DNA-bindning. Andra vitamin D3-föreningar har emellertid ha dramatiska effekter på DNA-bindning 6.

Figur 3
Figur 3. Hämning av DNA-bindning av förmodad Runx2:. DNA aktivt läkemedel I detta representativt exempel, en förening som identifierades från en datorstödd läkemedelsdesign (CADD) skärmen uppvisade en dosberoende hämning av Runx2 DNA-bindning från 1 nM till 100 ^. Bindande hämning beräknades med hjälp av etablerade metoder 7och gav ett EC50 (koncentration av inhibitor som resulterade i en 50% inhibering av DNA-bindning) av 10 nM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bindande analyser används för att mäta förmågan hos transkriptionsfaktorer att interagera med DNA. Analyser med avseende på DNA-bindnings inkludera elektroforetisk rörlighet skift (EMSA) 1 och kromatin immuneprecipitation (chip) baserade analyser 3 liksom analyser som utnyttjar 96-brunnars format 4 såsom kemiluminiscenta analyser 2. Den EMSA är icke-kvantitativ och använder radioaktivt märkt (32 P) oligonukleotider. Dessa inkuberas med kärnproteiner och bindande komplexen separeras på agaros-eller polyakrylamidgeler. I motsats härtill är det kvantitativa D-ELISA kan mäta interaktionen av Runx2 med DNA-bindande sekvenser som motsvarar definierade promotorelement i Runx2 målgener. Användningen av en anti-Runx2 antikropp ökade analysens specificitet och skiljer denna analys från den traditionella gelskiftanalys 5. Medan D-ELISA är en analys in vitro och kan inte överblicka promotor beläggning i levande celler,vilket är möjligt med ChIP-analyser, kan det användas för att kvantitativt screena för föreningar som hämmar den DNA-bindande komplex. Dessa analyser är begränsade till DNA-interaktion analyser och kan inte förutsäga om en specifik promotor aktiveras eller förträngt. Ytterligare tillvägagångssätt, såsom promotor-luciferas reporter analyser, är nödvändigt att definiera transkriptionsaktivitet i den specifika transkriptionsfaktorn.

Den allmänna protokollet av D-ELISA-metod som beskrivs här var anpassad från en tidigare metod som används för att mäta aktiv Nfkappa-B 8. Denna D-ELISA-protokoll ger en metod för att kvantitativt mäta protein: DNA-bindning som är sekvensspecifika och inte innebär användning av radioaktivitet. Om nödvändigt kan reaktionshastigheter (V max) också beräknas från kontinuerlig kinetisk övervakning av reaktionen, och detta kan ge ytterligare diskriminering av testföreningar 7.

Runx2 och dess kofaktorCBF ß befanns vara associerad med biotinmärkta oligonukleotider 6, vilket stärker analysens specificitet och även betona att det är möjligt att identifiera kofaktorer som kan associera med specifika DNA-bindande transkriptionsfaktorer. Med kontinuerlig kinetisk övervakning, kan inkubering förlängas och mindre kärnprotein kan behövas för att detektera förändringar i DNA-bindning. Därför är kinetisk övervakning förväntas vara känsligare än stoppreaktionsmetoder. En viktig tillämpning av denna kinetiska metod omfattar screening för läkemedel som hämmar eller aktiverar transkriptionsfaktor DNA-bindande 6.

Andra möjliga problem som kan uppstå i utförandet av analysen inkluderar närvaro av höga bakgrundsvärden. Höga bakgrundsvärden kan bero på: (1) höga sekundära antikroppskoncentrationer, (2) otillräcklig blockering, (3) användningen av lax spermiens DNA som blockerare, (4) det saknas en blockerande proteinet steg eller (5)primära eller sekundära antikroppar med låg specificitet. Om dessa påträffas flera åtgärder är möjliga, inklusive: (1) att optimera koncentrationen av sekundär antikropp i pilotstudier och genom att använda lägre volym antikropp per brunn, (2) blockering av plattan med en basisk natriumkarbonat-lösning (3) med hjälp av dl / dC som icke-specifikt DNA i stället för laxsperma, vilken kan innehålla promotorer med transkriptionsbindningselement, eller (4) med användning av olika par av primära eller sekundära antikroppar från olika källor.

Å andra sidan kan låg signalstyrka vara orsakade av (1) låg mängd målprotein, (2) koncentrationen av primära eller sekundära antikroppar som inte är optimala, (3) exciterings-och / eller emissionsvåglängderna är inte optimala, och ( 4) antikroppar har dålig affinitet för deras substrat. Flera lösningar på dessa problem är: (1) Som en del av felsökningen, kan man använda 30 pl lågsaltbuffert + 30 | il högsaltbuffert om färre celler finns tillgängligastånd och den nukleära transkriptionsfaktor förekommer i stora mängder. Eller så kan man använda 90 ^ il buffert med låg salthalt + 90 ^ il buffert med låg salthalt om flera celler är tillgängliga. Flera celler är användbara vid expression av den särskilda faktor som ska testas är lågt. (2) Optimera koncentrationen av primära antikroppen för att öka signal. (3) Övervaka filtren till instrumentet för att se till att de är inställda för korrekt excitation och emissionsmaximum för TMB-substrat, alternativt fluorescerande eller kemiluminiscerande substrat kan också användas. (4) Om den primära antikroppen är av låg affinitet, öka tiden för inkubering på plattan.

När det gäller läkemedelsforskning har den nuvarande Runx2 DNA-bindande ELISA använts för att detektera ökad bindning av ett protein till dess DNA-mål och identifierade naturliga föreningar (såsom vitamin D3) som är selektiva modulatorer av DNA-bindning. Vissa av dessa föreningar uppvisar icke-kompetitiva ningsmekanismer och förändra biologisk funktion i överensstämmelse medett gräns hämning paradigm 9. Med den senaste tidens upplösning genom DNA-sekvensering, kan ytterligare applikationer inkluderar upptäckten av nya proteiner som interagerar med icke-kodande ("skräp") DNA, som reglerar uttrycket av kodande regioner 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Det tekniska stödet och instrumentering vid University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, särskilt Dr. Rena Lapidus och Mariola Sadowska är tacksamma. Verket ansvarar för utvecklingen av denna analys finansierades delvis av NIH RO1CA108846, AHA Grant-i-Stöd GRNT2130014, en VA Merit Award till AP, och vid universitetet i Maryland cigarett Restitution fonderna (CRF) tillhandahålls till Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
En kvantitativ analys för att studera protein: DNA-interaktioner, Discover transkriptionsregulatorer av genuttryck, och identifiera nya antitumörmedel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter