Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

Her beskriver vi en protokol til optogenetic manipulation af motoneuronal aktivitet, mens overvågning af ændringer i motoreffekt (muskelsammentrækning) i semi-intakte

Abstract

Drosophila larver bevægelse er en flot model-system i udviklings-og fysiologiske neurovidenskab, som følge af den genetiske tilgængeligheden af de underliggende neuronale komponenter i kredsløb 1-6. Anvendelse af optogenetics 7,8 i larvestadiet neurale kredsløb giver os mulighed for at manipulere neuronal aktivitet i rumligt og tidsligt mønstrede måder 9-13. Typisk prøver bredt belyst med en kviksølv lampe eller LED er så specificitet af de målrettede neuroner kontrolleret af binære genekspressionssystemer såsom Gal4-UAS systemet 14,15. I dette arbejde, at forbedre den rumlige opløsning til "sub-genetisk opløsning", vi lokalt belyst en delmængde af neuroner i det ventrale nerve ledning med laser gennemføres i en konventionel konfokal mikroskop. Mens du lytter til bevægelse af kroppen væg semi-intakte larver, vi interaktivt aktiveres eller hæmmede neurale aktivitet med channelrhodopsin 16,17 or halorhodopsin 18-20, hhv. Ved rumligt og tidsligt begrænset belysning af nervevæv, kan vi manipulere aktiviteten af ​​specifikke neuroner i kredsløbet på en specifik fase af adfærd. Denne metode er nyttig til at studere sammenhængen mellem aktiviteterne i en lokal neural forsamling i den ventrale nerve ledning og den Spatiotemporal mønster af motorens output.

Introduction

Forward peristaltisk bevægelse i Drosophila larver sker ved udbredelsen af muskelsammentrækning fra posterior til anterior segmenter. Denne bevægelse realiseres ved sekventiel aktivering af motoriske neuroner i det ventrale nerve ledningen langs den langsgående krop akse. For at undersøge kredsløbet bag denne mønstrede formeringsmateriale aktivitet kunne lokal forstyrrelse af neurale aktivitet være en informativ tilgang. Selvom farmakologisk assay kan styre specifikke stof, såsom neurotransmittere i nervevæv, kan effekten af ​​farmakologiske lægemidler være ens blandt de næsten alle segmenter, fordi larve ventrale nerve ledning er gentagne struktur bestående af lignende neuromeres langs længdeaksen. Alternativt kan man udtrykke optogenetic eller temperaturfølsomme probemolekyler i et lille antal segmenter. Imidlertid sådanne særlige GAL4 linjer er meget vanskelige at uddrage. Her præsenterer vi en metode til at manipulere neuroner i et par segmenter anvender laserbelysning. At drage fordel af det rumligt begrænset belysning i konfokal mikroskopi, kan man forstyrre aktiviteten af ​​neuroner i et lokalt område. Kombineret med ekspressionsmønsteret af sonden ved delmængder af neuron-specifikke Gal4 linjer, stærkt denne laserbelysning metode forbedrer den rumlige opløsning for forstyrrelse. Og fordi denne metode kræver kun en konventionel konfokal mikroskop, indkøb af ekstra laboratorieudstyr er typisk ikke nødvendig.

Ved hjælp af denne teknik, undersøgte vi den rolle motor neuronal aktivitet i udbredelsen af motoreffekt 13. Ved at blokere aktiviteterne i motoriske neuroner inden for et par segmenter under peristaltisk bevægelse, var vi i stand til at teste, om aktiviteten af ​​motoriske neuroner selv er nødvendigt for udbredelsen af ​​motorens udgangssignal. Lokale og forbigående blokade af motoriske neuroner anholdt udbredelsen af ​​peristaltiske bevægelse. Efter blokaden blev fjernet, propagation optrådte på det segment, hvor bølgen var blevet anholdt. Dette fænomen antyder, at uden motor neuronal aktivering, kan propagative bølge ikke videre ad den ventrale nerve ledningen yderligere, og dermed aktiveringen af ​​motoriske neuroner er nødvendig for peristaltisk bevægelse. Vi har tidligere rapporteret detaljerede data og diskussioner om dette fænomen i inada et al. (2011) 13.. Her beskriver vi metoden til at forurolige neurale aktivitet interaktivt under overvågning bevægelsen af ​​dissekerede larver. Ved hjælp af forskellige GAL4 linjer og serier af spatiotemporale mønstre for aktivitet manipulation, kan man undersøge kredsløb logik gennem perturbationsmetoder respons egenskaber motorkredsen.

