Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

Bu DNA ile transkripsiyon faktörü etkileşimi ölçmek için nicel bir DNA-bağlayıcı ELISA bazlı bir deney geliştirilmiştir. Runx2 protein için yüksek spesifikliği, bir konsensüs DNA tanıma oligonükleotid ve özel bir monoklonal antikor ile elde edilmiştir. Bir enzim-bağlı antikor alt tabaka reaksiyonu ile kolorimetrik tespit gerçek zamanlı olarak izlenmiştir.

Abstract

Örneğin elektroforetik hareketlilik kayma deneyleri (EMSA), kemilüminesan deneyleri, kromatin immünopresipitasyon (çip) dayalı tahliller ve çukurlu bazlı tahliller gibi birçok DNA-bağlama deneyleri, transkripsiyon faktörü aktivitesinin ölçülmesi için kullanılır. Bununla birlikte, bu deneyler, nonquantitative olan özgüllük eksikliği, radyo-etiketli oligonükleotit kullanılmasını içerebilir ve bağlayıcı bir DNA inhibitörlerinin taranması için adapte olmayabilir. Öte yandan, bir sayısal DNA bağlayıcı enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA D-) analizi kullanarak, biyotin-üzerinde mevcut olan konsensüs DNA-bağlayıcı dizileri ile özel bir birlikte bağlıdır Runx2 transkripsiyon faktörü kullanılarak DNA ile nükleer protein etkileşimlerini göstermek etiketli oligonükleotidler. Hücrelerin hazırlanması, nükleer protein ve çift sicimli oligonükleotidlerin tasarım çıkarma açıklanmıştır. Avidin kaplı 96 oyuklu plakalar, alkalin tampon maddesi ile tespit edilmiş ve nükleotid bloke edici tamponu içinde nükleer protein ile inkübe edilir. FollPlakaların geniş yıkama, spesifik birincil antikor ve ikincil antikor inkübasyonlar bağlı kolorimetrik reaksiyonun yaban turpu peroksidaz substrat ve gelişme eklenmesi ile takip edilmektedir. Reaksiyon durdurma modu veya sürekli kinetik izleme kantitatif protein DNA ile etkileşimi ölçmek için kullanıldı. Bu non-spesifik IgG ile ya da protein ya da primer antikor olmadan tedavisi dahil olmak üzere, uygun özgüllük kontroller, tartışır. Analizin Uygulamaları onun uyuşturucu taraması programı ve temsilci olumlu ve olumsuz sonuçlar tartışılmıştır dahil açıklanmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek kullanılabilmektedir. DNA bağlanması için tahliller, radyo-etiketli oligonükleotidler 1 ya da kemiluminesan tahliller 2 bağlıdır elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) içerir. 96 oyuklu biçimleri kullanılarak 4 Kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller 3 hem de deneyler de tarif edilmiştir. Bununla birlikte, radyo-etiketli EMSA oligonükleotitlerin kullanımını gerektirir olmayan bir kantitatif deneyidir. Nükleer proteinler, spesifik nükleotid promotör sekansları ile ortak olduğunda, bağlanma kompleksleri poliakrilamid jelleri üzerinde geciktirilir ve spesifik transkripsiyon faktörü, bir antikor "süperkayma" ile doğrulanabilir. Bu tanımlanan promotör elemanlara tekabül eden DNA-bağlayıcı dizileri ile Runx2 etkileşimini ölçmek mümkün olan bir enzim-bağlı immünosorbent biçimi (D-ELISA) kullanılarak kantitatif bir DNA-bağlama deneyi geliştirdik in Runx2 hedef genler. Bir anti-Runx2 antikorun kullanımı tahlile özgüllük sağlar ve radyo-etiketin yokluğu geleneksel jel kayma deneyi 5 Bu tahlil ayırt eder. Bağlayıcı komplekslerinin tespiti spektrofotometrik analiz için bir renkli ürüne bir HRP alt-tabaka, tetrametil benzimidin (TMB) dönüştürür turp peroksidaz (HRP) bağlı ikinci bir antikorun kullanılması ile mümkündür. Burada bildirilen deney, kontroller olarak mutasyona uğramış DNA oligonükleotitlerin kullanımı dahil olabilir ve bağlayıcı DNA rekabetçi veya rekabetçi olmayan inhibitörleri tespiti için de kullanılabilir. Yeni anti-tümör bileşiklerinin bu deneyde tarama ile de mümkündür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Birkaç adım vaktinden önce yapılmaktadır ve çok sayıda reaktif önce prosedüre benzer bir şekilde depolanmıştır: (1) bir hücre kültürü ve protein izolasyon, (2) oligonükleotid hazırlanması, (3) 96-yuvalı plakaların hazırlanması, (4) çekirdek özütü inkübasyon gece boyunca karıştırılmıştır. Prosedür, çünkü DNA oligonükleotidler ile nükleer protein gece boyunca inkübasyon 2 gün gerektirir.

1.. Tamponlar hazırlanması

1,1 Nükleer protein izolasyon

  1. Hipotonik Tamponu: hipotonik tampon 100 ml hazırlamak için, 98.3 ml H2O için 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 150 ul (1 M MgCI2), 333 ul (3 M KCl) ekleyin Nihai konsantrasyonlar: 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI. Hipotonik tamponu + NP40 (adım 2.11 kullanım için) için: son% 0.5 NP40 için 9.5 ml hipotonik tampon maddesi ile 0.5 ml (10% NP-40) eklenir.
  2. Düşük tuz tamponu: (adım 2.15 kullanım için) düşük tuz tamponu 100 ml hazırlamak için, 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 m eklemekl gliserol, 150 ul (1 M MgCI2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0.5 M EDTA) 73 ml H2O için Nihai konsantrasyonu: 10 mM HEPES,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCI2, 20 mM KCI, 0.2 mM EDTA.
  3. Yüksek tuzlu tampon (adım 2.15 kullanım için) yüksek tuz tamponu 100 ml hazırlamak için, 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml gliserol, 150 ul (1 M MgCI2), 26.7 ml eklemek (3 M KCl), 40 ul (0.5 M EDTA) 47 ml H2O için Nihai konsantrasyonu: 10 mM HEPES,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCI2, 800 mM KCI, 0.2 mM EDTA.
  4. 10% NP-40 deterjan: 10 ml NP40 90 mi H 2'ye O
  5. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri [hipotonik tampon ilave + NP40 (aşama 2.11), düşük tuzlu tampon (aşama 2.15) için ve yüksek tuzlu tampon (basamak 2.15) kullanımdan hemen önce]: 2.5 ul (1 M DTT) ilave edin ve 50 0.5 mM DTT ve 1 x proteaz inhibitörlerinin son konsantrasyon için, her 5 ml tampon ile proteaz inhibitörlerinin (100x) arasında ul. Proteaz inhibitörü 100x kanşımı içerir:Sodyum flüorür (Ser / Thr, asit fosfatazlar), sodyum ortovanadat (Tyr, alkalin fosfatazlar), β-gliserofosfat (Ser / Thr fosfatazlar), sodyum pirofosfat (Ser / Thr fosfatazlar), Aprotinin (Ser proteazlar), bestatin (amino-peptidazlar ), E64 (Sistein proteazlar), Löpeptin (Ser / Cys proteazlar), EDTA (metaloproteazlar).

Deney plakası 1.2 hazırlanması

  1. Levha sabitleme çözeltisi: çözeltisi 500 ml hazırlanması 500 ml H2O için 5.25 g sodyum karbonat eklenir, iyice karıştırılır ve 0.1 M sodyum karbonat, son konsantrasyon için 9,7 pH'ı ayarlamak için.
  2. Levha bloke etme çözeltisi: stok hazırlamak için poli dI / akım oligonükleotid, tekrar süspansiyon 1 Birim (~ 50 mg), poli dI / akım 1 ila 10 mM Tris / HCl, 50 ug 'lik bir stok konsantrasyonu için 1 mM EDTA içeren pH 7.9 ml / ul. Hazır 1 ug / ul kullanımı önce seyreltilir.

1.3 Yıkama tampon ve antikor seyreltileri

NOT: Streptavidin yıkama tamponu, eklemeler arasında plakalar yıkama ve birincil ve ikincil antikorlar sulandırmak için kullanılır.

  1. Streptavidin yıkama tamponu 1 L hazırlamak için, 2.4 g Tris / HCl, 37.5 ml (4 M NaCl), 10 ml (% 10 BSA), 5 ml (% 10 Tween-20), 1 L Millipore Steril süzüldü, su ekle , pH 7.18. 4 ° C'de saklayın Nihai konsantrasyon: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl,% 0.1 BSA,% 0.05 Tween-20.

1.4 DNA-bağlama tamponu

NOT: Bu tampon -20 ° C'de saklanır

  1. DNA bağlama tamponu 15 ml hazırlamak için, 180 ul (1 M HEPES, pH 7.9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 ul (1 M DTT), 3.0 ml eklemek (% 60 gliserol), 300 ul (50 ug / ml poli dI / dC) / distile deiyonize H2O (12 mi) ile seyreltildi. Nihai konsantrasyon 12 mM HEPES / pH 7.9, 60 mM KCI, 0.4 mM EDTA, 0.5 mM DTT,% 12 gliserol, 1 mg / ml poli dI / akım.

2. Hücre Kültürü ve Nükleer Protein İzolasyonu

t "> Not:.. Preparat her deney için kullanılan hücre sayısı değişir hücrelerin uyarılması deney bağlıdır yaklaşık 3 saat gerektirir ve tüm miktarlar 3 x 10 7 hücre / noktasını kullanan tipik bir deney yansıtmak karşılamak için miktarlar ayarlayın. aslında deneyde 6 da kullanılan hücre sayısı.

  1. DNA bağlama deneylerinde, uygun ortam 6 Runx2 (endotel, osteosarkom, meme kanseri hücreleri) eksprese kültür insan hücrelerinde nükleer protein hazırlamak.
  2. G2 / M hücre siklüs sınır 6 hücrelere tutuklama nokodazol (16 saat süre ile 0.2 ug / ml) ile birlikte akan hücreler tedavi. Bu koşullar altında, Runx2 protein stabilize edilir ve bağlayıcı maksimal DNA elde edilir. Birden çok deneyler ve inhibitörler aynı preparattan karşılaştırılabilir Bu şekilde, yeterli nükleer protein kullanılabilir.
  3. Her bir aşama için, 4 ° C'ye kadar santrifüj öncesi serin ve tampon hazırlanması ve hücre hasattan önce 4 ° C'de 20 dakika soğuk.
  4. Chill hücreleri (4 ° C) ve buz üzerinde davranış prosedürleri.
  5. Bir 15 ml polipropilen yuvarlak dipli bir tüp içinde 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj hücreleri.
  6. Buz soğukluğunda PBS ile yıkayın 1x (Ca 2 + ve Mg2 + içermez).
  7. Tekrar santrifüj ve PBS süpernatant atın.
  8. Tamamen hücre pelletini için dikkatli olmak, proteaz inhibitörleri olmadan hipotonik tampon 500 ul ekleyin.
  9. Bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın.
  10. Hemen 5.5 dakika boyunca 5,500 rpm'de santrifüj, süpernatant atmak ve hücre pelet TUTUN.
  11. % 0.5 NP40 içeren hipotonik tampon maddesinin 500 ul hücre pelletini. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ve 0.5 mM DTT (aşama 1.1.5 tarif edildiği gibi) ilave edin.
  12. Numune, 30 dakika boyunca buz üzerinde dinlenmeye bırakın.
  13. 10 dakika boyunca 13,000 rpm'de santrifüje.
  14. Süpernatant (sitosolik proteinler içerir) atın.
  15. 60 ul düşük sal her nükleer pelletinit tamponu (ki proteaz inhibitörleri ve 0.5 mM DTT 1.1.5 ikinci aşama eklenmiştir) ve 120 ul bir toplam yüksek tuz tamponu (ki proteaz inhibitörleri ve 0.5 mM DTT 1.1.5 ikinci aşama eklenmiştir). Birinci ve pelet tekrar süspansiyon düşük tuz tamponu 60 ul, daha sonra yüksek tuz tamponu 60 ul ekle. Yeniden süspansiyon yardımcı olmak için pelet vorteksleyin.

Not: Bu adım nükleer membran proteinlerinin bazı kurtulmak yardımcı olur ve parçalama adım için yukarı ayarlayın: Düşük tuz Önce (tekrar süspansiyon pelet, vorteks), sonra yüksek tuz (vorteks) bu adımı optimize eder. İlk 10 dakika sonra vorteks ile, 30 dakika boyunca buz üzerinde özü tutun.

  1. 15 dakika için 12,000 rpm'de santrifüj, nükleer protein içeren süpernatant tutun.
  2. -80 ° C'de protein konsantrasyonu (2-5 mg / ml 'de örnekleri tutmaya çalışın), uygun miktarlarda (10 ul / tüp) içinde alikosunu ve mağaza ölçün

NOT: Tahmini verim: 30 x 10 6 cells 120 ul içinde 5 ug / ml bir protein elde edecektir. 5 x 10 6 hücre 40 ul 2.2 ug / ml bir protein elde edecektir.

3. Çift kollu bir oligonükleotit, hazırlanması

  1. Uçlarında uyumlu yarım siteleri ile tamamlayan oligonükleotidler tasarlayın. Runx2 için bunlar: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3 '-Biotin (duyu) ve 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-Biotin (antisens).

NOT: Üç Runx2 bağlanma siteleri ve tek uç etiketli biyotin en tekrarlanabilir sonuçlar vermiştir tespit Pilot deneyler.

  1. 5x tavlama tamponu hazırlayın: 260 ul H2O (son 600 ul) 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7.6), 30 ul (1 M MgCI2), 10 ul (1 M DTT) ilave edin.
  2. Her bir tek şeritli oligo 200 pmol içinonucleotide (3 ul), 5x bağlanma tampon maddesi 12 ul ve 60 ul (200 pmol/60 ul), toplam 45 ul H2O ekleyin.
  3. Bir ısıtma bloğu içinde 5-10 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın.
  4. 65 ° 'ye soğutulup yavaşça ısıtma bloğu (ya da 65 ° C 50 ml su içinde yerleştirilmesi ile gücünü kapatarak yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar soğutulur, daha sonra (65 ° C sıcaklığının ayarlanması ile, bu 15 dk) C buz üzerinde bir çanak içinde, bu), 15-20 dakika sürer.

4. 96 oyuklu plakaların hazırlanması

NOT: yıkama tamponlar süt proteinleri kullanmayın.

  1. Sabitleme çözeltisi (0.1 M sodyum karbonat) ile plaka saptamak: 300 ul / yuva ekleyin.
  2. Oda sıcaklığında (RT), sallanan ya da 4 ° C (O / N) ile sallanan ile 2 saat boyunca inkübe edilir.
  3. Streptavidin yıkama tamponu (WB) ile plaka 3x yıkayın: 300 ul / kuyu her zaman eklemek.
  4. W 2 saat için biotin-etiketli çift şeritli oligonükleotid (nükleotid başına 3 konsensüs bağlanma yerleri) eklemeith (1.25 nmol / çukur, 100 ul / oyuk) sallanan.
  5. Soğuk WB ile yıkayın 3x: 300 ul / yuva ekleyin ve hemen ardından bir lavabo içine plaka ters çevirin ve her eklemeden sonra bir kağıt havlu üzerinde kenarları leke.

NOT: Bu avidini kazımak olabilir plakalardan sıvıyı çıkarmak için pipet uçları kullanmayın: biotin: kuyulardan DNA kompleksleri. Sonraki tüm yıkama adımlar için bunu yapın.

5. Nükleer Extract ile inkübasyon

NOT: poli dl / akım engelleme tampon için somon veya ringa sperm DNA yerine koymayın. Süt proteinleri ile plakaları engelleme kaçının. Bu bloke edici maddelerin her ikisi de, yüksek bir zemin değerlerine neden olur.

  1. Nükleer ekstrakt (90 ul / kuyucuk) hazırlanabilir transkripsiyon faktörü ile inkübe edin. Nükleer ekstre içeren bir ana karışım hazırlayın (DNA bağlama proteini, 3-9 ug / çukur) + poli dI / akım 1x DNA (50 ug / ul stok 1 mg / ml) bağlama tamponu. Hacim olarak toplam sayısı için gereklidirGerekli kuyular (90 ul / kuyucuk).
  2. Vitamin D3 (Şekil 2) veya CADD bileşik 5221975 (Şekil 3), ya da etanol gibi bir çözücü kontrolü, uygun seyreltme gibi herhangi bir potansiyel önleyicisi, bu aşamada eklenir.
  3. 4 ° C'de O / N, bir platform üzerinde sallanan plaka
  4. WB ile 3x yıkayın: 300 ul / kuyu eklemek

6. Primer antikor ilavesi

NOT: Primer antikor sulandırmalar taze olarak hazırlanması gerekir - depolama tavsiye edilmez.

  1. Runx2-spesifik monoklonal antikor (1 ug / ul), 1/5, 000 Streptavidin yıkama tamponu ile seyreltilir. 96 oyuklu plaka (90 ul / kuyucuk), üç kopya halinde her bir oyuğuna ilave edilmesi için yeterli hazırlayın.
  2. Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  3. WB ile 3x yıkayın; 300 ul / kuyu ekleyin.

7. İkincil antikor ilavesi

NOT: İkincil antikor sulandırmalar sto olabilirertesi gün gerektiğinde gece boyunca 4 ° C'de kırmızı.

  1. Streptavidin içinde 1:1,400 F ab özgü afinite ile saflaştırılmış-HRP konjuge antikor (7.1 mg / ml stok) seyreltin yıkama tamponu: 3.5 ul antibody/5.0 ml yıkama tamponu. 96 oyuklu plaka (90 ul / kuyucuk), üç kopya halinde her bir oyuğuna ilave edilmesi için yeterli hazırlayın.
  2. Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Lavabonun (300 ul / kuyucuk) içine plakayı baş aşağı çevirerek WB ile yıkayın 6x.

8. HRP Yüzey ve Ürün Geliştirme

  1. Stok şişeden de doğrudan başına TMB substratı 50 ul ekleyin.
  2. Karanlıkta oda sıcaklığında 10-20 dakika inkübe (reaksiyonu yöntemi durdurmak) veya doğrudan (sürekli kinetik izleme) absorbans ölçmek.

9. Reaksiyon Ölçümü

  1. Reaksiyonu yöntemi Dur: Görsel durdurma reaksiyonu için mavi, açık renk değişimi kontrol ve 50 ul sülfürik asit ile reaksiyonu durdurun.
  2. 450 nm'de emilimi ölçünBiotrak II görünen plaka okuyucu spektrofotometre (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway, NJ, USA) ya da benzer bir alet.
  3. Sürekli kinetik izleme yöntemi: son yıkamadan sonra tabakayı ekleyin ve hemen önce spektrofotometre yerleştirme için (tepki bitmiyor).
  4. Bio-Tek Synergy HT Çoklu Reaksiyon mikroplaka okuyucu spektrofotometre ile 635 nm'de absorbansı ölçülür (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, ABD) ya da benzer bir alet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

D-ELISA yöntemi sürece Runx2 konsensüs bağlanma sitesi (ACACCA) üç kopyasını içeren bir diziye özgü, çift sarmal kollu oligonükleotit kullanılan olarak belirlenmiş DNA-bağlama proteini için son derece özeldir. Protein faktörü tanıma birincil antikor özgünlüğünü ayrıca artırır. İkincil antikor, saptama kolaylığı (Şekil 1) için bir renkli ürüne açık bir alt-tabaka (tetrametil benzidin) dönüştürür kovalent olarak-bağlanmış yaban turpu peroksidazı (HRP) içerir. Bu nedenlerden dolayı, birçok önemli plan kontrolleri, spesifik DNA bağlama özelliklerini sağlamak için her bir deney plakası dahil edilmesi gerekir. Bunlar: (1) nükleer protein, (2) ve birincil antikor veya (3) spesifik olmayan bir fare IgG yerine, spesifik monoklonal bir antikor ya da içeren tüpler içinde ikincil antikor-HRP reaksiyonundan kolorimetrik ürünün ölçülmesi bulunmaktadır. Rutin ölçümlerde, herhangi bir-protein kumanda spesifik protein A'dan çıkartılırnd net reaksiyon ürünü olarak ifade edilir. Bilgisayar destekli ilaç tasarımı (CADD) bileşiklerin keşfedilmesi için kullanılan ilaçlar ve DNA bağlanma deneylerinde test edilir Bundan başka, çözücünün etkisi bileşikler ayrı kuyularda tespit edilmelidir çözünür hale getirmek için kullanılır. Tipik olarak, ilaç tarama bileşiklerinin çözündürülmesi için bir su, etanol, ya da dimetil sülfoksit kullanılmasını gerektirecektir. Bu çözücülerin her biri ayrı ayrı ve uygun konsantrasyonlarda test edilir. Bazı ilaç ekranlar vitamin D reseptörü ligandı için gösterildiği gibi (Şekil 2) ,25-OH vitamin D3 1α, DNA bağlanması üzerinde küçük bir etkiye sahip olan bileşikleri tespit edilmiştir. Bu bileşik, daha yüksek konsantrasyonlarda (100 uM ila 100 nM) ile bağlanma DNA önlemedi. Diğer ilaç ekranlar proteinini inhibe eden bileşikleri tespit: DNA bağlanması (Şekil 3). CADD5221975 inhibitörün artan miktarları kinetik ölçümleri 7 analizleri, w doza-bağımlı inhibisyonu, sigmoidal eğri sonuçlandı göre10 -11 M konsantrasyon altında, çok az inhibisyon gösterdi sahip olan, etkili bir şekilde bağlanmasını inhibe eden 10 DNA -3 M yukarıda konsantrasyonlarda inhibitör. EC 50 (DNA'ya Runx2 bağlanmasını% 50'lik bir azalmaya neden olan inhibitör konsantrasyon) Bu bileşik için 10 nM idi. Bu deney için istatistiksel analizleri, daha önce 6 yayınlanmış ve basitlik için, kuyu, üçlü serisinin sadece bir de temsili, Şekil 2 ve 3 'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. D-ELISA protokolü akış şeması. (A), memeli hücrelerinde nükleer proteinler izole edin. Büyüyen hücreler deterjan liziz ve sıkı bir DNA ile ilgili proteinler elde etmek için yüksek tuz yöntemlerle parçalara ayrılır. (B) d hazırlayınouble şeritli oligonükleotid. Üç kez Runx2 bağlama sahası ACACCAA 3'-ucunda bir biyotin etiketi ile hazırlanır. (C), 96 oyuklu plakalar hazırlayın. Plakalar avidin kaplama ile elde edilir, ancak biotin-etiketli oligonükleotidler eklemeden önce yüksek pH ile sabitlenmelidir. (D) DNA ile nükleer özler inkübe edin. Plakalar önceki nükleer ekstre protein ilavesinden spesifik olmayan poly-dI/dC ile bloke edilir. (E) birincil antikor ekleyin. Antikor önce levha ile kuluçkaya bırakılmaya karşı taze hazırlanır. (F) ikinci antikor ekleyin. İkincil antikor, geniş bir yıkama işlemi takip etmektedir. (G) HRP substratı ilave edin ve ürün geliştirmek. Kolorimetrik ürün plaka üzerinde görülebilir. (H) bir spektrofotometre ile ürün absorbansı ölçülür. Absorbans 450 nm (reaksiyonu durdurmak) veya 635 nm (sürekli izleme) olur. (I) 635 nm tipik sürekli okuma. Özel reaksiyon ve ba vardır Gösterildickground (herhangi bir protein), üç kopya halinde kontrol eder.

Şekil 2,
Şekil 2. 1α ,25-OH vitamin D3 Bu temsili örnekte. Bağlayıcı Runx2 DNA üzerinde çok az etkiye sahiptir, biyolojik olarak etkin vitamin D3, 1α ,25-OH vitamin D3, bağlayıcı Runx2 DNA üzerinde çok az bir etkiye sahiptir. Diğer vitamin D3 bileşiklerinin, ancak, 6, DNA bağlama üzerinde dramatik etkileri vardır.

Şekil 3,
Şekil 3,. Farazi Runx2 ile DNA bağlanması inhibisyonu:. DNA, aktif ilaç için temsili Bu örnekte, bir bilgisayar destekli ilaç tasarımı (CADD) ekranından tanımlanan bir bileşiği, 1 nM ila 100 uM bağlanabilen Runx2 DNA doza bağımlı inhibisyonunu sergiledi. Bağlanma inhibisyon geliştirilmiş olan yöntemler kullanılarak hesaplanmıştır 7ve 10 nM düzeyinde bir EC50 (bağlayıcı DNA bir% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır inhibitör konsantrasyonu) bulunmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek için kullanılır. DNA bağlanması için tahliller, elektroforetik mobilite kaydırma (EMSA) 1 ve kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller, 3 ve 96 oyuklu formatları bu chemiluminescent 2 ile 4 kullanan tahliller bulunmaktadır. EMSA olmayan nicel ve radyo-etiketli (32 P) oligonükleotitler kullanılır. Bu, nükleer protein ile inkübe edilir ve bağlayıcı kompleksleri agaroz ya da poliakrilamid jelleri üzerinde ayrılırlar. Bunun aksine, nicel D-ELISA Runx2 hedef genlerin tanımlanmış promotör elemanlara tekabül eden DNA-bağlayıcı dizileri ile Runx2 etkileşimini ölçmek edebilmektedir. Bir anti-Runx2 antikorun kullanılması tahlilinin özgüllüğü artmış ve geleneksel jel kayma deneyi 5 Bu tahlil ayırır. D-ELISA, bir in vitro deneydir ve canlı hücrelerde promoter doluluk anket değil de,yonga deneyi ile mümkündür ki, bu nicel olarak DNA-bağlanma kompleksleri inhibe eden bileşiklerin taranması için kullanılabilir. Bu deneyler analiz eder ve belirli bir aktif promoter ya da bastırılmış olup olmadığını tahmin edemez DNA etkileşim ile sınırlıdır. Böyle promotör-lusiferaz raportör tahlilleri gibi başka yaklaşımlar, spesifik transkripsiyon faktörünün transkripsiyon aktivitesini tanımlamak için gereklidir.

Burada açıklanan D-ELISA yöntemi genel protokolü aktif Nfkappa-B 8 ölçmek için kullanılan bir önceki yöntemde uyarlanmıştır. Bu D-ELISA protokolü kantitatif protein ölçmek için bir yöntem sağlar: bu DNA dizisidir-özeldir ve radyoaktivite, işlevsel değildir bağlayıcı. Gerekirse, reaksiyon hızı (V max), aynı zamanda, reaksiyonun kinetik kontrolü sürekli hesaplanabilir ve bu test bileşiklerinin 7 arasında ek bir ayrım sağlayabilir.

Runx2 ve kofaktörCBF ß böylece tahlilinin özgüllüğü doğrulama ve aynı zamanda özel bir DNA bağlayıcı transkripsiyon faktörleri ile ortak olabilir kofaktörleri tespit etmek mümkün olduğu vurgulayan, biyotin-etiketli oligonükleotidler 6 ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Sürekli kinetik izleme ile inkübasyon uzatılabilir ve daha az nükleer protein bağlayıcı DNA değişiklikleri tespit etmek için gerekli olabilir. Bu nedenle, kinetik izleme reaksiyon durdurma yöntemlerine göre daha duyarlı olması bekleniyor. Bu kinetik yönteminin önemli bir uygulaması 6 bağlanma transkripsiyon faktörü DNA inhibe ya da aktif hale getirmek için ilaç tarama içerir.

Tahlil yürütülmesinde ortaya çıkabilecek diğer olası sorunları yüksek fon değerlerinin varlığını içerir. (1) yüksek ikincil antikor konsantrasyonları, (2) yeterli engelleme, (3) bloke edici olarak somon sperm DNA kullanılması, (4) bir bloke edici protein aşama ya da (5) 'in yokluğu: High arka plan değerleri nedeniyle olabilirDüşük bir spesifisite göstermekle birlikte, birincil ya da ikincil antikorlar. (1) bir pilot çalışmalarda ikincil antikor konsantrasyonunun optimize edilmesi ve oyuk başına antikorun daha düşük hacmi kullanılarak, (2) bir bazik sodyum karbonat çözeltisi ile bloke plaka (3) ile, di /: Bu karşılaşılan, çeşitli ilaçlar dahil olmak üzere, mümkün dC daha çok transkripsiyon bağlama elemanları, ya da (4), farklı kaynaklardan gelen birincil ya da ikincil antikor farklı çiftlerini kullanarak promotörleri içerebilir somon sperm, daha spesifik olmayan DNA olarak.

Diğer yandan, düşük sinyal gücü hedef proteinin (1) düşük bir miktarda, (2) birincil ya da ikincil antikor konsantrasyonları uygun değildir, (3), uyarma ve / veya emisyon dalga boyu (optimal değildir ve kaynaklanabilir 4) antikorları da alt-tabakalar için zayıf bir afiniteye sahiptirler. Bu sorunlara çeşitli ilaçlar şunlardır: daha az hücre fayda vardır eğer (1) sorun giderme parçası olarak, bir 30 ul düşük tuz tamponu + 30 ul yüksek tuz tampon kullanabilirsinizedebilmek ve nükleer kopyalama faktörü olan yüksek miktarlarda mevcuttur. Daha fazla hücre olup olmadığını ya da bir düşük tuz tamponu + 90 ul düşük tuz tampon 90 ul kullanabilirsiniz. Test edilecek olan belirli bir faktörün ifadesi düşük olduğunda, daha fazla hücreler yararlıdır. (2) bir sinyal geliştirmek için birincil antikor konsantrasyonunun optimize. (3) bunlar TMB alt-tabaka için doğru eksitasyon ve emisyon maxima için ayarlanır emin olmak için aletin üzerindeki filtreler Monitör, alternatif flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren alt tabakalar da kullanılabilmektedir. Birincil antikor, düşük afinite ise, (4), plaka üzerinde kuluçkalama süresi artar.

Ilaç keşfi açısından, mevcut Runx2 DNA bağlayıcı ELISA ile DNA hedef ve bağlayıcı DNA seçici modülatörleri olarak (örneğin, D3 vitamini gibi) belirlenen doğal bileşiklere bir proteinin bağlanma özelliği tespit etmek için kullanılmıştır. Bu bileşiklerin bazıları, eylem rekabetçi olmayan mekanizmaları sergiler ve tutarlı bir biyolojik işlevini değiştirebilirBir ara yüz inhibisyon paradigma 9. Genomik DNA sekanslama son çözünürlüğe sahip olan başka uygulamalar kodlama bölgeleri 10 ifadesini düzenleyen kodlayıcı olmayan ("çöp") DNA ile etkileşen proteinlerin keşfi yeni dahil olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Teknik yardım ve University of Maryland Greenebaum Kanser Merkezi Translational Core Tesisleri'nde, özellikle Dr enstrümantasyon. Rena Lapidus ve Mariola SADOWSKA, müteĢekkiriz. Bu testin geliştirilmesi için sorumlu çalışma NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, AP bir VA Merit Ödülü, tarafından ve Maryland Sigara İade Fonlarının Üniversitesi (CRF) Marlene & Stewart sağlanan tarafından kısmen finanse edildi Greenebaum Kanser Merkezi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter