Summary
Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.
Abstract
Bu protokol, bu birden fazla olası hafta bunların kültür korumak için yapmak, kemirgen pankreas asinüs hızlı izolasyonu (en az 1 saat olarak) izin verir. En az 20 x 10 6 asiner hücrelerin, tek bir sıçangil pankreasından elde edilebilir. Bu protokol bağımsız paralel 10 gibi pankreaslarında işlemek için imkan sunuyor. Bu asiner mimarisi korur, çünkü bu model de kendi asiner farklılaşma kısmen veya tamamen kaybı ile sonuçlanan birçok genetik değişiklikler görüntülemek pankreas tümörleri, gelen kurulan hücre hatları aksine in vitro pankreas fizyolojisi eğitim için uygundur.
Introduction
Ekzokrin pankreas dokusu üzerinde çalışan araştırma laboratuvarları için sık karşılaşılan sorun yeterince uzun uzun vadeli bir deneme sağlamak için bir süre için in vitro asiner hücrelerin yetiştirilmesi zorluğudur.
Bu tür kültür sistemlerinin geliştirilmesi engelleyen bir faktör de pankreas hücrelerinin izolasyonu sırasında serbest zaman tam anlamıyla pankreas doku sindirmek, glikolitik proteolitik ve lipolitik enzimler, en yüksek içeriği nedeniyle deneysel manipülasyon için pankreas dokusunun içsel duyarlılığı.
İkinci bir faktör, salgı özelliklerini yitirmesine ve bu pankreatik duktal hücreleri veya hepatosit benzeri hücreler 1. Gibi diğer olgun hücrelerin, için transdifferentiate eğilimi asiner hücreler, in vitro plastisitede dikkat çekicidir in vitro olarak, bu hücre plastisite deneysel koşullar ile değişir (örneğin, kültür ortamının bileşimi gibi) 2 1 için uygun kültür şartları ile içine karmaşıklığı bir ölçüde tanıttı.
Birçok yöntem ilk kobay pankreas asinar 3-5, hücrelerin izolasyonu ve kültürü için geliştirilmiştir. Başlangıçta, bu protokoller güçlü mekanik ayrışma ile nihai yalıtımlı, kollajenaz, kimotripsin ve bir proteaz kokteyl ile pankreas doku sindirim çıkıyor. Bu şekilde izole edilmiş pankreas hücreleri, özellikle anormal yapısal ve işlevsel özellikleri, apikal yapıları ve membran reseptörlerine önemli hasar bir kayıp gösterdi. İzole hücreler sadece 1 ya da 2 gün boyunca yaşayabilecek durumda kalır.
Hazırlanması asinüs salgı 6-8 cevaben yüzeyi reseptörlerine hasar görmesini sınırlayarak, ve böylece ekzokrin salgılanması iyileştirilmesi, hücre zarı koruyarak, bunların hücre içi ve arası mimari korur dağıldı. Bir resu olarakLT, bu yöntem, in vitro olarak 7-10 gün asinar hücre canlılığı uzanan en önemli avantaj sağlar. Gap junction ile hücre bağlantısı da dahil olmak üzere hücreler arası iletişim, bakımı ekzokrin pankreas asiner hücre fenotip 13 önemli bir belirleyicisi olduğu için Ayrıca, bu yöntem şu anda 9-12 asiner hücre izolasyonu için tercih edilir.
Asiner hücreler ve duktal hücrelerine kendi transdiferansiasyon en dediferansiyonunu agresif ekzokrin pankreas kanserleri 14 doğuşu için önerilen mekanizmalardan biri olduğu için, dağınık acini modeli aynı zamanda pankreas plastisite ve sonraki moleküler mekanizmaları incelemek için yeterli bir sistemdir. Ayrıca, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların 15,16 kullanımı ve gen transfer tekniklerinin geliştirilmesi (adenoviral 2 veya lentiviral transdüksiyon, nanopartiküller, vb kullanımı), ile birlikte bu vitro birincil asiner hücre modelinde yapabilirsinizçeşitli genetik bozukluklar asiner hücre farklılaşması veya dediferansiyonunu düzenlenmesi etkiler ve pankreatit başlangıcı, prekanseröz lezyonlar, ve hücre plastisite değişiklikler sorumlu moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamak nasıl belirlemede çok yararlı olabilir.
Dağınık acini izolasyonu biz kültür pankreas asiner hücrelere Laboratuvarımızda kullandığımız yaklaşımdır. Biz burada açıklamak ve kullanılan yöntemi tartışmak. Bu asiner hücre ayrışma olmadan mekanik bozulmasına birleştiğinde pankreas doku (bir bakteri kollajenazlarla) enzimatik ayrışma içerir. En protokoller süspansiyon veya özel işleme tabi tutulan plastik yüzeylerde ya kültür acini, dahil ederken, uzun süreli hücre kültürü gerekli ise matris iskeleleri üzerine sonradan tohumlama, sadece kısa bir süre (24 saat) süspansiyon bunları büyür.
Bu protokol dağınık pankreas ac hızlı izolasyonu (az 1 saat içinde) sağlarini, kültür birden fazla hafta sürdürülebilir. Bu fare pankreası başına en fazla 20 x 10 6 asiner hücrelerin izolasyonu sağlar. Sadeliği mümkün bağımsız paralel olarak 10 gibi pankreaslarında işlemek için yapar. Mevcut diğer tüm ekzokrin pankreas modelleri birçok genetik gösteren pankreas tümörleri türetilen gibi asini içi ve hücreler arası mimari ve böylece izole primer hücrelerin asiner fenotip koruyarak, bu model, transdiferansiasyon mekanizmalarının çalışma için tercih edilen bir sistem oluşturur Değişiklik hücresel dönüşüme yol açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler kamu otoriteleri düzenleyici altında bir etik kurul tarafından onaylanmış ("Comité d'Değerlendirme Haberleşme au Merkezi Léon Bérard, à l'ANIMALERIE de geçiş de l'ENS, au PBES et au laboratuarı P4" (CECCAPP)). Edildi Fareler "PLATEFORME AniCan, Merkezi Léon Bérard" (Lyon, Fransa) bir spesifik patojen free hayvan tesis muhafaza ve kurumsal düzenlemeler uygun olarak ele alınmıştır.
Prosedürünün bir şematik gösterimi Şekil 1 'de gösterilmiştir.
1. Pankreas Diseksiyon ve Dilaceration (Gün 0)
Bir çok hızlı bir diseksiyon ekstraksiyon optimal verim için önemlidir ve kültür içinde hücreleri iyi bir canlılığı sağlamak için. Pankreas izolasyonu için gereken zamanı azaltmak için, tüm alet ve ekipmanlar fare ötenazi önce hazır olmalıdır.
- CO 2 boğulma veya servikal dislokasyon ile fare Euthanize.
Bu adım, tüm işlemler steril diseksiyon ekipmanları ile steril bir ortamda (mikrobiyolojik güvenlik kabini, seviye II) altında yapılması gerekir.
- Fare düzeltmek ve% 70 etanol ile fare karın sprey. Herhangi bir diseksiyon makas ve forseps ile, genital bölgede bir V şeklinde kesi yapmak ve tamamen karın boşluğuna açmak için diyafram o kadar devam ediyor.
- Diyafram karşı karaciğer lobları yerleştirin; vücut boşluğuna yeterince açık ise orada kalmalıdır. Sol için karın boşluğu dışında bağırsak ve kolon çekin ve rektum bulmak. Kavisli bir forseps ve diseksiyon makas, kapmak ve bölüm rektum bir çift.
- Forseps aynı çifti ile, dikkatli bir şekilde sol tarafta bağırsak çekerek mide rektum tamamen bağırsak göz önüne sermek.
- Dikkatle bağırsak boyunca pankreas kesme ve sindirim sistemi geri kalanından dalak ile kurtarmak, Noyes makas ve forseps bir çift kullanarak.
- Dalak ve bu bölümü (Şekil 2) bağlı olan pankreas al.
Bu aşamada, hiçbir mezenterik yağ dokusu ve / veya diğer komşu doku (dalak, bağırsak, vb) hücresel kirlenmesini önlemek için, pankreas ile toplanmış olabilir emin olun.
Prosedürün geri kalanı için, her bir tampon acinar hücreleri içinde, ekzokrin pankreas dokusunun tam ayrılma önlemek için kalsiyum iyonu kenetleyiciler Ca2 + olmadan hazırlanmış olmalıdır.
- Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde iki kez 1x pankreas durulayın.
Bu adımda, gibi yağ dokusu batar pankreas aykırı, hala pankreas bağlı kirletici beyaz yağ dokusu görselleştirmek ve hızlı bir şekilde kaldırmak için kolayca mümkündür yüzer.
Pankreas hücre kültürü tesisine taşınması gerekiyorsa, bu HBSS 1x buz üzerinde tutulmalıdır.
- HBSS 1x 5 ml içeren steril Petri kabındaki pankreas aktarın. Noyes makas ve bir neşter kullanılarak, 1-3 mm 3 (Şekil 3A), küçük parçalar halinde pankreas dilim.
2. Pankreas enzimatik ve mekanik ayrışmalar (Gün 0)
- , Steril bir 50 ml polipropilen tüpe aktarın.
- 450 x g ve 4 de 2 dakika süre ile santrifüje ° C Aspire ve hücre parçaları ve kan hücreleri çıkarmak için supernatant atın.
- Kollajenaz IA 10 ml çözelti (HBSS 1x 10 mM HEPES collagena 200 U / ml ihtiva eden eklemepankreas bölümleri SE, IA ve 0.25 mg / ml tripsin inhibitörü). 25 ml serolojik pipet kullanarak, bir 25 cm 2 balon aktarabilirsiniz. 37 20-30 dakika için inkübe ° C Bu süre (her 5 dk) sırasında, azalan büyüklükte steril pipetler (25, 10, ve 5 ml serolojik pipet) içinde, enerjik on kere geri ve ileri-pankreas parçaları hareket ettirerek mekanik bir ayrışma gerçekleştirin.
Bu aşamada, bu sık sık pankreas bölümlerinin enzimatik ayrılma derecesini izlemek için gereklidir.
- Pankreatik doku de-ayrışmış gibi durduğu zaman (pankreas parçalarının ortadan kalkması ve solüsyonun yüksek bulanıklık göre) (Şekil 3B), soğuk 10 ml eklenerek enzimatik reaksiyonu durdurmak (HBSS 1x 5 ihtiva eden yıkama çözeltisi tamponlu % fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mM HEPES).
- , Steril bir 50 ml polipropilen boru ve centr içine aktarın450 x g'de 2 dakika ve 4 ° C ve ifuge Dikkatlice aspire ve kollajenaz IA çözüm kaldırmak için süpernatant atın.
- Yeniden süspanse edin ve tamponlu yıkama solüsyonu 10 ml ile pelet yıkayın. 450 x g ve 4 3 dakika boyunca santrifüj ° C Dikkatlice aspire ve supernatant atın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
3. Filtrasyon ve tohumlama (Gün 0) acini Dağınık
- % 2.5 FBS içeren Waymouth orta 7 ml hücre pelletini,% 1 Penisilin-Streptomisin karışımı (PS), 0.25 mg / tripsin inhibitörü, ve 25 ng / yeniden birleştirici insan epidermal büyüme faktörü (EGF) ml ml.
- Bu non-sindirilmiş parçaların (kanalları, kan damarları ve Langerhans adacıkları) korumak için bir filtre 100 mikron geçmesine izin süzüntü hücre karışımı. Pankreas asiner yapılar (10-15 hücre acinus) geçer.
- Waymouth orta FBS ihtiva eden, PS, tripsin inh 6 mL 'si ile yıkayınız filtreibitor, ve EGF.
Bu aşamadan sonra, hücreler, herhangi bir asinüs ayrışma önlemek için, çok dikkatli bir şekilde tedavi edilmesi gerekir.
- Tohum, 6-çukurlu kültür kaplarına izole asinüs (oyuk başına 2 ml) (Şekil 3C). ° C altında% 5 (v / v) CO2 atmosfer 37 Kültür bunları.
Bu aşamadan sonra, asiner hücreler süspansiyonda kültürlendi.
4. Asiner Hücre Kültürü (Gün 1 ile 10)
- Yirmi dört saat sonra, kirletici hücreleri ve (Şekil 4) gece yapıştırılır var hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için, yeni bir 6-iyi bir kültür çanak içine (süspansiyon) acini aktarın.
Hücre kültürü birkaç gün ya da deneysel koşullar hücreleri tek tabaka yetiştirilen gerektiriyorsa, bu matris iskele üzerinde transferi ve tohum acini tavsiye edilir uzatılabilir gerekiyorsa.
- Görmeden günmatris destek ding (Gün 0), ceket tipi bir 6-iyi bir kültür çanak I kollajen (5 mg / cm 2). (0.02 M asetik asit içinde 50 ug / ml, 0.2 mikron filtre) her kuyuya tip I kolajen çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de (ya da gece boyunca 4 de, 1 saat boyunca, plastik üzerinde pasif olarak adsorbe izin ° C .)
- Tip I kolajen çözeltisi aspire edin ve fosfat-tamponlu tuzlu su ile 1x iki kat daha iyi kaplanmış yıkayın.
- Kullanmadan önce (bir mikrobiyolojik güvenlik kabini altında) en az 12 saat kuruması için de kaplı izin verin.
- Türü daha önce tarif edilenle aynı koşullarda I kollajen kaplı 6 oyuklu kültür çanağı ve bunların kültür (37 ° C de% 5 altında (v / v) CO2 atmosferi) içine izole edilmiş primer asinüs (Basamak 4.1 'de elde edilmiş) transferi . Hücreler, 2 gün boyunca, tip I kollajen alt tabakaya yapışır.
- Gün 3, uymadığımızı cansız hücreleri ortadan kaldırmak için kültür ortamı değiştirin. Kültür Zamanla, hücreleri giderek sp olacakkollajen ihtiva eden destek üzerinde okuyun. Kültür ortamı her 3 günde bir (Şekil 5) değiştirin.
Elde edilen izole asiner hücreler Thoma hücre sayımı odası kullanarak tam bir mekanik ayrılma sonra, sayılabilir. Izole asiner hücreler daha sonra kültüründe muhafaza edilemez unutmayın.
Elde edilen asiner kültür kalitesi gibi Tripsinojen, Pankreas Transkripsiyon Faktör 1 alt birimi Alpha veya karboksipeptidaz A1 (immünsitokimya veya immünofloresan deneyleri ile) olarak asiner spesifik belirteçler ifade kontrol ederek kontrol edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 birincil asiner hücrelerin izolasyonu için "dağınık" acini yöntemi şematize etmektedir. Kesinlikle protokolü esnasında yerine getirilmesi gereken kritik adımlar, tartışma kısmında tarif edilmiştir.
Onun çıkarılmasını kolaylaştırmak için, pankreas ekli dalak (Şekil 2) ile birlikte karın tahsil edilmesi gerekir. Her iki ayrı organ kesmek gerekir ve yine de pankreas bağlı olabilir kalıntı yağ dokusu (Basamak 1.6) çıkarılmalıdır.
Makro ve Şekil 3 'de gösterilmiştir mikroskopik resimleri, pankreas, enzimatik ve mekanik ayrışmalarda her kademeden sonra sonucu temsil eder. Dilimleme sonra, pankreas küçük parçalar (aşama 1.8 Şekil 3A) ayrılmıştır. Şekil 3B, dikkatli bir tempor dayanarak başarılı bir enzimatik ayrılma sonrasında pankreas yönü gösteriron-gidiş sindirim al izleme (Adım 2.4). Bu adım gerekli olan tam zamanı belirlemek için çok önemli bir adımdır. Şekil 3C, pankreas karışımı (Basamak 3.4) filtre edildikten sonra elde edilen malzeme gösterir. Sadece iyi ayrılmış asinüs bu aşamadan sonra tutulur.
Şekil 4 acini bizim protokolü kullanılarak izole pankreas bir tipik Gün 1 örneğidir. Yeni bir kültür kabı içine asiner hücre transferi hücre fragmanları ve yapışan kirletici hücreleri (Basamak 4.1) ortadan kaldırmak için izin verir.
Olarak tip I kollajen kültüre Şekil 5, gösterilen, asiner hücreler iğ şekilli hücreler (Adım 4.6) bir tek tabaka sebebiyet veren, onların asiner farklılaşma (morfoloji ve 3D organizasyon) yayıldı ve kaybedersiniz.
Şekil 1. Fare primer izolasyonu sağlayan protokol şematik acini dağınık.
Şekil 2. Diseksiyonu sonrası pankreas brüt anatomi. Kırmızı ve sarı oklar sırasıyla pankreas toplanması için kesmek gerekir dalak ve mezenterik yağ dokusu ile kalan anatomik bağlantıları gösterir.
Şekil 3,. Makroskopik gözlem (sol panel) ve faz-kontrast mikroskobu (sağ panel, 40X büyütme) ile görünür acini izolasyon (Gün 0) dağıldı. Dilaceration Sonrası) (25 cm 2 balon gösterildiği gibi). B) kollajenaz IA sindirim ve güçlü sonra mekanik dissociati. C) 6-kuyu kültür çanak filtrasyon ve transfer sonra.
Şekil 4. Faz-kontrast mikroskobu (40X büyütme) ile görünür acini kültür, tohumlama sonra 24 saat (Gün 1), Dağınık.
Şekil 5,. Ben kollajen kaplı gün 2, 4 tabak, ve faz-kontrast mikroskobu (40X 120X ve 240X büyütme) ile görünür 7 bir türüne acini kültür Dağınık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, pankreas asiner hücreleri izole etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu yöntem, en az 1 saat, hayvan başına en fazla 20 x 10 6 asiner hücreleri izole etmek mümkün kılar. Hızlı ve basit bir uygulama (10 gibi pankreaslarında bağımsız paralel Deneme başına işlenebilir) sayesinde, bu protokol mevcut izolasyon yöntemleri 3-5,9-12,17 arasında iyi bir uzlaşma olarak görünür.
Kritik adımları / Sorun Giderme
Bu yöntemin etkinliği birkaç kritik noktalarda alınan önlemler dayanır. Pankreas dilaceration ilk adımı (adım 1.8) daha sonra pankreas enzimatik sindirimi için gereklidir. Kesilmesinde yetersiz enzimatik ayrılma ile elde asiner hücrelerin sayısının verim düşecektir. Bu kaçınılmaz asiner hücreler ve ardışık aşırı ayrışma neden kollajenaz IA ile kuluçka uzatmak için gerekli kılartif hücre ölümü artmaktadır.
Yukarıda uyardı gibi, ikinci kritik adım kollajenaz IA (Adım 2.3) ile sindirim olduğunu. Çok fazla enzimatik ayrılma hücre ölümü olup, yüksek bir oranına yol açmaktadır. Pankreas sindirim ölçüde sık sık bu kritik adım (Şekil 3B) sırasında izlenmesi gerekir. Mekanik ve enzimatik dağılımlarını sonra, özel ilgi çok yavaşça onların arası yapıları korumak için dağınık acini ele için ödenmesi gerekmektedir.
Sınırlamalar
Waymouth kültürüne epidermal büyüme faktörü (EGF) ve buna ek olarak ilerleyen asiner-to-duktal transdiferansiasyon çökelebilir bile, bu hücrelerin hayatta korumak için gereklidir.
Gibi protokol açıklanan ve gerekirse, asiner hücrelerin in vitro kültür dönemi matris Scaff sayfasındaki hücreleri ekim ile 10 gün kadar uzatılabilirBöyle Ben kollajen yazarken yaş. Ancak önemlisi, ve diğerleri 1, tip I kollajen üzerinde kültür hücreleri tarafından gösterilen duktal hücrelere asiner hücrelerin ilerici transdiferansiasyon neden olacaktır. Bu süreç kollajen kültürün 4 gün sonra başlar ve 7 gün sonra tam olabilir. Bu nedenle, asiner hücre kültürü 1 hafta kadar uzatılabilir gerekiyorsa bu Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü veya Sitokeratin-19 (immünsitokimya veya immünofloresan deneyleri ile) gibi belirli bir duktal işaret olup olmadığını kontrol etmek için gerekli olabilir. Dağılmış asinüs arasında yapışma azaltarak bir matris iskele olarak Matrigel alternatif kullanımı, bu mümkün 2 gün boyunca kendi asiner fenotip bakım genişletilmesini mümkün kılar.
Muhtemel değişiklikler
Diseksiyonu adımı sırasında rektum kesit bakteriyel kontaminasyon riskini artırır. Biz böyle bir yerinde yaşamamıştirme. Bununla birlikte gerekirse, bu mümkün sorunu aşmak için başka bir uygulama bulunmamaktadır. Mide, dalak ve duodenum ilk bölümü bulma ve ekli pankreas kesit oluşur. Bu alternatif prosedür mükemmel hakim gerektiğini unutmayın. Aksi takdirde, diseksiyon süresi daha sonra kaldırılan biyolojik malzemenin kalitesi tehlikeye, daha uzamış olur.
Asiner hücrelerin uzun süreli tek tabakalı kültürü, özellikle destek matrisi değiştirerek, optimize edilebilir. Deneysel koşullar gerektirdiği takdirde, I kollajen gibi Matrigel gibi başka bir iskele ile değiştirilebilir yazın. Bu durumda, taze Matrigel-Fosfat Tamponlu soğuk 400 ug / ml konsantrasyonunda hazırlandı Salin 1x gerekir. Bundan sonra, kuyular 4 ° C de gece boyunca Matrigel (40 ug / cm 2) ile birlikte inkübe edilir Bu nokta kesinlikle saygı gösterilmelidir. Aşama 4'te tarif edildiği gibi kültür prosedürü aynı kalır.
Gibi bir yöntem caN fazla deneysel optimize edilebilir. Örneğin, ekzokrin pankreas hücreleri, kültür ortamı içindeki amino asit miktarı, bu hücreler 18 protein sentezini düzenleyen olabilir. Sphyris ve ark. 2 ve BLAUER ve ark. 19 farklı durumda asiner hücreler korunmasını teşvik için, amino asit, daha yüksek bir miktarda (gerekli ve zorunlu olmayan) içeren tam kültür ortamı hazırladık. Bu tür bir ortam, çok yararlı olabilir ise birden fazla 10 gün boyunca bu yöntem ile izole edilen hücreler kültür asiner istemektedir.
Uzun vadeli bir kültür gerekli ise, modifiye edilebilir diğer bir parametre, kültür ortamının pH değeri. Fizyolojik olarak, asiner hücrelerinin apikal kutup pankreas suyu sebebiyet veren bir bikarbonat bakımından zengin, hafif alkali sıvı ile sürekli temas halindedir. Bu asiner hücre ortamın pH asiner differentiatio korunmasında önemli olabileceğini spekülasyon için cazipn devlet. Bazı protokoller önce asiner hücreler 19 "başlangıç" fizyolojisi taklit etmek için 7.8 'e ayarlanmış bir pH değerine sahip bir kültür ortamı kullanımını bildirmiştir.
Tekniğin önemi
Bu pankreas eksplantlarında ve organotipik kültürlerin 19 kullanarak, kültür asiner hücreler için başka protokoller var var olduğunu belirtmek önemlidir. Bu kültüre edildiği membrana eksplant, pankreatik hücre göçü göre, uygulama, daha zordur. Bu pankreas hücrelerinin izolasyonu özellikle pankreas eksplant kültürünü bir birinci hafta gerektirir. Bu yöntemin en önemli avantajı, enzimatik ayrılma hücre zar bütünlüğü ve hücre-hücre etkileşimleri de korunur, böylece gerekli olmasıdır. Bu koşullar altında, hücrelerin asiner 14 güne kadar in vitro olarak muhafaza edilebilir. Yine de elde edilen hücre kültürü asiner saf değildir ve kirletici fibroblastlar, duktal Carşın ve endotelial hücreler deney bazı çeşitleri ile uyumlu olabilir ki, kaçınılmaz olarak mevcut bulunmaktadır. Buna karşılık, bizim prosedürü hızla asiner hücre, asini korunması onların ilk mimari saf bir nüfus verir.
Dorrell ve ark. Floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) 17 kullanılarak, farklı fare pankreatik hücre tipleri (asinar, kanal, ve endokrin hücreleri de dahil olmak üzere) izole etmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, asiner hücreler saf (veya spesifik) nüfusu elde etmek için çok etkilidir. Bununla birlikte, önceki ayırma, spesifik antikorlar ile bir floresan etiketleme gerektirir. Ayrıca, bu işlem aynı zamanda FACS ve bir akış sitometresinin bir uzmanlık gerektirir. Bunun yanı sıra, bu teknik asinüs onların ilk mimari kaybı nedeniyle asiner hücrelerin uzatılmış kültür izin vermez. Bizim hızlı bir yöntem, bir kalite ve saflıkta dağınık asiner hücrelerinin in vitro kültürü uzun bir sağlayan birdaha da rutin pek çok uygulamaları ile uyumlu yeniden.
Gelecekteki uygulamalar
Bir kez hakim, / kültür asiner hücreleri izole etmek için bu tekniği çok sorular bir dizi ele yararlı ve özellikle iyi bilinen ama tam olarak anlaşılamamıştır pankreas plastisite ve transdiferansiasyon dahil mekanizmaları, soruşturma için ispatlamak zorundadır. Bazı arası ve hücre içi iletişim koruyarak, bu acini modeli daha fizyolojik ilgili ölümsüzleştirdi hücre hatları daha kalır dağınık.
Pankreas tümörogenez alanında, bu birincil hücre modeli asiner hücre transdiferansiasyon, agresif pankreas kanserleri oluşturmak için önerilen mekanizmalardan biri eğitim için yeterli bir sistemi sağlar. Ölümsüzleştirdi insan ya da fare hücre hatları (örneğin Colo357 gibi, Panc-1, veya BxPC3), kökenlerine ve comp hem birincil asiner hücrelere daha kullanmak daha esnek olabilir ancaklex genetik durumu (olarak dönüştürülmüş hücre hatları başlangıçta pankreas tümörleri ya da pankreas metastaz izole) gibi mekanizmalar eğitim büyük sakıncaları oluşturmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz hayvan bakımı ile teknik yardım için AniCan personeli (CrCl, Lyon) teşekkür ederim. Bu çalışma Derneği pour la Recherche sur le Kanser tarafından, Institut National du Kanser tarafından ve burs tarafından Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Programı), Ligue Nationale Contre le Kanser, tarafından desteklenmiştir Fransa'nın Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche gelen Institut National du Kanser (JG), (RMP ve DFV) gelen ve Derneği pour la Recherche sur le Kanser Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