Protocol

1.. Larverne Forberedelse

  1. Bevar flyve linjer OK6-Gal4, UAS-ChR2 eller OK6-Gal4, UAS-NpHR2 i plast hætteglas indeholdende standard flyve mad.
  2. Spread gær pasta indeholder all-trans retinal (ATR) i passende koncentrationer (1 mM for ChR2, 10 mM for NpHR2 ("NpHR" for korte) på en æblejuice agarplade.
  3. Saml 2 nd eller 3. instar larver fra hætteglas, og læg dem på ATR-holdige plade.
  4. Opdrage dem ved 25 ° C i mørke i et passende tidsrum (fra 1 dag til ChR2, 2 dage for NpHR.)

2.. Mikroskop Opsætning

  1. Vedhæft et CCD-kamera (XCD-V60, Sony) til en konventionel konfokal mikroskop (i vores tilfælde, FV1000, Olympus) med en C-mount vedhæftet (forstørrelse 0.35x).
  2. Hvis der er en lukker langs strålegangen fra objektivets til CCD-kameraet, som lukker i løbet af laserscanning, fjerne det forsigtigt. Da dette trin afhænger af mikroerklare opsætningen, skal du kontakte mikroskop producenten for teknisk support, hvis det er nødvendigt.

3.. Dissection

  1. Skyl ATR-fodret larver med vand for at fjerne resterende mad fra kroppen.
  2. Sæt larve på en Sylgard belagt skål, dorsale opad (rygsiden har to Trakealtuber kører langs, en på hver side af den dorsale midterlinie). Tykkelsen af ​​Sylgard er omkring 5mm.
  3. Sæt et insekt ben (Austerlitz Insekt pins, Φ0.10mm, rustfri) i halen mellem luftrør rør med pincet (# 5 Inox, FST af Dumont, Schweiz). Stifterne, omkring 10 mm lang, bør være bøjet eller skæres skal være kort nok (~ 2mm lang) for at undgå at ramme og beskadige overfladen af ​​objektivlinsen. Derefter sætte den anden insekt pin ind i hovedet på larve i nærheden af ​​munden krog, sort klo-lignende struktur på den forreste ende.
  4. Tilføj Ca2 +-fri normalt saltvand (NaCl 140 mM, KCI 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Saccharose 36 mM (pH7.1)) for at holde larven fugtig.
  5. Lav et lille snit i nærheden af ​​halen med mikro saks (MB-50-7, Napox, Japan).
  6. Fra snittet, lave en langsgående snit langs ryggens midtlinie mod hovedet. Vær forsigtig med ikke at beskadige den ventrale nerve ledning (VNC), og axoner.
  7. Lav et lille snit i spidsen sideværts.
  8. Placer 4 ben i hvert hjørne af det dissekerede bodywall. Kropsvæggen skal strækkes nok til at visualisere et segmenteret mønster af kroppen væggen, men ikke for meget at hindre peristaltisk bevægelse.
  9. Fjern de indre organer bortset fra hjernen og VNC og skyl prøven med Ca2 +-fri normalt saltvand.
  10. Juster orienteringen af ​​ventrale nerve ledningen at være bilateralt symmetrisk ved at ændre positionen og orienteringen af ​​insekt benene på kroppen væg. Til at fastsætte placeringen af ​​den ventrale nerve ledning, skal du indsætte en stift gennem væv mellem hjernen og munden krog ned til Sylgard.
    11. <li> Udskift buffer med 2 mM Ca2 + Ringer-opløsning (NaCl 130 mM KCl 5 mM, MgCl2 2mm CaCl 2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, Saccharose 36 mM (pH 7,3)).

4.. Imaging med laserbelysning

  1. Vedhæft en 4x tør objektiv (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Japan) i konfokal mikroskop og indstil larve forberedelse på scenen.
  2. Anskaf en transmission billede af dissekerede præparat med en rød laser (633 nm) for at finde den ventrale nerve ledningen ved konfokal mikroskop. Til denne scanning, skal du sørge for ikke at bruge en 488 nm eller 559nm laser, som fremkalder uønsket stimulering af ChR2 eller NpHR hhv.
  3. Fastlægge regionen af ​​interesse (ROI) om fremsendelse billedet. Zoomet tilstand kan være nyttige for detaljeret bestemmelse af ROI.
  4. Skift filteret sæt af mikroskop til at belyse med 488 nm eller 559nm lys.
  5. Belyse fremstillingen med en halogenlampe at visualisere kroppens væg. The præparat kan overvåges med et CCD-kamera fastgjort til konfokal mikroskop.
  6. Optag bevægelse af kroppen væggen og tænd laserstrålen tændes og slukkes samtidig overvåge bevægelse.

