Summary
I denna skrift beskriver vi en snabb och bekväm förfarande för isolering och odling av primära pankreasceller acinösa från murina bukspottkörteln. Denna metod utgör en värdefull metod för att studera fysiologi färska primära normala / otransformerad exokrina celler i bukspottkörteln.
Abstract
Detta protokoll möjliggör snabb isolering (på mindre än 1 timme) av murina pankreaskörtelgång, vilket gör det möjligt att bevara dem i kultur för mer än en vecka. Mer än 20 x 10 6 acinar celler kan erhållas från en enda mus bukspottkörteln. Detta protokoll ger möjlighet att självständigt behandla så många som 10 pancreases parallellt. Eftersom det bevarar acinar arkitektur, är denna modell väl lämpad för att studera fysiologi exokrina pankreas in vitro i motsats till cellinjer etablerade från pankreas tumörer, som visar många genetiska förändringar som leder till partiell eller total förlust av sin acinar differentiering.
Introduction
Ett ofta förekommande problem för forskningslaboratorier arbetar på exokrin pankreas vävnad är svårigheten att odla acinarceller celler in vitro under en tidsperiod tillräckligt lång för att möjliggöra ett långsiktigt experiment.
En faktor som hindrar utvecklingen av sådana odlingssystem är den inneboende känslighet pankreasvävnad till experimentell manipulation på grund av den höga halten i glykolytiska, proteolytiska och lipolytiska enzymer, som bokstavligen smälta pankreasvävnad när de släpps under isoleringen av celler i bukspottkörteln.
En andra faktor är anmärkningsvärt in vitro plasticitet körtelceller, som tenderar att förlora sina sekretoriska egenskaper och transdifferentiera till andra mogna celler, såsom pankreas duktal celler eller hepatocyte-liknande celler 1. In vitro, varierar denna cell plasticitet med de experimentella förhållanden (t.ex. odlingsmedium sammansättning) 2 1.
Flera metoder har utvecklats för isolering och odling av acinära celler, först från marsvin bukspottkörteln 3-5. Inledningsvis dessa protokoll inblandade nedbrytning av bukspottkörtelns vävnad med kollagenas, kymotrypsin, och ett proteas cocktail, med ultimat isolering genom kraftig mekanisk dissociation. Bukspottkörtelns celler som isolerats på detta sätt visade onormala strukturella och funktionella egenskaper, särskilt en förlust av apikala strukturer och betydande skador på sina membranreceptorerna. Isolerade celler förblev lönsamt för endast 1 eller 2 dagar.
Framställning av spridda acini upprätthåller deras intra-och intercellulära arkitektur, bevara cellmembran, begränsa skador på ytan receptorer, och därmed förbättra exokrin sekretion svar på sekretagoger 6-8. Som ett resuLT, erbjuder denna metod den stora fördelen att utvidga viabilitet acinar cell till 7-10 dagar in vitro. Dessutom är denna metod som för närvarande föredrog att körtelcell isolering 9-12 eftersom underhåll av intercellulära kontakter, inklusive cell koppling genom gap junctions, är en viktig faktor för den exokrina pankreas acinar cellfenotyp 13.
Som dedifferentiering av acinar celler och deras transdifferentiering till duktal celler är en av de föreslagna mekanismerna för uppkomsten av aggressiva exokrina pankreas cancer 14, är den spridda acini modellen också ett lämpligt system för att studera bukspottkörtel plasticitet och dess efterföljande molekylära mekanismer. Dessutom, i kombination med användning av genetiskt modifierade djur 15,16 och utveckling av genöverföringstekniker (adenovirus 2 eller lentiviral transduktion, användning av nanopartiklar, etc), detta in vitro primära körtelcell modellen kanvara mycket användbar för att bestämma hur olika genetiska dysfunktioner påverkar regleringen av körtelcell differentiering eller dedifferentiering och bör ge bättre förståelse av de molekylära händelser som är ansvariga för uppkomsten av pankreatit, precancerösa lesioner, och förändringar i cellens plasticitet.
Isolering av spridda acini är den metod vi använder i vårt laboratorium för att acinära kultur pankreasceller. Vi beskriver här och diskutera den metod som används. Det innebär enzymatisk dissociation av bukspottskörteln vävnad (med en bakteriell kollagenas) kopplad till mekanisk sönderdelning utan dissociation av körtelceller. Medan de flesta protokollen omfattar odling av acini, antingen i suspension eller på specialbehandlade plast substrat, odlar vi dem i suspension endast kort (under 24 timmar), sådd dem efteråt på matrisstöttor om långvarig cellodling krävs.
Detta protokoll möjliggör snabb isolering (på mindre än 1 timme) av spridda bukspottkörtel acini, hållbart för mer än en vecka i kultur. Den tillåter isolering av mer än 20 x 10 6 acinar celler per mus bukspottkörteln. Dess enkelhet gör det möjligt att bearbeta självständigt så många som 10 pancreases parallellt. Genom att upprätthålla den intra-och intracellulär arkitektur acini och därmed acinar fenotypen av isolerade primära celler, utgör denna modell ett valfrihetssystem för studier av transdifferentiering mekanismer, som alla andra exokrina pankreas modeller tillgängliga härrör från pankreastumörer visar många genetiska förändringar som leder till cellulär transformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som godkänts av en etisk kommitté under reglerande av statlig myndighet ("Comité d'Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de transit de l'ENS, au PBES et au Laboratoire P4" (CECCAPP)). Mössen hölls i en SPF-djur anläggning vid "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, Frankrike) och hanteras i enlighet med de institutionella riktlinjerna.
En schematisk representation av det förfarande som visas i figur 1.
Ett. Bukspottkörteln Dissektion och Dilaceration (Dag 0)
En mycket snabb dissekering är kritisk för ett optimalt utbyte av extraktion och för att försäkra en god viabilitet av celler i odling. För att minska den tid som behövs för bukspottkörteln isolering, måste alla instrument och utrustning vara klar innan musen dödshjälp.
- Euthanize musen genom kvävning med CO2 eller cervikal dislokation.
Från detta steg, alla procedurer måste utföras under en steril atmosfär (mikrobiologisk säkerhet skåp, nivå II) med steril dissektion utrustning.
- Fäst musen och spraya musen buken med 70% etanol. Med eventuella dissekera sax och pincett, gör en V-formad snitt vid underlivet och fortsätta upp till membranet för att öppna helt bukhålan.
- Placera levern loberna mot membranet, de ska stanna där om kroppen hålighet är öppen tillräckligt långt. Dra tarmen och tjocktarmen utanför bukhålan till vänster, och hitta ändtarmen. Med ett par böjda pincett och dissekera sax, hugg och avsnitt ändtarmen.
- Med samma pincett, försiktigt rulla helt tarmen från ändtarmen till magsäcken genom att dra tarmen på vänster sida.
- Använda Noyes sax och en pincett, försiktigt skära bukspottkörteln längs tarmen och befria det med mjälten från resten av mag-tarmkanalen.
- Ta tag i mjälten och avsnitt bukspottkörteln fäst vid den (Figur 2).
Vid detta steg, vara säker på att ingen mesenterica fettvävnad och / eller annan intilliggande vävnad (mjälte, tarm, etc) kunde samlas med bukspottkörteln, för att undvika cellulär kontamination.
För resten av proceduren, måste alla buffertar beredas utan kalciumjoner Ca 2 + chelatorer att undvika fullständig dissociation av den exokrina pankreas vävnad i enstaka körtelceller.
- Skölj bukspottkörteln två gånger i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x.
I detta steg kommer som fettvävnad flyta strider mot bukspottkörteln som kommer att sjunka, är det möjligt att enkelt visualisera och snabbt avlägsna föroreningen vita fettvävnaden fortfarande sitter bukspottkörteln.
Om bukspottkörteln måste transporteras till cellodling anläggningen, måste det hållas på is i HBSS 1x.
- Överför bukspottkörteln i en steril petriskål innehållande 5 ml HBSS 1x. Använda Noyes sax och en skalpell, skiva bukspottkörteln i små bitar av 1 till 3 mm 3 (figur 3A).
2. Enzymatiska och mekaniska Dissociations av bukspottkörteln (dag 0)
- Överför dem i en steril 50 ml polypropylen rör.
- Centrifugera i 2 minuter vid 450 xg och 4 ° C. Sug och kassera supernatanten för att avlägsna cellfragmenten och blodkroppar.
- Tillsätt 10 ml kollagenas IA lösning (HBSS 1x innehållande 10 mM HEPES, 200 U / ml collagenase-IA, och 0,25 mg / ml trypsininhibitor) till pankreas sektioner. Med hjälp av en 25 ml serologisk pipett, överföra dem till en 25 cm 2-kolv. Inkubera den för 20 till 30 minuter vid 37 ° C. Under denna tid (var 5 min), utför en mekanisk dissociation genom energiskt flytta tillbaka-och-tillbaka bukspottkörteln fragmenten ungefär tio gånger, i sterila pipetter minskande storlek (25, 10, och 5 ml serologiska pipetter).
I detta steg är det viktigt att ofta kontrollera omfattningen av den enzymatiska dissociation av bukspottskörteln sektioner.
- När pankreasvävnad verkar vara väl dissocierade (enligt försvinnandet av bukspottskörteln fragment och till ökad grumlighet i lösningen) (Figur 3B), stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 10 ml kallt buffrad tvättlösning (HBSS 1x innehållande 5 % fetalt bovint serum (FBS) och 10 mM HEPES).
- Överför det till en steril 50 ml polypropylen rör och centrifuge under 2 min vid 450 xg och 4 ° C. Försiktigt aspirera och kassera supernatanten för att avlägsna kollagenas IA lösningen.
- Resuspendera och tvätta pelleten med 10 ml buffrad tvättlösning. Centrifugera under 3 min vid 450 x g och 4 ° C. Försiktigt aspirera och kassera supernatanten. Upprepa detta steg två gånger.
Tre. Filtrering och sådd av Dispergerade acini (Dag 0)
- Resuspendera cellpelleten i 7 ml Waymouths medium innehållande 2,5% FBS, 1% penicillin-streptomycin blandning (PS), 0,25 mg / ml av trypsininhibitor, och 25 ng / ml rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF).
- Filtrat cellblandningen genom att låta den passera genom ett 100 pm filter för att hålla kvar de icke-digererade fragment (kanaler, blodkärl och Langerhanska skär). Pankreatiska acinar strukturer (acinus av 10-15 celler) passera.
- Skölj filtret med 6 ml Waymouths medium innehållande FBS, PS, trypsin inhibitor, och EGF.
Efter detta steg, cellerna måste behandlas mycket noggrant, för att undvika acini dissociation.
- Seed den isolerade acini i en 6-brunnars odlingsskål (2 ml per brunn) (figur 3C). Kultur dem vid 37 ° C under 5% (volym / volym) CO 2 atmosfär.
Efter detta steg är de acinära cellerna i suspension.
4. Acinar Cell Culture (dag 1 till 10)
- Tjugofyra timmar efter, överföra acini (i suspension) till en ny 6-väl kultur maträtt, för att eliminera de främmande cellerna och cellulära rester som har anslutit sig över natten (Figur 4).
Om cellodling behöver förlängas för flera dagar eller om de experimentella förhållandena kräver celler odlas i monoskikt, rekommenderas det att överföring och utsäde acini på matrisstöttor.
- Dagen innan seding på matrix stöd (dag 0), belägga en 6-brunnars odlingsskål med typ I-kollagen (5 | ig / cm 2). Tillsätt 1 ml av typ I-kollagen-lösning (50 | ig / ml i 0,02 M ättiksyra, 0,2 ^ m-filtrerad) till varje brunn och låt den passivt adsorbera på plast, under 1 h vid 37 ° C (eller över natten vid 4 ° C ).
- Aspirera typ I-kollagen-lösning och skölj den belagda väl två gånger med fosfatbuffrad saltlösning 1x.
- Låt belagda väl att torka (under en mikrobiologisk säkerhet skåp) minst 12 tim före användning.
- Överför den isolerade primära acini (erhållen vid steg 4.1) i typ I-kollagen-belagd 6-brunnars odlingsskål och kultur dem under samma betingelser som tidigare beskrivits (vid 37 ° C under 5% (volym / volym) CO 2 atmosfär) . Cellerna ansluta sig till typ I-kollagen substrat för två dagar.
- På dag 3, ändra odlingsmediet för att eliminera icke-viabla celler som inte har anslutit sig till. Med tiden i odling, cellerna kommer successivt spläs på kollagen-haltiga support. Ändra odlingsmediet var 3 dagar (figur 5).
De isolerade acinära erhållna celler kan räknas, efter en komplett mekanisk dissociation genom att använda en Thoma kammare cellräkning. Observera att isolerade acinar celler inte kan upprätthållas i kultur efteråt.
Kvaliteten på den erhållna acinär kulturen kan styras genom att kontrollera uttrycket av acinära specifika markörer såsom Trypsinogen, Pancreas transkriptionsfaktor en subenhet Alpha, eller Karboxipeptidas A1 (genom immuncytokemi eller immunofluorescens experiment).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 schematiserar den "utspridda" acini metod för primär acinar celler isolering. De kritiska steg, som måste iakttas strikt under protokollet, beskrivs i diskussionen delen.
För att underlätta dess avlägsnande har bukspottkörteln som ska samlas in från buken tillsammans med den bifogade mjälten (Figur 2). Båda organen måste skäras sönder, och den resterande fettvävnad som kunde fortfarande sitter i bukspottkörtel skall avlägsnas (steg 1,6).
Den makro-och mikroskopiska bilder, vilka visas i figur 3, representerar resultatet efter varje steg av de enzymatiska och mekaniska dissociations i bukspottkörteln. Efter skivning, är bukspottkörteln uppdelad i små delar (Figur 3A, Steg 1.8). Figuren 3B visar aspekten av bukspottkörteln efter en framgångsrik enzymatisk dissociation att förlita sig på en noggrann tillfälal övervakning av den pågående matsmältningen (Steg 2.4). Detta steg är ett avgörande steg för att bestämma den exakta tiden som behövs. Figuren 3C visar det erhållna materialet efter filtreringen av den pankreatiska blandning (steg 3.4). Endast de väl-separerade acini hålls efter detta steg.
Figuren 4 är en typisk dag en illustration av pankreaskörtelgång isolerades med användning av våra protokoll. Överföringen av acinar celler till en ny kultur maträtt medger att eliminera cellulära fragment och de vidhäftande cellerna föroreningar (steg 4,1).
Såsom visas i figur 5, när de odlas på kollagen av typ I, de acinära celler sprider och förlorar sin acinar differentiering (morfologi och 3D-organisation), vilket ger upphov till ett monoskikt av spindel-formade celler (Steg 4.6).
Figur 1. Schematisk representation av protokollet tillåter isolering av mus primära spridda acini.
Figur 2. Anatomi i bukspottkörteln efter dissekering. Röda och gula pilarna visar respektive de återstående anatomiska förbindelserna med mjälten och mesenterica fettvävnad som behöver skäras för bukspottkörteln samling.
Figur 3. Spritt acini isolering (dag 0) visualiseras genom makroskopisk observation (till vänster) och faskontrastmikroskopi (högra panelen, 40X förstoring). A) Efter dilaceration (visad i en 25 cm 2 kolv). B) Efter kollagenas IA matsmältningen och kraftfull mekanisk dissociatipå. C) Efter filtrering och överföring i en 6-brunnars odlingsskål.
Figur 4. Spritt acini kultur, 24 timmar efter sådd (dag 1), visualiseras genom faskontrastmikroskopi (40X förstoring).
Figur 5. Spritt acini kultur på en typ I kollagen-belagd maträtt på dag 2, 4 och 7 visualiseras genom faskontrastmikroskopi (40X, 120X och 240X förstoring).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, beskriver vi ett förfarande för isolering av celler i bukspottkörteln acinar. Denna metod gör det möjligt att isolera mer än 20 x 10 6 acinar celler per djur på mindre än en timme. Tack vare sin snabba och enkla implementering (så många som 10 pancreases kan självständigt bearbetas per experiment parallellt), verkar detta protokoll som en bra kompromiss mellan de befintliga isoleringsmetoder 3-5,9-12,17.
Kritiska steg / felsökning
Effektiviteten av denna metod förlitar sig på försiktighetsmått vid några kritiska punkter. Det första steget i bukspottkörteln dilaceration (steg 1,8) är avgörande för efterföljande bukspottkörteln enzymatisk spjälkning. Otillräcklig uppskärningen kommer att minska utbytet av enzymatisk dissociation och antalet acinar erhållna cellerna. Detta gör det nödvändigt att förlänga inkubering med kollagenas IA, oundvikligen orsaka en överdriven dissociation av körtelceller och i följdtivt ökar celldöd.
Som varnade ovan, är det andra kritiska steget matsmältningen genom kollagenas lA (steg 2.3). För mycket enzymatisk dissociation leder till en hög grad av celldöd. Omfattningen av bukspottkörteln matsmältningen måste kontrolleras ofta under denna kritiska steget (Figur 3B). Efter mekanisk och enzymatisk dissociations måste särskild uppmärksamhet riktas för att mycket försiktigt hantera dispergerade acini för att bevara sina intercellulära strukturer.
Begränsningar
Även om tillsatsen av epidermal tillväxtfaktor (EGF) till Waymouths kulturen kan fälla den progressiva acinar-till-duktal transdifferentiering, är det viktigt att bibehålla cellerna vid liv.
Som beskrivs i protokollet och om det behövs, kan in vitro-odling under de körtelceller utökas till upp till 10 dagar efter sådd cellerna på matrix ställningskrokaråringar såsom typ I kollagen. Ännu viktigare, och såsom visas av andra 1, odling av celler på typ I-kollagen kommer att framkalla den progressiva transdifferentiering av acinära celler till duktala celler. Denna process startar efter 4 dagars odling på kollagen och kan vara avslutad efter 7 dagar. Det kan därför vara nödvändigt att kontrollera förekomsten av en specifik duktal markör såsom cystisk fibros transmembran konduktansregulator eller Cytokeratin-19 (genom immuncytokemi eller immunofluorescens experiment) om körtelcell kulturen behöver utökas till 1 vecka. Den alternativa användningen av Matrigel som en matris byggnadsställning, genom att minska vidhäftningen av spridda acini, gör det möjligt att utöka underhållet av deras acinär fenotyp i 2 dagar.
Möjliga ändringar
Snittning rektum under dissektionen steg ökar risken för bakteriell kontamination. Vi har aldrig upplevt en sådan situation. Men, om det behövs, det finns en annan procedur för att kringgå detta möjligt fråga. Den består av att finna magen, mjälten och den första delen av tolvfingertarmen, och sektionering bifogade pankreas. Observera att detta alternativ procedur måste helt behärskar. Annars kommer varaktigheten av dissektion blir längre, vilket äventyrar då kvaliteten på det avlägsnade biologiska materialet.
Den långsiktiga monoskiktkultur av acinära celler kan optimeras, särskilt genom modifiering av stödmatrisen. Om det krävs av de experimentella förhållanden, typ I kollagen kan ersättas med en annan byggnadsställning, såsom Matrigel. I detta fall måste Matrigel vara nygjord på 400 pg / ml koncentration i kall fosfatbuffrad saltlösning 1x. Därefter inkuberas brunnarna med Matrigel (40 | ig / cm 2) över natten vid 4 ° C. Denna punkt måste respekteras. Kulturen proceduren är densamma som beskrivs i steg 4.
Metoden can optimeras ytterligare empiriskt. Exempelvis kan mängden av aminosyror i odlingsmediet av exokrina pankreatiska celler reglerar proteinsyntes genom dessa celler 18. Sphyris et al. 2 och Bläuer et al. 19 har utarbetat en komplett odlingsmedium innehållande en högre mängd aminosyror (essentiell och icke-essentiella), främjande av bibehållande av acinar celler i differentierat tillstånd. Ett sådant medel kan vara mycket användbart om man vill celler kultur acinar isolerats genom denna metod för mer än 10 dagar.
En annan parameter som kan ändras om långtidsodling krävs, är pH i odlingsmediet. Fysiologiskt är den apikala pol acinar-celler i permanent förbindelse med en bikarbonat-rika, lätt alkalisk vätska ger upphov till bukspott. Det är frestande att spekulera i att pH i körtelcell miljön kan vara viktigt för att upprätthålla acinar differentiatioN State. Vissa protokoll tidigare rapporterat användning av ett odlingsmedium med ett pH justerat till 7,8 för att efterlikna den "ursprungliga" fysiologi acinar celler 19.
Betydelsen av tekniken
Det är viktigt att nämna att det finns andra protokoll för odling acinar, med bukspottkörtel explants och organotypic kulturer 19. Deras tillämpning, baserat på pankreascell migrering från explantatet till membranet på vilken de odlas, är svårare. Isolering av dessa celler i bukspottkörteln kräver i synnerhet en första veckan i bukspottskörteln Explantation kultur. Den stora fördelen med denna metod är att ingen enzymatisk dissociation behövs, så att både cellmembranet integritet och cell-till-cell-interaktioner bevaras. Under dessa betingelser, kan acinära celler upprätthållas in vitro i upp till 14 dagar. Ändå körtelcell kulturen erhållits är inte ren, och föroreningar fibroblaster, duktal cells, och endotelceller är oundvikligen närvarande, som kan vara kompatibla med vissa typer av experiment. Däremot ger vår procedur snabbt en ren population av körtelceller, bevara sin ursprungliga arkitektur av acini.
Dorrell et al. Beskrivs en annan metod för att isolera de olika mustyper pankreatiska cell (inklusive acinar, trummor, och celler endokrina), med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 17. Denna metod är mycket effektiv för att erhålla en ren (eller specifik) population av körtelceller. Det kräver dock en fluorescerande märkning med specifika antikroppar, före sortering. Dessutom kräver detta förfarande också en kompetens i FACS och en flödescytometer. Dessutom medger denna teknik inte en utökad odling av körtelceller, på grund av förlusten av sin ursprungliga arkitektur acini. Vår snabba metoden tillåter en utökad odling in vitro av dispergerade körtelceller med en kvalitet och en renhet som enre kompatibel med de flesta av de ytterligare rutinmässiga tillämpningar.
Framtida tillämpningar
När behärskar, bör denna teknik för att isolera / odla körtelceller vara mycket användbar i en rad skilda frågor och framför allt för att undersöka de mekanismer som är involverade i bukspottkörtel plasticitet och transdifferentiering, som är välkända men dåligt förstådd. Genom att bevara vissa inter-och intracellulär kommunikation, spridda här acini modellen fortfarande mer fysiologiskt relevant än odödliga cellinjer.
Inom området av bukspottkörtel tumorgenes, ger denna primära cellmodell ett lämpligt system för att studera transdifferentiering acinar cell, en av de mekanismer som föreslås för att alstra aggressiva pankreas cancer. Även förevigade humana eller murina cellinjer (t.ex. Colo357, Panc-1, eller BxPC3) kan vara mer flexibla att använda än primära körtelceller, både deras ursprung och deras complex genetiska status (som transformerade cellinjer som ursprungligen isolerades från pankreas tumörer eller ens metastaser bukspottkörtel) utgör stora nackdelar i att studera dessa mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka personalen för AniCan (CrCL, Lyon) för deras tekniskt bistånd med djurvård. Detta arbete stöddes av Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), Ligue Nationale Contre le Cancer, av Association pour la Recherche sur le Cancer, av Institut National du Cancer, och genom stipendier från Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), från Institut National du Cancer (JG), från Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche av Frankrike (RMP och DFV) och från Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