Representative Results

Lokale og forbigående aktivering af motoriske neuroner med ChR2.

Vi udtrykte ChR2 i motoriske neuroner. Axoner af motoriske neuroner nye fra hver VNC segment projekt til en tilsvarende segment af kroppen væggen. Når vi stimuleret én eller to segmenter af VNC med en blå laser, muskler i tilsvarende segmenter udviste sammentrækninger (figur 1).

Lokale og forbigående hæmning af motoriske neuroner med NpHR.

Vi udtrykte NpHR i motoriske neuroner. Når vi stimulerede et par (1 ~ 2) segmenter af VNC med en gul laser under peristaltiske muskelsammentrækninger, blev formerings bølge standset ved tilsvarende segmenter af kroppen væg (figur 2). Så bølgen genstartet fra de anholdte segmenter, når vi slukkede laserbelysning 13..

50513fig1.jpg "alt =" Figur 1 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Lokal aktivering af motoriske neuroner med ChR2. A. Scheme for den lokale aktivering af fileterede forberedelse. Ved blå-lys belysning af nogle få segmenter af ventrale nerve ledningen udtrykker ChR2 i motoriske neuroner, der muskler i de tilsvarende segmenter indgået (pil hoved). B. Transmission billeder af en dissekeret larve. Lokal belysning af den ventrale nerve ledning (pil hoveder) inducerer segmental sammentrækning af kroppens væg muskler (pile).

Figur 1
Figur 2. Lokal hæmning af motoriske neuroner med NpHR. A. Scheme for den lokale hæmning af fileterede forberedelse. Ved gul-light belysning af nogle få segmenter af ventrale nerve ledningen udtrykker NpHR i motorneuroner, muskler sammentrækning under spontant opstået peristaltisk bevægelse (pil hovedet i toppen) er slap (pilehoved i bunden.) B. Transmission billeder af en dissekeret larve . Lokal belysning af den ventrale nerve ledning (pilespidser) lempet spontant-kontraherede krop vægsegmenter (pile).

Discussion

Temporal og lokale forstyrrelse af neurale aktivitet er en uvurderlig teknik til at analysere netværks dynamik neurale kredsløb. I denne protokol, præsenterer vi en metode til at manipulere neurale aktivitet ved optogenetics ved hjælp af en laser. Laseren høje direktionalitet tillader mere lokaliseret optogenetic stimulation end bredt felt stimulation ved hjælp kviksølv eller Xenon lampe. Selvom laser illuminationer allerede har været anvendt på optogenetics i tidligere studier er specielle opsætninger såsom glasfiber, mikromanipulator, og laser kilde, der kræves i de fleste tidligere undersøgelser. I denne protokol, bruger vi en konventionel konfokal mikroskopi til lokal belysning. Da den konfokal mikroskop systemet er meget udbredt, vil denne metode åbner mulighed for at anvende højere opløsning optogenetics i mange laboratorier.

Protokollen har to kritiske punkter: larvernes dissektion og laser magt. Først, hvis hjernen, den ventrale nerve ledning eller en motorisk nerve er beskadiget during dissektion, vil larverne udviser mindre eller ingen spontan peristaltisk bevægelse. Præcision er derfor vigtigt, især når de foretager et snit på dorsalsiden med fjeder saks og fjerne indre organer med pincet. Detaljer om dissektion er blevet rapporteret tidligere 21.. For det andet, hvis der er tilstrækkelig stimulation skal opnås en laser magt på omkring 0,1 ~ 1 mW / mm 2 for ChR2 eller 1 ~ 10 mW / mm 2 for NpHR er påkrævet. Vi vurderede laser magt som den samlede lyseffekt under en objektiv divideret med en anslået areal på belysning. Vi målte den samlede lyseffekt ved hjælp af et power meter (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Vi vurderede område af belysning som cirkulære konstante gange kvadratet af bølgelængde laser, som groft giver belyste område i diffraktion grænse. Effektiv belysning magt på prøven kan justeres ikke alene ved laserens udgang, men også ved at ændre scanningshastighed og følelsesløsis gentagelser. Vi scannet laser med 20-100 mikrosekunder / pixel til 63 gange. Derudover er ekspressionsniveauet af optogenetics protein og mængden af ​​ATR også kritisk for stimulering effektivitet. Følgelig, hvis larver viste ingen optogenetic respons, bør følgende punkter kontrolleres og korrigeres: 1) laser effekt (ved at optimere mikroskop-system), 2) udtryk niveau af optogenetics protein (ved at kontrollere genotype og opdræt temperatur), og 3) mængden af ATR (ved at justere koncentrationen af ​​ATR og fodring periode). NpHR kræver højere koncentration af ATR end ChR2 gør af ukendte årsager 13. ChR2 fungerer godt i larver opdrættet i fødevarer, der indeholder mindre ATR (f.eks 0,1 mM) end beskrevet her (1 mM). Som fodring larver til 1 mM ATR er tilstrækkelig til at gøre ChR2 foto-reaktiv, anbefaler vi denne koncentration for den første retssag i ChR2 eksperimenter. Koncentrationen af ​​ATR efterfølgende kan titreres ned fra 1 mM. Hvad eksponeringstid for ATR anbefaler vivarigheden beskrevet her for robust optogenetic kontrol. Vi har ofte tilsidesat optogenetic respons, når fodring larver til ATR for kortere varighed.

I denne protokol, er laserbelysning og image erhvervelse drives af en separat computer. Så klar påvisning af Spatiotemporal mønster af laserbelysning af CCD-kameraet er kritisk for dataanalyse. Hvis laser stedet eller linje er dæmpet på CCD billede, bør du optimere magt halogenlampe og få værdien af ​​CCD-kamera til at visualisere laserbelysning samtidig holde kropsvæg synlige.

Spatiotemporale belysning vist i denne protokol giver oplysninger om larver motoriske kredsløb, men metoden har visse begrænsninger. Med hensyn til "rumlige" aspekt, placering af belysningen registreres ved lav forstørrelse CCD bruges til videooptagelser kroppens væg bevægelser. Følgelig kan belysningen område tildeles på segment niveau, men ikke på celleniveau. Med hensyn til "temporal "aspekt tidsforskel mellem tændes laseren scanning ved konfokal mikroskop og belysning med laser afhænger af det konfokal mikroskop systemet og scanning tilstand. Derfor er nogle test ved trial and error nødvendig for at justere belysningen timing. Da timingen af ​​belysning kan bestemmes i CCD-billedsensorer film ved hjælp af en passende software som ImageJ, den kritiske faktor i tidsmæssig opløsning er frame rate på CCD kamera billeddannelse. Vi typisk framerate for 7,5-15 frames per sekund.

Fremskridt i optogenetic værktøjer giver os en chance for at ændre denne protokol. Vi brugte 3 rd instar larver besidder OK6-Gal4 og UAS-ChR2 [H134R] eller UAS-NpHR2. Andre optogenetic værktøjer i stedet for ChR2 [H134R] eller NpHR2 såsom ChR2 [T159C/E123T] NpHR3 eller Arch kan øge effektiviteten af aktiviteten styring 22.. Desuden kan bruge andre GAL4 linjer eller analyse i andre udviklingsstadier give mere information om motor circuits.

I denne protokol, blev motorisk aktivitet overvåges af transmissions billeder af bodywall sammentrækning med et CCD-kamera. Aktiviteten af motoriske neuroner med calcium-sensitive fluorescens molekyler (f.eks GCaMP) kan også direkte overvåges, mens manipulere neurale aktivitet med ChR2 eller NpHR. I dette tilfælde er blåt lys belysning i et bredt område og et yderst følsom CCD-kamera (f.eks EMCCD kamera) anvendes i stedet for en halogenlampe og den normale CCD-kameraet tidligere beskrevet heri. For at forbedre rumlig opløsning på stimulation, mens overvågningen bodywall bevægelse, ved hjælp af en ekstra objektiv kan være en mere avanceret metode: belysning af den ventrale nerve ledningen ved en høj forstørrelse objektiv (f.eks 40x) fra over prøven og overvågning bodywall ved lav forstørrelse linse (fx 4x) under prøven. Denne dobbelte linsesystem kan tillade os at stimulere nervesystemet højere rumlig opløsning.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling-in-Støtte til videnskabelig forskning i innovative områder "mesoskopisk neurocircuitry" (nr. 22.115.002) og "Comprehensive Brain Science Network" (nr. 221S0003) i ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab, og Teknologi, Japan til AN og Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (nr. 21.700.344) i Japan Society for fremme af Science (JSP'er) til HK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Tags

Neuroscience Molekylærbiologisk Institut neurobiologi Developmental Biology Bioengineering cellebiologi motorneuroner Neurosciences, Optogenetics Channelrhodopsin-2 Halorhodopsin laser konfokal mikroskopi dyremodel
Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose,… More

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter